泽兰提取物改善了脱氢表雄酮（DHEA）诱导的多囊卵巢综合征大鼠的内分泌和代谢表型。整合16S rRNA测序和血清代谢组学分析显示，肠道微生物α多样性部分恢复，微生物组成发生改变，且涉及类固醇激素、胆汁酸和短链脂肪酸的代谢物发生变化。
本文内容
摘要
摘要
本研究探讨了泽兰提取物对多囊卵巢综合征（PCOS）的治疗作用，并评估其与肠道菌群-代谢组重塑的关联。将24只雌性Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、脱氢表雄酮（DHEA）诱导的PCOS模型组和泽兰治疗组（每组n = 8）。经过28天干预后，采用ELISA法测定血清激素水平；通过16S rRNA基因测序分析肠道菌群组成，并利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）表征血清代谢谱。采用Spearman相关性分析结合多重检验校正，探索菌群与代谢物之间的关联。与模型组相比，泽兰显著改善了PCOS相关表型，降低体重、睾酮水平（0.92 vs. 1.85 ng/mL，P < 0.05）、LH/FSH比值及胰岛素水平。测序结果显示，泽兰部分恢复了微生物α多样性（Shannon指数：5.79 vs. 4.19），并降低了厚壁菌门与拟杆菌门的比例。泽兰处理与乳杆菌属（Lactobacillus）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）的富集相关，而拟杆菌属（Bacteroides）、普雷沃菌属（Prevotella）和埃希氏菌属（Escherichia）的丰度则降低。代谢组学共鉴定出52种差异代谢物特征，关键变化涉及类固醇激素、胆汁酸（如石胆酸）以及短链脂肪酸（如丁酸）。这些结果表明，泽兰可改善PCOS相关的内分泌和代谢紊乱，并与肠道微生物群和血清代谢谱的重塑相关。
引言
多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄女性中最常见的内分泌疾病之一，其全球患病率估计在6%至20%之间，具体数值取决于所采用的诊断标准1。这种复杂的代谢性和生殖系统疾病具有一系列临床表现，包括高雄激素血症、排卵功能障碍以及多囊卵巢形态，这些共同导致显著的生殖、代谢和心理影响2。除了对生育能力的直接影响外，PCOS 越来越多地被视为一种全身性疾病，与多种长期健康并发症相关，包括2型糖尿病、心血管疾病和子宫内膜癌，从而给患者个体及全球医疗系统带来沉重负担3。PCOS 的发病机制尚未完全阐明，但普遍认为其涉及遗传易感性、环境因素和生活方式决定因素之间的复杂相互作用，最终导致患者出现典型的激素和代谢紊乱4。
目前多囊卵巢综合征（PCOS）的治疗策略主要通过药物干预进行对症治疗，包括使用口服避孕药调节月经周期、二甲双胍改善胰岛素敏感性，以及抗雄激素药物控制多毛症5。然而，这些常规治疗方法往往无法完全缓解症状，且常伴随不良反应，限制了其长期应用，尤其是在有生育需求的女性中6。因此，人们日益关注补充与替代医学方法，特别是传统中医（TCM），其在通过整体调节机制治疗妇科疾病方面已积累了数百年的实践经验7。在众多用于PCOS管理的植物药中，Lycopus lucidus Turcz.（中医常称为泽兰）因其在促进血液循环、消解瘀滞和调节月经方面的传统应用而受到广泛关注8。已发表的植物化学研究表明，L. lucidus 含有多酚和富含黄酮类的组分，具有抗氧化和抗炎活性8,9。因此，本研究采用标准化的总黄酮含量作为提取物的化学质量控制指标，尽管未来仍需通过靶向植物化学分析来鉴定具体负责肠道菌群和代谢调节的活性单体成分。
肠道微生物群已被确认为宿主代谢和内分泌功能的关键调节因子，越来越多的证据支持其参与包括多囊卵巢综合征（PCOS）在内的多种代谢性疾病的发病机制10。已有研究提出“肠-卵巢轴”的概念，用以描述肠道微生物与卵巢功能之间通过微生物代谢产物、免疫信号及神经内分泌通路介导的双向交流11。研究表明，PCOS女性 consistently 存在肠道菌群失调，其特征表现为微生物多样性降低、厚壁菌门与拟杆菌门比例异常，以及乳杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）等有益菌丰度减少12。这些微生物的紊乱被认为通过多种机制参与PCOS的病理生理过程，包括肠屏障通透性增加、全身性低度炎症，以及胆汁酸和短链脂肪酸（SCFA）代谢的改变，进而影响胰岛素敏感性和雄激素的生物合成13。重要的是，针对肠道微生物群的干预措施，如益生菌、益生元和饮食调整，在改善PCOS症状方面已显示出良好效果，进一步支持将肠-卵巢轴作为PCOS治疗的重要靶点14。
代谢组学是对生物系统中小分子代谢物进行全面分析的方法，为表征与疾病状态相关的代谢紊乱以及评估治疗干预的生化效应提供了强有力的手段15。将用于微生物组分析的16S rRNA基因测序与非靶向代谢组学相结合，可系统性地研究肠道微生物群落与宿主代谢之间的关系，有助于揭示在疾病发生发展及治疗反应过程中可能伴随的菌群-代谢组相互作用。尽管从理论上讲，靶向肠-卵巢轴是多囊卵巢综合征（PCOS）管理的合理策略，且泽兰（ZeLan）在传统医学中具有治疗妇科疾病的适应证，但迄今为止尚无研究系统探讨泽兰提取物是否能够调节PCOS中的肠道菌群-代谢组界面。这一知识空白限制了我们对泽兰相关生物学响应的理解，也阻碍了该植物制剂在PCOS治疗中的合理优化。
