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方法文章

一个 体外 膜结合蛋白酶 FtsH 及其适配蛋白 LapB 介导的 LpxC 降解检测方法 大肠杆菌

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DOI：

10.3791/71092

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2026年6月22日

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

本文内容

摘要

大肠杆菌 主要通过调控LpxC（催化脂多糖合成第一步的关键脱乙酰酶）的降解来调节脂多糖（LPS）的生物合成。本实验方案的目标是建立一种灵敏、定量的方法 体外 使用重组的AAA+蛋白酶FtsH和适配蛋白LapB在蛋白脂质体中进行LpxC降解实验。

摘要

本方案提供了一种灵敏、定量的方法 体外 使用在蛋白脂质体中重建的AAA+（与多种细胞活动相关的ATP酶）蛋白酶FtsH及其适配蛋白LapB降解LpxC的检测方法。AAA+蛋白酶是一类依赖ATP的分子机器，可在细胞质或细胞膜上维持蛋白质稳态并调控多种细胞过程。与胞质中的同类蛋白酶相比，膜结合型AAA+蛋白酶由于在活性重建与检测方面存在技术挑战，其特性仍知之甚少。 体外在此，我们以 FtsH–LapB–LpxC 系统为模型，开发了一种基于荧光的蛋白脂质体降解检测方法。将 FtsH 和 LapB 重组至蛋白脂质体中以模拟天然膜环境，同时将 LpxC 共价标记荧光染料 Atto488。通过将蛋白脂质体与标记的 LpxC 及 ATP 混合启动降解反应，并以三氯乙酸（TCA）终止反应。成功的检测表现为 TCA 沉淀后可溶性上清液中荧光信号随时间递增，该信号对应于 LpxC 蛋白水解产生的荧光肽片段的释放。此信号可用于在特定条件下直接定量初始降解速率。与传统的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测方法相比，本方法显著提高了灵敏度，并可实现定量动力学分析。此外，蛋白脂质体系统可系统性地研究蛋白组分（如适配蛋白和抗适配蛋白）以及脂质组成对 LpxC 降解的影响。尽管该检测方法针对 FtsH–LapB–LpxC 系统开发，但其可便捷地适用于其他膜结合的 AAA+ 蛋白酶及其底物，为研究膜相关蛋白水解提供通用平台 体外.

引言

 AAA+ 蛋白酶是一类保守的、依赖 ATP 的分子机器，在蛋白质质量控制和调控性蛋白水解中发挥核心作用1,2这些机器包含一个由AAA+ ATP酶结构域组成的六聚体环，可水解ATP，并识别、解折叠和 将底物转运至区室化的蛋白酶结构域以进行降解1. 尽管细胞质中的AAA+蛋白酶（如ClpXP）3 和 Lon4 已通过成熟可靠的方法进行了广泛表征 体外 检测方法，膜结合型AAA+蛋白酶仍相对知之甚少。这一空白主要源于将膜蛋白重构到明确脂质环境中的技术挑战，以及对其蛋白水解活性进行定量测量的困难。 体外该方法的总体目标是建立灵敏且定量的检测体系，用于研究膜结合蛋白酶的蛋白水解活性。

FtsH 是 Escherichia coli 中唯一必需的 AAA+ 蛋白酶，是典型的膜结合型 AAA+ 蛋白酶5,6,7。FtsH 通过其 N 端跨膜螺旋锚定于内膜，可降解多种胞质和膜相关底物，从而调控膜蛋白质量控制、应激反应以及脂质稳态8,9,10,11。其中研究最清楚的底物之一是 LpxC，这是一种可溶性去乙酰化酶，催化脂多糖（LPS）生物合成的第一步限速反应12,13。FtsH 对 LpxC 的高效降解依赖于膜蛋白 LapB，后者作为衔接蛋白特异性识别 LpxC 并将其递送至蛋白酶进行降解14,15,16,17,18。