本研究旨在探讨泽兰提取物在脱氢表雄酮（DHEA）诱导的多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠模型中的治疗效果，并通过整合16S rRNA测序和非靶向代谢组学分析，评估其相关的肠道微生物群-代谢组变化。具体而言，我们评估了泽兰提取物对PCOS相关表型的影响，包括体重、血清睾酮水平、黄体生成素与卵泡刺激素（LH/FSH）比值及胰岛素水平；分析了泽兰干预后肠道微生物群组成及α多样性的改变；鉴定了与泽兰干预相关的差异性血清代谢物特征及富集的代谢通路；并探索了特定肠道微生物分类群与关键代谢物之间的相关性。通过实现上述目标，我们力图为泽兰在PCOS中对肠-卵巢轴的调节作用提供多组学关联证据。
方案
本研究中的所有实验操作均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》的规定，并经机构动物护理与使用委员会批准（批准号：IACUC-2023-0156）。
动物
雌性Sprague-Dawley大鼠（n = 24，6周龄，体重180–200 g）购自所属机构的实验动物中心，在受控环境条件下饲养（温度22 ± 2°C，湿度50 ± 10%，12小时光照/黑暗循环），可自由摄取标准啮齿类动物饲料和纯化水。经过一周的适应期后，将动物随机分为三个实验组（每组n = 8）：对照组、PCOS模型组和ZeLan治疗组。样本量基于既往研究中对PCOS模型肠道微生物群变化的分析确定，功效分析表明，在α = 0.05水平下，每组8只动物可提供80%的统计功效以检测α多样性指数1.5倍的差异。
多囊卵巢综合征模型建立与治疗方案
采用经充分验证的方案建立多囊卵巢综合征（PCOS）模型，即每日在背部颈部皮下注射溶解于芝麻油中的脱氢表雄酮（DHEA；Sigma-Aldrich，USA），剂量为6 mg/100 g体重，连续给药21天。对照组动物给予等体积的芝麻油溶剂。完整实验周期包括7天适应期、21天造模期和28天干预期，终点样本采集时间为第56天（含适应期）（图1）。ZeLan提取物由经鉴定的泽兰（Lycopus lucidus Turcz.）药材经水提法制备，并通过高效液相色谱法标定其总黄酮含量不低于2.5%，作为该植物提取物的化学质量控制标准。在DHEA诱导的模型建立完成后，ZeLan组大鼠每日接受200 mg/kg体重剂量的ZeLan提取物灌胃，连续28天；对照组和模型组则给予等体积蒸馏水。选择200 mg/kg剂量是基于既往植物提取物在动物实验中的使用经验及初步耐受性考虑而设定的探索性药理剂量；本研究设计未包含正式的剂量-效应评估。在整个实验期间每周记录体重。在本实验设计中，PCOS模型是否成功建立是依据DHEA诱导方案结合终点时的内分泌与代谢表型进行评估，包括体重、血清睾酮水平、黄体生成素/卵泡刺激素（LH/FSH）比值以及空腹胰岛素水平。卵巢组织病理学检查、卵泡计数、黄体定量及连续动情周期监测未被纳入模型确认的终点指标，因此对卵巢功能障碍的判断基于内分泌和代谢指标，而非直接的组织水平评估。
样品采集与处理
从所有三组（每组 n = 8）采集样本（血清和粪便），用于后续的生化、菌群和代谢组学分析。终点样本在隔夜禁食后的早晨采集，以减少昼夜节律和进食相关变异。在麻醉条件下从腹主动脉采集血液样本，并在 4°C 下以 3,000 × g 离心 15 分钟获得血清，分装后储存于 -80°C，直至进行激素和代谢组学分析。新鲜粪便样本在无菌条件下直接从盲肠采集至无菌冻存管中，转移期间置于干冰上，采集后 10 分钟内用液氮速冻，并储存于 -80°C，直至进行 16S rRNA 基因测序。
血清激素检测
采用市售的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Cusabio Biotech，中国武汉）按照制造商说明书检测血清中睾酮、黄体生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）和胰岛素的浓度。将LH/FSH比值计算为反映PCOS特征性促性腺激素失衡的综合指标。所有样本均进行双份检测，双份测定变异系数大于15%的结果予以重复检测。要求批内和批间变异系数分别低于10%和15%。根据原始记录和检测性能信息对潜在离群值进行筛查，任何数值均不得仅基于统计学原因而被剔除，除非有明确的技术问题记录。
16S rRNA基因测序与生物信息学分析
使用QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen，德国）按照制造商提供的方案从盲肠内容物中提取总细菌基因组DNA。采用NanoDrop分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量和浓度，DNA提取物在构建文库前于-80°C保存。使用带有Illumina接头序列的通用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）扩增16S rRNA基因的V3-V4高变区。构建扩增子文库后进行纯化、定量，等摩尔混合，并在Illumina NovaSeq 6000平台（诺禾致源，中国北京）上使用双端250 bp读长进行测序。
使用 QIIME2（版本 2022.2）流程对原始测序读长进行处理。双端测序读长经过解复用、合并，并以 Phred 质量分数阈值不低于 20 的标准进行质量过滤，随后使用 DADA2 去除嵌合序列并生成扩增子序列变体（ASV）。采用朴素贝叶斯分类器，基于 SILVA 138 参考数据库进行分类学注释。计算包括香农指数、辛普森指数和 Chao1 估计值在内的 α 多样性指标，以评估样本内的多样性与丰富度。测序深度相关输出结果，包括读长统计摘要、ASV 丰度表、Good's 覆盖率及稀疏化曲线文件，均作为数据可用性部分所述微生物组数据集的组成部分。采用线性判别分析效应大小（LEfSe）方法，在对照组与模型组比较中识别与疾病相关的分类群，设定 LDA 得分阈值大于 2.0 且 P < 0.05；泽兰相关逆转效应通过比较泽兰组相对于模型组的分类群丰度变化方向进行评估。
非靶向代谢组学分析
采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法（UHPLC-Q-TOF-MS；Agilent 1290 Infinity II/6550，USA）进行血清代谢组学分析。取血清样品（100 μL）加入400 μL含内标的预冷甲醇：乙腈（1:1，v/v）溶液，涡旋混匀后于-20°C孵育1小时以沉淀蛋白质。随后在14,000 × g条件下离心15分钟，取上清液在氮气流下吹干，并用100 μL乙腈：水（1:1，v/v）复溶后用于分析。色谱分离在ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 × 100 mm，1.8 μm）上完成，柱温维持在40°C，流动相A为含0.1%甲酸的水，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈，流速为0.30 mL/min。采用梯度洗脱程序，有机相从5%升至95%，随后进行色谱柱清洗和重新平衡，以实现代谢物的分离。质谱数据在正离子和负离子电喷雾电离模式下采集，扫描范围为m/z 50–1200；源参数包括毛细管电压3.5 kV、干燥气流速10 L/min、干燥气温度325°C、雾化器压力35 psi以及碎裂电压120 V。
原始数据文件被转换为 mzXML 格式，并使用 R 中的 XCMS 软件包进行峰检测、保留时间对齐和峰面积积分。通过将所有血清提取物等量混合制备质量控制样本，并将其插入整个分析序列中，以监测仪器稳定性。在统计建模前，去除缺失值过多或质量控制重复性不稳定的特征。代谢物鉴定通过将精确质量、保留时间及串联质谱（MS/MS）碎裂模式与人类代谢组数据库（HMDB）、METLIN 以及内部谱图库进行比对完成。多变量统计分析使用 MetaboAnalyst 5.0 进行。用于下游报告的代谢物特征根据多变量判别贡献度、变化倍数方向及统计证据的综合标准进行优先排序；P 值采用 Benjamini-Hochberg 方法进行多重检验校正。包含 52 个代谢物特征的完整注释报告表格作为 补充表 1 提供。通路富集分析使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行。
统计学分析
所有统计分析均使用 SPSS 26.0 版（IBM Corporation, Armonk, NY, USA）和 R 软件（4.2.1 版）进行。连续性数据以均值 ± 标准差（SD）表示，并在推论性检验前采用 Shapiro-Wilk 检验评估正态性。对于符合正态分布的数据，采用单因素方差分析（ANOVA）并结合 Tukey 事后检验进行多组间比较；对于非正态分布的数据，则采用 Kruskal-Wallis 检验结合 Dunn 事后检验。肠道微生物分类群与血清代谢物之间的相关性通过 Spearman 秩相关系数进行评估，并以层次聚类热图形式可视化。相关性 P 值采用 Benjamini-Hochberg 错误发现率法对多重检验进行校正，仅解释方向一致且具有统计学显著性的相关性。双侧 P 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性，除非另有指定校正后的 P 值阈值。
结果
泽兰提取物对多囊卵巢综合征临床表型的影响
给予DHEA可诱导大鼠出现类似多囊卵巢综合征（PCOS）的内分泌与代谢表型，表现为与对照组相比，体重、血清睾酮浓度、黄体生成素/卵泡刺激素（LH/FSH）比值及空腹胰岛素水平均显著升高（均P < 0.05）。采用Shapiro-Wilk检验进行分布评估，支持对表1中总结的主要体重和激素终点指标进行参数化分析。给予ZeLan提取物治疗28天后，这些代谢和激素紊乱得到显著改善。体重记录于实验第56天（包含7天适应期）治疗结束时。如表1所示，模型组大鼠体重（291.12 ± 15.35 g）显著高于对照组（227.45 ± 10.12 g，P < 0.05），而ZeLan治疗显著将体重降低至245.25 ± 10.21 g（与模型组相比，P < 0.05）。PCOS模型大鼠血清睾酮水平（1.85 ± 0.21 ng/mL）较对照组（0.51 ± 0.05 ng/mL）明显升高，而ZeLan干预使睾酮水平降至0.92 ± 0.12 ng/mL。模型组LH/FSH比值（3.28 ± 0.25）较对照组（1.25 ± 0.11）显著升高，经ZeLan治疗后部分恢复正常（1.85 ± 0.15）。模型动物空腹胰岛素水平升高（28.95 ± 2.35 mIU/L，对照组为12.55 ± 1.12 mIU/L），给予ZeLan后显著降低至18.82 ± 1.55 mIU/L（图2）。上述结果证实成功建立了具有内分泌-代谢特征的PCOS样表型；然而，本研究未进行卵巢组织病理学检查、卵泡计数、黄体分析及动情周期监测。