尽管FtsH介导的蛋白水解具有重要的生理意义，其定量分析仍面临挑战 体外 尤其是对于LpxC等胞质底物而言，相关研究仍十分有限。传统的 体外 降解实验采用在去垢剂胶束中纯化的 FtsH13,19，无法为膜锚定的蛋白酶提供膜环境。此外，降解检测通常依赖于通过SDS–PAGE检测底物的减少13，该方法可能耗时较长、通量较低，且对动力学分析的灵敏度不足。最近，Heedeok Hong 团队开创性地利用将 FtsH 重组至双层胶束（bicelles）中的体系，用于研究膜底物的降解。20然而，用于分析胞质底物的可比系统仍付之阙如。在此，我们将 Heedeok Hong 的bicelle重组技术改造用于蛋白脂质体重组，以模拟膜环境。此外，将水溶性底物LpxC进行荧光标记，从而实现对FtsH/LapB依赖性LpxC降解动力学的高灵敏度和定量检测 体外.

当研究人员需要定量测量FtsH介导的水溶性底物蛋白水解时，应使用本方法。该方法相较于现有方法具有多项优势。首先，基于荧光检测蛋白水解产物而非底物减少，显著提高了检测灵敏度和动态范围，有利于对蛋白水解活性进行定量比较。其次，使用蛋白脂质体可在维持FtsH功能所需膜环境的同时，精确控制蛋白质和脂质组成18。最后，尽管本方案基于FtsH–LapB–LpxC系统开发，但可轻松适用于其他膜结合AAA+蛋白酶及其需要膜相关降解机制的胞质底物。

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方案

1. 使用 Atto488 标记 LpxC

  1. LpxC 的制备
    1. 按先前报道的方法表达并纯化LpxC蛋白18. 将纯化的 LpxC 缓冲液从 Tris 缓冲液置换为 50 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.6（6 mM NaH₂PO₄，44 mM Na₂HPO₄）2PO4，44 mM Na2HPO4，150 mM NaCl）通过使用高分辨率凝胶过滤柱（例如 Superdex 200 Increase 10/300 GL 柱）进行凝胶过滤纯化。
    2. 使用超滤柱在 4 ℃ 下将 LpxC 浓缩至终浓度至少为 5 mg/mL °C.
  2. 用 Atto488 标记 LpxC
    1. 将0.5 mg的LpxC用50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.6）稀释至终体积225 μL µL. 加入25 µ1 M 碳酸氢钠溶液，用于将 pH 调至约 8.3。
    2. 将 0.24 mg 的 Atto488 活性染料溶解于 20 µ0.1 M 碳酸氢钠缓冲液 L，用于制备储备液（0.012 mg/µL）。通过稀释 2 配制工作溶液 µ将18升的储备溶液与 µL 的 0.1 M 碳酸氢钠缓冲液，终浓度为 0.0012 mg/µL.
    3. 立即加入 4 µ将 Atto488 工作溶液加入蛋白溶液中（LpxC : Atto488 的摩尔比为 3:1）。用铝箔包裹离心管，并于 4 ℃ 孵育 °在 2 小时内以温和振荡（18 rpm）处理。
      注意：Atto488 储备液和工作溶液均可在液氮中速冻，并于 -80 ℃ 保存 °C.
  3. LpxC–Atto488 与游离染料的分离
    1. 用10 mL超纯水平衡PD-10脱盐柱，随后用15 mL 50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.6）平衡。
    2. 将标记反应混合物上样至柱中，并使其完全进入树脂。
    3. 用5 mL pH 7.6的50 mM磷酸盐缓冲液洗脱。应出现两个明显条带，分别对应LpxC–Atto488（第一条带）和游离Atto488染料（第二条带）。收集第一条带的组分，每份约0.5 mL。
    4. 通过 SDS-PAGE 分析洗脱组分。在考马斯亮蓝（CBB）染色前，于紫外光照射下观察荧光。
    5. 合并含有 LpxC–Atto488 的洗脱组分，并将标记蛋白浓缩至约 2 mg/mL。
    6. 使用微量分光光度计测定蛋白质浓度和Atto488浓度，以估算标记效率。
      注意：Atto488 浓度（以 pmol/μL 计）与 LpxC 蛋白浓度（以 pmol/μL 计）之比µLpxC 浓度（单位为 mg/mL）在 2–5 范围内时，表明标记水平适当。这对应于标记后 Atto488 与 LpxC 的摩尔比为 1:15 至 1:6。
    7. 将 LpxC–Atto488 分装至 1.5 mL 微量离心管中，液氮速冻后于 -80 ℃ 保存 °C. 此时，该实验方案可暂停长达3个月。
      警告：液氮温度极低，操作时须佩戴适当的防护装备（耐低温手套、护目用具）。