ZeLan 提取物恢复了肠道微生物群的α多样性
α多样性指数分析显示，多囊卵巢综合征（PCOS）及其治疗过程与肠道微生物群落结构的显著改变相关。如表2和图3所示，PCOS模型大鼠的Shannon多样性指数（4.19 ± 0.35）显著低于健康对照组（6.51 ± 0.28；P < 0.05），表明疾病状态下微生物α多样性降低。泽兰（ZeLan）治疗部分恢复了微生物多样性，Shannon指数回升至5.79 ± 0.26（与模型组相比，P < 0.05）。Simpson指数也呈现一致结果：对照组为0.98 ± 0.01，模型动物降至0.82 ± 0.03，经泽兰干预后恢复至0.93 ± 0.02。反映物种丰富度的Chao1估计值也表现出相似趋势：PCOS诱导使Chao1值从1215.3 ± 45.4显著下降至665.8 ± 52.1，而泽兰治疗使丰富度回升至963.5 ± 38.6。综合这些结果表明，PCOS与肠道微生物失调相关，其特征为α多样性和物种丰富度降低，而泽兰提取物可部分恢复微生物群落结构，使其趋于对照组水平。
肠道微生物群组成的变化
门水平的分类谱分析揭示了各实验组之间显著的组成差异。如图4所示，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）在所有组别中均占主导地位，合计占整个细菌群落的85%以上。与对照组（厚壁菌门约40%，拟杆菌门约45%）相比，模型组表现出显著升高的厚壁菌门丰度（约75%）以及降低的拟杆菌门比例（约15%），导致厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）比值明显升高，呈现出代谢失调的特征。泽兰（ZeLan）处理可调节这一失衡状态，使厚壁菌门丰度降至约52%，同时将拟杆菌门提升至约35%，从而使F/B比值部分恢复至接近对照组水平。
采用LEfSe分析来鉴定区分对照组与模型组的细菌分类群，从而定义与疾病相关的微生物特征。如图5所示，在属水平上，PCOS模型组中拟杆菌属（Bacteroides，LDA得分 > 3.5）、普雷沃菌属（Prevotella，LDA得分 > 3.0）和埃希菌属（Escherichia，LDA得分 > 2.5）的丰度显著升高，这些菌属通常既往被认为与代谢功能障碍和炎症相关。相反，对照组则富集了多种有益菌属，包括乳杆菌属（Lactobacillus，LDA得分 > 3.0）和瘤胃球菌属（Ruminococcus，LDA得分 > 2.5），二者均因其在维持肠道屏障完整性及产生短链脂肪酸等有益代谢物方面的作用而被广泛认可。泽兰组在图5中未作为独立的LEfSe分类显示，因为该分析重点在于识别区分疾病状态与健康状态的菌群特征；泽兰相关效应则通过菌群丰度向对照组特征的转变趋势以及微生物组-代谢组相关性进行解读。
代谢组学分析与差异代谢物鉴定
非靶向代谢组学分析发现了与多囊卵巢综合征（PCOS）及其泽兰提取物治疗相关的显著代谢紊乱。图6中的火山图展示了模型组与对照组之间代谢物特征的分布情况，以上调和下调的特征分别根据变化倍数方向和统计学显著性进行标注。在模型组与对照组比较的完整代谢组学报告表中，共保留了52个已注释的代谢物特征。完整的列表（包括代谢物名称、HMDB编号、生化类别、log2变化倍数、P值及调控方向）作为补充表1提供。表3列出了与PCOS具有较高生物学相关性的代表性已注释代谢物。
表3总结了具有高VIP值且在生物学上与多囊卵巢综合征（PCOS）病理生理机制相关的关键差异性代谢物。在PCOS模型动物中，类固醇激素显著升高，包括睾酮（VIP = 2.56，P < 0.001）和雄烯二酮（VIP = 2.34，P < 0.001），这与该疾病特征性的高雄激素状态一致。脂肪酸代谢也发生紊乱，棕榈酸（VIP = 2.12）和花生四烯酸（VIP = 1.89）显著增加，而促炎性脂质介质前列腺素E2同样上调（VIP = 2.05）。相反，PCOS动物体内与有益肠道微生物活性相关的代谢物则有所减少：由微生物生物转化产生的次级胆汁酸石胆酸显著降低（VIP = 2.45），短链脂肪酸丁酸也明显减少（VIP = 2.21）。此外，模型组中琥珀酸和必需氨基酸L-色氨酸水平下降，提示微生物发酵功能受损及氨基酸代谢异常。
KEGG通路富集分析
使用KEGG数据库进行通路富集分析，揭示了多条在多囊卵巢综合征（PCOS）中显著失调且受泽兰（ZeLan）治疗调节的血清代谢通路。如图7所示，类固醇激素生物合成通路的富集最为显著（富集因子 = 0.80，P < 0.01），这与PCOS的高雄激素表型一致。卵巢类固醇生成通路也表现出高度富集（富集因子 = 0.75，P < 0.01），反映了雄激素合成异常在卵巢功能障碍中的作用。初级胆汁酸生物合成通路显著富集（富集因子 = 0.62，P < 0.02），提示肠-肝胆汁酸循环紊乱，可能与肠道菌群改变相关。花生四烯酸代谢（富集因子 = 0.56，P < 0.03）和胰岛素抵抗通路（富集因子 = 0.40，P < 0.04）也显著富集，支持PCOS中存在典型的炎症和代谢紊乱。脂肪酸生物合成通路表现出适度富集（富集因子 = 0.30），提示脂质代谢失调的参与。