2. 将 FtsH/LapB 重组到蛋白脂质体中

  1. 脂质体的制备
    1. 将100 mg的1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC）氯仿溶液转移至玻璃试管中。在温和的氮气流下蒸发溶剂。₂，随后在真空条件下过夜干燥。
      注意：POPC 的相变温度约为 -2 °C，广泛应用于膜生物物理学、脂质体配方及细胞模型系统中。
      注意：氯仿可能对眼睛、皮肤、肝脏、肾脏和神经系统造成损害。操作时必须佩戴适当的防护装备（手套、眼部保护装置、口罩），并在通风橱中使用玻璃注射器进行操作。
    2. 加入 1,315 µ将缓冲液A（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl）加入干燥的POPC薄膜中。通过水浴超声1分钟与最大速度涡旋1分钟交替进行，总时间约15分钟，直至脂质完全分散。（最终脂质浓度：100 mM）。
      注意：为改善脂质重悬效果，可调节玻璃试管在水浴超声仪中的浸入深度以最大化振荡效果。重悬后的脂质可在 -20 ℃ 长期保存。 °C. 此时，该实验方案可暂停，最长可达1个月。
    3. 将脂质体悬液分装至200 µL 部分并储存在 -20 °C.
  2. 脂质体挤出
    1. 解冻一份200 µL 脂质体等分试样于室温水浴中解冻，并用 800 µ缓冲液A定容至1 mL。
    2. 将脂质体在液氮和室温水浴之间交替进行三次冻融循环。
    3. 用缓冲液 A 冲洗注射器、两个滤器支撑架和一张 200 nm 聚碳酸酯膜。组装微型挤出器，并将脂质体挤出 20 次。
      注意：挤出后，脂质体悬液应呈透明状。
    4. 将1 mL挤出的脂质体悬液均分为三份，每份330 μL，分装至三个离心管中。 µ每管 L）并用 600 稀释各管 µ缓冲液A的L
  3. Triton X-100 肿胀滴定
    注意：Triton X-100 是一种 低临界胶束浓度（CMC）去垢剂，以及 在许多情况下，该方法已被证明最为成功21
    警告：Triton X-100 为危险化学品，主要可造成严重眼损伤、皮肤刺激，以及吞咽后产生有害作用。操作时须佩戴适当的个人防护装备（手套、护目用具）。
    1. 按体积比配制10%的Triton X-100溶液，通过混合100 µL Triton X-100 与 900 µL超纯水，并在摇床中孵育以充分溶解Triton X-100。
    2. 在540 nm处测定脂质体的吸光度（A₅₄₀) 使用分光光度计。
    3. 加入5 µ依次加入10% Triton X-100的L等分试样，每次加入后轻轻混匀，并测定A₅₄₀继续逐滴加入Triton X-100，直至A₅₄₀ 达到最大值后，再分4至5次加入Triton X-100，直至吸光度下降至峰值的约60%。
    4. 根据滴定曲线，通过加入 35 使脂质体膨胀 µ加入10% Triton X-100溶液L，室温下轻柔振荡孵育1小时。
  4. 将 FtsH/LapB 重组至脂质体中
    1. 表达并纯化FtsH和LapB蛋白，方法如前所述18.
    2. 用10倍体积的甲醇洗涤约2 g非极性聚苯乙烯吸附剂（例如Bio-Beads SM-2）一次，再用10倍体积的乙醇洗涤一次，随后用10倍体积的超纯水洗涤十次。将洗涤后的吸附剂置于缓冲液A中，4 ℃保存 °C.
    3. 对于每管经Triton X-100膨胀的脂质体，加入3 µ500 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP）22.5 L µ克 FtsH 和 22.5 µg LapB。用缓冲液A调总体积至1 mL，室温下轻柔振荡孵育1 h。
      注意： 蛋白质与脂质的质量比为 1:20 至 1:200（wt/wt） 在蛋白脂质体重组过程中常规使用21. 此处采用1:100的比例。
    4. 通过非极性聚苯乙烯吸附剂的连续孵育去除去垢剂：室温下加入40 mg孵育0.5 h，随后再加入40 mg于室温孵育1 h，然后加入40 mg于4 °C孵育过夜 °C过夜，最后在4℃加入40 mg °C 下反应 1 小时。
    5. 短暂离心，以在 4℃ 下沉淀非极性聚苯乙烯吸附剂 °C（400 × g 离心3秒，将上清液转移至超速离心管中。用1 mL缓冲液A洗涤非极性聚苯乙烯吸附剂，并将洗涤液与上清液合并。再加入缓冲液A，使终体积约为6 mL。
      注意：出于安全考虑，超速离心管中必须至少含有 6 mL 液体。
    6. 平衡离心管，并在250,000 × g下超速离心 × g 在 4 °在固定角转子（例如 MLA-80）中于 4°C 离心 45 分钟，使蛋白脂质体沉淀。
    7. 弃去上清液，将蛋白脂质体沉淀重悬于 70 µL 缓冲液 A，补充 1 mM TCEP
      注意：最终蛋白脂质体体积约为 100 µL.
    8. 将蛋白脂质体在液氮中快速冷冻，并于 -80 ℃ 保存 °C. 
      注意：此步骤可暂停最多1个月。
  5. 蛋白脂质体的SDS-PAGE分析
    1. 充分混匀蛋白脂质体，并取 5 µ样品的 L 与 5 µ2 L× SDS上样缓冲液（0.1 M Tris-HCl，pH 6.8，5% SDS，20%甘油，0.01%溴酚蓝，200 mM DTT）
    2. 将蛋白脂质体样品与525 ng的FtsH（相当于0.06 µ20 中的 M FtsH 六聚体 µ在4–20% SDS-PAGE凝胶上
    3. 用考马斯亮蓝染色凝胶。
    4. 扫描凝胶并量化每个样品中 FtsH 条带的强度。计算相当于 525 ng FtsH 的蛋白脂质体悬液体积。

3. 体外 LpxC–Atto488的降解

  1. 执行 体外 在20中的降解实验 µ含 FtsH/LapB 蛋白脂质体（相当于 0.06 µM FtsH) 以及 0.5、1、2、2.5、5、10、20、40 µ50 mM Tris-乙酸盐缓冲液（pH 8.0）、10 mM Mg-乙酸盐、5 mM ATP、25 mM LpxC-Atto488 µM Zn-乙酸盐，80 mM NaCl，1.4 mM β-巯基乙醇）
  2. 对于每个底物浓度的测定，准备70 μL的反应体系 µL.
    1. 取20 µL 分数并立即与 48 混合以终止反应 µ在1.5 mL微量离心管中加入5%三氯乙酸（TCA）以终止反应（0 min）。分别在10和20 min时取第二和第三份样品并终止反应。
    2. 同时，制备不含蛋白脂质体的相应对照反应，用于背景扣除。
      注意：建议进行三次重复测量，以获得可靠的结果。
      处理 LpxC–Atto488 时应尽量减少光照暴露。
      警告：三氯乙酸（TCA）是一种强腐蚀性化学品，可导致严重皮肤灼伤、永久性眼损伤，并在吸入时引起强烈呼吸道刺激。操作时应佩戴适当的个人防护装备（手套、护目镜、口罩）。
  3. 在 37 °C 下孵育样品 °C 下孵育 30 分钟以沉淀蛋白质，然后在 18,800 × g 室温孵育 20 分钟。
  4. 通过转移50 μL样品至中和液中以中和样品 µ将上清液的 L 加入含有 60 的试管中 µ500 mM Tris-HCl 溶液，L pH 8.8。充分混匀后转移 100 µ将样品转移至黑色96孔板中。使用酶标仪在激发波长498 nm、发射波长520 nm条件下测定荧光信号。