微生物组-代谢组关联分析
为了评估肠道微生物群组成与代谢变化之间的功能关系，对差异富集的细菌属与关键代谢物进行了基于Spearman相关性分析并采用错误发现率校正。如图8 所示的层次聚类相关性热图揭示了微生物群与代谢组关联的独特模式。其中，乳杆菌属（Lactobacillus）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）等有益细菌与石胆酸（r = 0.72 和 0.68）以及丁酸（r = 0.65 和 0.60）呈显著正相关，而与睾酮（r = -0.75 和 -0.80）及雄烯二酮（r = -0.68 和 -0.72）呈负相关。这些结果表明，在分类学分析中鉴定出的有益细菌与雄激素相关代谢物及短链脂肪酸（SCFA）相关的代谢活性存在关联。
相反，与多囊卵巢综合征（PCOS）相关的属——拟杆菌属（Bacteroides）、普雷沃菌属（Prevotella）和埃希氏菌属（Escherichia）表现出相反的相关模式。这些细菌与睾酮（r = 0.85、0.82 和 0.60）、雄烯二酮（r = 0.78、0.75 和 0.55）以及棕榈酸（r = 0.65、0.60 和 0.45）呈正相关，而与有益代谢物（包括石胆酸和丁酸）呈负相关。这些相关性模式支持特定肠道微生物分类群与PCOS特征性代谢紊乱之间的功能关联，但并未确立直接的因果关系。
数据可用性：
本研究生成并分析的数据集包括样本元数据、表型源数据、16S α-多样性指数、门水平丰度汇总、差异细菌类群结果、代谢组学差异分析表格、代表性代谢物结果、KEGG通路富集结果以及微生物-代谢物相关性矩阵。这些原始源数据作为随文提供的补充文件1。经处理的差异代谢物数据集作为补充表1提供。
图1：实验设计与处理时间线。实验流程示意图，显示为期7天的适应期、21天的DHEA或溶剂注射期、28天的ZeLan提取物或溶剂处理期，以及在第56天采集血清和粪便样本的终点时间点。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：泽兰提取物对内分泌和代谢参数的影响。箱线图显示干预期后对照组、模型组和泽兰治疗组的（A）血清睾酮浓度、（B）LH/FSH比值以及（C）体重变化。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：肠道微生物α多样性。对照组、模型组与泽兰给药组之间Shannon多样性指数的比较，展示各组肠道微生物α多样性的差异。请点击此处查看该图的高清版本。
图4：门水平上的肠道菌群组成。堆叠柱状图显示了对照组、模型组和泽兰治疗组小鼠肠道菌群中主要细菌门的相对丰度。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：通过 LEfSe 分析鉴定出的差异细菌类群。 线性判别分析效应量（LEfSe）用于鉴定区分对照组和模型组的细菌属。LDA 得分表示差异富集类群的效应量大小。与泽兰相关的改变在结果部分中描述，基于相对于模型组的丰度变化。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：差异代谢物谱分析。火山图显示模型组与对照组之间差异代谢物特征。红色和蓝色点分别代表根据倍数变化和统计学显著性确定的显著上调和下调的代谢物特征。请点击此处查看该图的放大版本。
图 7：KEGG 通路富集分析。气泡图显示由差异代谢物鉴定出的显著富集的代谢通路。气泡大小表示映射到通路的代谢物数量，气泡颜色表示通路富集的统计学显著性（P 值）。请点击此处查看此图的放大版本。
图8：肠道菌群与血清代谢物之间的相关性。 分层聚类热图显示了差异富集的细菌属与代表性血清代谢物之间的Spearman相关系数。红色表示正相关，蓝色表示负相关。请点击此处查看该图的放大版本。
| 组别 | N | 体重 (g) | 睾酮 (ng/mL) | LH/FSH 比值 | 胰岛素 (mIU/L) |
| 对照组 | 8 | 227.45 ± 10.12 | 0.51 ± 0.05 | 1.25 ± 0.11 | 12.55 ± 1.12 |
| 模型组 | 8 | 291.12 ± 15.35a | 1.85 ± 0.21a | 3.28 ± 0.25a | 28.95 ± 2.35a |
| 泽兰组 | 8 | 245.25 ± 10.21b | 0.92 ± 0.12b | 1.85 ± 0.15b | 18.82 ± 1.55b |
| 注：数据以均值 ± 标准差表示。a = 与对照组相比，p < 0.05；b = 与模型组相比，p < 0.05。 | |||||
表1：多囊卵巢综合征大鼠的内分泌与代谢参数。 在对照组、模型组和泽兰治疗组中测定了体重、血清睾酮、LH/FSH比值及空腹胰岛素水平。数据以均值±标准差表示。
| 组别 | Shannon 指数 | Simpson 指数 | Chao1 估计值 |
| 对照组 | 6.51 ± 0.28 | 0.98 ± 0.01 | 1215.3 ± 45.4 |
| 模型组 | 4.19 ± 0.35a | 0.82 ± 0.03a | 665.8 ± 52.1a |