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结果

为了提高该方法的灵敏度 体外 降解实验中，底物LpxC用荧光染料Atto488标记。Atto488的琥珀酰亚胺酯基团在弱碱性条件下可高效地与LpxC的伯氨基发生反应。由于Tris缓冲液含有会干扰该反应的伯氨基，因此将在Tris缓冲液中纯化的LpxC通过凝胶过滤置换至磷酸盐缓冲液后再进行标记。标记反应中，LpxC与Atto488的摩尔比为3:1，以实现适度标记并避免过度标记（见讨论部分）。去除游离染料后，通过SDS-PAGE分析LpxC–Atto488组分，并在紫外光下观察荧光信号图1A）。随后用考马斯亮蓝（CBB）对同一凝胶进行染色，以确认LpxC蛋白的存在（图1B荧光带与蛋白质条带的重合表明，标记的LpxC样品中游离染料已被有效去除（图1).

为了实现FtsH和LapB高效地重组到脂质体中，使用Triton X-100对预先形成的脂质体进行部分去稳定化处理。随着Triton X-100...

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讨论

本方案的第一个关键步骤是LpxC的Atto488标记。适度的标记对于准确测量至关重要 体外 降解活性。根据我们的优化实验，LpxC与Atto488的摩尔比在9:1至3:1之间为最佳。过量的Atto488会导致过度标记，可能干扰LpxC的天然状态。在此条件下，FtsH单独作用与FtsH/LapB联合作用对LpxC–Atto488降解的差异显著减小（数据未显示）。相反，标记不足则会产生过弱的荧光信号，难以进行灵敏的动力学测量。当将本方案用于检测其他水溶性底物的降解时，底物与Atto488的摩尔比为3:1可作为有效的起始点。

确定FtsH/LapB在蛋白脂质体中重建效率是本实验方案的第二个关键步骤。为了定量评估FtsH/LapB介导的LpxC降解，必须测定蛋白脂质体中FtsH的浓度。在本方案中，通过比较标准FtsH样品与蛋白脂质体样品中FtsH条带的强度来估算FtsH的浓度。

值得注意的是，即使在不存在 FtsH/LapB 的情况下，LpxC–Atto488 也会发生部分自降解或变性。因此，在使用该检测方法时，背景...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

所有研究均在耶鲁大学进行。W.M. 获得美国普通医学科学研究所资助，资助编号为 R01GM137068 和 RM1GM149406，并获得理查德和苏珊·史密斯家庭基金会通过奥德赛奖提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管USA scientific1415-2500
200 nm 聚碳酸酯膜Avanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGE自制
腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物SigmaA26209
Atto 488 蛋白标记试剂盒Sigma38371
Bio-Beads SM-2 Bio-Rad152-8920非极性聚苯乙烯吸附剂 
黑色 96 孔板 Costar3915
溴酚蓝Sigma114391
考马斯亮蓝 R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
乙醇Sigma459844
滤膜支撑架Avanti Polar Lipids610014
玻璃注射器Avanti Polar Lipids610017
玻璃试管KIMBLE45066-16150
甘油Avantor2136-01
乙酸镁四水合物Sigma228648
甲醇Sigma179337
微量离心机Thermo Fisher Scientific75-002-436
小型挤出器Avanti Polar Lipids610000
MLA-80 转子 Beckman367096固定角转子 
酶标仪TecanInfinite M1000 PRO
POPC Avanti Polar Lipids850457C
制冷微量离心机Thermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
碳酸氢钠 SigmaS6014
氯化钠SigmaS9888
磷酸二氢钠Sigma38400100
磷酸氢二钠Sigma567547
超声破碎仪FisherbrandFB-11201
分光光度计SCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva 28990944高分辨率凝胶过滤柱 
台式超速离心机BeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
三氯乙酸 SigmaT6399
Tris 碱Sigma252859
Triton X-100 SigmaT8787
超速离心管 Beckman355647
超滤柱 MilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 混匀器Scientific IndustriesSI-0236 
乙酸锌二水合物Sigma379786
β-巯基乙醇Sigma444203

参考文献

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FtsH蛋白酶LapB衔接蛋白蛋白脂质体重组AAA+蛋白酶荧光检测蛋白质稳态动力学分析

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