| 泽兰组 | 5.79 ± 0.26b | 0.93 ± 0.02b | 963.5 ± 38.6b |
| 注：数据以均值 ± 标准差表示。a = 与对照组相比，p < 0.05；b = 与模型组相比，p < 0.05。 | |||
表2：肠道微生物α多样性指数。 对照组、模型组和泽兰治疗组之间的Shannon指数、Simpson指数和Chao1估计值的比较。数据以均值±标准差表示。
| 代谢物名称 | HMDB ID | 类别 | 变化趋势（模型组 vs 对照组） | p值 | VIP 评分 |
| Testosterone | HMDB0000286 | Steroid | 上调 ↑ | < 0.001 | 2.56 |
| Androstenedione | HMDB0000055 | Steroid | 上调 ↑ | < 0.001 | 2.34 |
| Palmitic acid | HMDB0000220 | Fatty Acid | 上调 ↑ | < 0.001 | 2.12 |
| Arachidonic acid | HMDB0001043 | Fatty Acid | 上调 ↑ | 0.003 | 1.89 |
| Prostaglandin E2 | HMDB0001036 | Lipid | 上调 ↑ | < 0.001 | 2.05 |
| Lithocholic acid | HMDB0000752 | Bile Acid | 下调 ↓ | < 0.001 | 2.45 |
| Butyric acid | HMDB0000039 | SCFA | 下调 ↓ | < 0.001 | 2.21 |
| Succinic acid | HMDB0000254 | Organic Acid | 下调 ↓ | 0.021 | 1.65 |
| L-Tryptophan | HMDB0000929 | Amino Acid | 下调 ↓ | 0.015 | 1.58 |
| 注：VIP = 投影变量重要性（VIP > 1 视为显著）。 | |||||
表3：代表性差异血清代谢物。 与多囊卵巢综合征（PCOS）相关且受泽兰提取物调控的代表性注释代谢物，包括HMDB标识符、代谢物分类、调控趋势、P值和VIP评分。52个注释代谢物特征的完整列表见补充表1。
补充表 1：完整的注释代谢物数据集。保留用于代谢组学报告的 52 种注释代谢物特征的完整列表，包括代谢物名称、HMDB 标识符、生化类别、变化倍数、P 值和调控方向。请点击此处下载该文件。
补充文件 1：支持实验、微生物组和代谢组学分析的源数据。 该工作簿包含用于生成文中图表的样本信息、临床表型测量数据、16S rRNA 测序多样性指数、门水平微生物相对丰度、LEfSe 差异物种分析、代谢组学差异分析、代表性代谢物、KEGG 通路富集分析、相关性矩阵数据以及数据验证汇总。请点击此处下载该文件。
讨论
本研究提供了证据，表明泽兰提取物可改善脱氢表雄酮（DHEA）诱导的大鼠多囊卵巢综合征（PCOS）相关内分泌及代谢表型，且这些效应与肠道菌群组成和血清代谢谱的有益改变相关。整合的多组学方法显示，泽兰治疗可改善高雄激素血症、升高的黄体生成素/卵泡刺激素（LH/FSH）比值以及胰岛素抵抗，同时部分恢复肠道菌群的α多样性，重新平衡菌群组成，并使多个参与PCOS发病机制的代谢通路恢复正常。这些发现拓展了目前对中药植物药物生物学反应的认识，并支持进一步探索肠-卵巢轴作为PCOS干预潜在靶点的可能性。
泽兰治疗后血清睾酮水平及LH/FSH比值的降低，与既往研究结果一致，这些研究证实了含有黄酮类和酚类化合物的植物提取物具有抗雄激素特性16。一项关于中药治疗多囊卵巢综合征（PCOS）的临床研究的系统综述，已总结了多种植物干预措施在内分泌和代谢改善方面的效果17。泽兰调节雄激素生物合成的机制可能涉及对卵巢类固醇生成通路的直接作用、全身性的抗炎和胰岛素增敏效应，或与肠道微生物代谢产物相关的间接作用，而当前实验设计尚无法完全区分这些可能性。LH/FSH比值的改善表明下丘脑-垂体-性腺轴功能的部分恢复，该轴在PCOS患者中常出现功能紊乱18。针对中药复方治疗PCOS的动物实验的系统综述也报道了生殖和内分泌指标的改善19。胰岛素相关指标的同步改善提示，泽兰可能在内分泌调节之外还具有代谢益处，其机制可能通过增强外周胰岛素信号传导，或减少损害胰岛素受体功能的炎症介质来实现20。
泽兰治疗后肠道微生物α多样性恢复，与微生物组相关反应一致。多囊卵巢综合征模型大鼠中观察到的α多样性降低，与越来越多的文献报道一致，这些文献记录了实验性多囊卵巢综合征模型及临床人群中均存在肠道菌群失调。21Insenser 等人进一步报道，多囊卵巢综合征（PCOS）中的肠道菌群特征受到性别、性激素和肥胖的影响22我们观察到，ZeLan处理使Shannon指数从4.19部分恢复至5.79，这表明该植物提取物可能有助于维持微生物群落结构。其他富含多酚的植物提取物也报道具有类似的恢复多样性作用，可能通过选择性促进有益菌群的生长，同时抑制潜在致病菌类。23在门水平上观察到的分类群变化，特别是经ZeLan处理后厚壁菌门与拟杆菌门比例的降低，具有重要意义，因为较高的F/B比值与代谢功能障碍（包括肥胖和胰岛素抵抗）之间已建立明确关联24. 包括Jobira等人在多囊卵巢综合征青少年中的研究在内的其他研究报道了胃肠道微生物多样性的改变，支持了微生物组成对宿主代谢的生物学相关性25.
特定细菌属与多囊卵巢综合征（PCOS）及泽兰治疗的不同关联性的鉴定，为本研究中观察到的微生物群-代谢组关联提供了生物学背景。健康对照组中乳杆菌属（Lactobacillus）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）的富集及其在PCOS动物模型中的减少，与既往报道中强调的这些菌属的保护作用一致26。乳杆菌属菌种以其产生乳酸和抗菌肽的能力而著称，有助于维持肠道屏障完整性并抑制致病菌；而瘤胃球菌属菌种则通过发酵膳食纤维产生短链脂肪酸，在代谢调节中发挥重要作用27。泽兰治疗后这些有益菌属的恢复可能改善肠道屏障功能，并增强与短链脂肪酸相关的代谢活性，这在代谢组学分析中体现为丁酸水平的升高。相反，PCOS动物模型中拟杆菌属（Bacteroides）、普雷沃菌属（Prevotella）和埃希氏菌属（Escherichia）的丰度升高，与已有研究将这些菌属与炎症及代谢紊乱相关联的结果相符28。埃希氏菌属菌种，尤其是大肠杆菌（Escherichia coli），可产生脂多糖，通过Toll样受体4信号通路引发系统性炎症和胰岛素抵抗，这为肠道菌群失调与PCOS相关代谢功能障碍之间的关联提供了合理的解释29。
代谢组学研究结果为泽兰治疗过程中肠道微生物群与宿主代谢之间的关联提供了证据。次级胆汁酸（如石胆酸）的变化具有生物学意义，因为这些代谢物是通过细菌的酶活性生成的30。胆汁酸不仅在脂质吸收中发挥作用，还可作为信号分子，通过法尼醇X受体和Takeda G蛋白偶联受体5（TGR5）调节葡萄糖和脂质代谢，提示胆汁酸谱的正常化可能有助于改善代谢稳态。同样，丁酸水平的恢复也具有重要意义，因其具有多种有益作用，包括增强肠道屏障功能、抗炎特性以及促进胰岛素敏感性。有益细菌与保护性代谢物之间的正相关，与致病菌和有害代谢物之间的关联形成对比，这些结果为肠-卵巢轴假说提供了支持性证据，同时也强调了进一步开展直接机制验证的必要性。
这些发现的临床意义应在临床前探索性设计的局限性范围内进行解读。研究结果支持进一步评估泽兰提取物作为多囊卵巢综合征管理的辅助方法，特别是在可能同时影响内分泌-代谢指标和肠道微环境的植物干预背景下。鉴定与治疗反应相关的微生物和代谢生物标志物，可能有助于指导未来的机制性和转化研究。此外，肠-卵巢轴最终可能为将泽兰与益生菌或饮食调整相结合的联合策略提供支持，但此类策略在临床应用前仍需经过严格对照的验证。
本研究存在若干局限性，需予以说明。首先，尽管DHEA诱导的大鼠模型再现了人类多囊卵巢综合征（PCOS）的多种特征，但未能完全涵盖人类PCOS表型的异质性，包括瘦型、肥胖型、胰岛素抵抗型及炎症亚型；因此，临床转化需在特征明确的患者群体中进一步验证。其次，本研究仅使用单一剂量的ZeLan，未设置剂量-效应梯度，也未设置如二甲双胍等阳性药物对照，因此其有效剂量范围、相对疗效及最佳给药周期仍有待确定。第三，样本采集仅在实验终点进行，限制了对干预期间微生物群、代谢物及激素谱动态时序变化的解读。第四，本实验设计未包括卵巢组织病理学检查、卵泡计数、黄体定量分析以及连续动情周期监测；因此，卵巢功能恢复的评估是基于内分泌与代谢指标推断得出，而非直接的组织水平和周期水平评估。第五，研究虽识别出微生物分类群与代谢物之间的相关性，但未开展粪便微生物移植、无菌动物实验、靶向代谢物补充、炎症标志物检测，或如CYP17A1、CYP19A1和StAR等卵巢类固醇合成酶的测定；因此，当前数据尚无法确认其因果机制。第六，非靶向代谢组学仅提供发现层面的证据，未来研究需对关键代谢物（如石胆酸、丁酸和睾酮）进行靶向定量验证。第七，本次投稿未提供β多样性可视化分析、微生物功能预测分析以及整合的微生物-代谢物-基因通路建模，限制了完整调控网络的构建。最后，ZeLan提取物以总黄酮含量进行标准化，但其活性单体成分的全面定性与定量植物化学表征仍需进一步完成。
综上所述，泽兰提取物在大鼠模型中改善了与多囊卵巢综合征（PCOS）相关的内分泌及代谢表型，并与肠道微生物α多样性部分恢复、微生物组成改变以及血清代谢通路的调节相关，这些代谢通路包括类固醇激素生物合成、胆汁酸代谢以及短链脂肪酸相关代谢。有益菌与保护性代谢物之间的正向关联，与PCOS富集菌群和有害代谢物之间的关联形成对比，支持了肠道-卵巢轴在生物学上合理的关联机制。这些发现为未来开展泽兰提取物在PCOS管理中的机制研究和转化研究奠定了基础，同时也强调了进行因果关系验证和更广泛的植物化学成分表征的必要性。
披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本研究由河北省中医药管理局科研计划项目 （项目编号：2021316）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A955-4 | Optima LC-MS 级，4 L；用于流动相和样品复溶 |
| ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱 | Waters Corporation | 186003539 | 100 Å，1.8 μm，2.1 × 100 mm；用于超高效液相色谱分离 |
| 琼脂糖凝胶电泳系统 | Bio-Rad Laboratories | 1704486 | Mini-Sub Cell GT 水平电泳系统；用于DNA质量评估 |
| Agilent 1290 Infinity II/6550 UHPLC-Q-TOF-MS | Agilent Technologies | G7120A/G7167B/G7116B/G6550B | 1290 Infinity II 超高效液相色谱模块与 6550 iFunnel Q-TOF 质谱联用；用于血清非靶向代谢组学分析平台 |
| DADA2 算法 | Bioconductor | Version 1.24.0 | 用于扩增子序列变体（ASV）生成和嵌合体去除；版本推断为匹配 R 4.2.1/Bioconductor 3.15 工作流程 |
| 脱氢表雄酮（DHEA） | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | D4000 | 用于多囊卵巢综合征（PCOS）模型诱导；6 mg/100 g 体重；CAS 53-43-0 |
| 蒸馏水 | Invitrogen / Thermo Fisher Scientific | 10977015 | UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水；用于对照组和模型组的灌胃给药溶剂 |
| 甲酸 | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A117-50 | Optima LC-MS 级，50 mL；液相-质谱流动相中添加 0.1% |
| 人类代谢组数据库 | 阿尔伯塔大学 / HMDB | HMDB 5.0 | 代谢物注释数据库 |
| Illumina NovaSeq 6000 平台 | Illumina | 20012850 | 测序服务提供商用于双端 250 bp 16S rRNA 测序的测序系统 |
| 泽兰（Lycopus lucidus Turcz.）药材 | 北京同仁堂中药有限公司 | 批次 ZL-20230315 | 经鉴定的植物原料，用于制备泽兰水提物 |
| 甲醇 | Fisher Chemical / Thermo Fisher Scientific | A456-4 | Optima LC-MS 级，4 L；用于血清代谢组学中的蛋白质沉淀 |
| METLIN 数据库 | Scripps 研究所 | METLIN Classic 2023 | 代谢物质谱注释数据库 |
| NanoDrop 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计；用于DNA浓度和纯度评估 |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | Qiagen | 51604 | 用于盲肠内容物DNA提取；50次装粪便DNA提取试剂盒 |
| QIIME2 | QIIME2 开发团队 | Version 2022.2 | 16S rRNA 序列处理 |
| R 软件 | R 基金会 | Version 4.2.1 | 统计分析和 XCMS 数据处理 |
| 血清睾酮、LH、FSH 和胰岛素 ELISA 试剂盒 | Cusabio Biotech | CSB-E05100r; CSB-E12654r; CSB-E06869r; CSB-E05070r | 大鼠血清睾酮、LH、FSH 和胰岛素 ELISA 试剂盒，用于激素和胰岛素定量检测 |
| 芝麻油 | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | S3547 | 用于DHEA注射的溶剂 |
| 戊巴比妥钠 | Sigma-Aldrich / MilliporeSigma | P3761 | 麻醉剂；腹腔注射 50 mg/kg |
| SPSS 软件 | IBM Corporation | Version 26.0 | 统计分析 |
| 通用 16S rRNA 引物 338F/806R | 上海生工生物工程有限公司 | 定制合成：338F/806R | 扩增 V3-V4 区域；338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT |
| XCMS 软件包 | Bioconductor / R | Version 3.18.0 | 峰检测、保留时间对齐和积分 |
| 泽兰提取物 | 实验室自制水提物 | 批次 ZLE-20230402 | 用于灌胃治疗；标准化总黄酮含量 ≥2.5% |
参考文献
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