血浆miR-362-3p联合多普勒超声在乳腺癌诊断中的诊断效能

摘要

乳腺癌的诊断率相对较低。采用四格表法分析miR-362-3p联合多普勒超声对乳腺癌的诊断价值。多普勒超声联合miR-362-3p可有效提高诊断效能，为乳腺癌的诊断提供了一种有前景的方法。

摘要

乳腺癌是全球第二常见的恶性肿瘤，严重威胁女性生命，并带来巨大的经济负担。本研究旨在探讨miR-362-3p联合多普勒超声在乳腺癌诊断中的价值。共纳入182例乳腺癌患者和147例良性乳腺疾病患者。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测患者血浆中miR-362-3p的表达水平。使用卡方检验分析两组患者多普勒超声参数的差异。采用受试者工作特征（ROC）曲线评估miR-362-3p、阻力指数（RI）和搏动指数（PI）的诊断效能。通过四格表法分析多普勒超声联合血浆miR-362-3p在乳腺癌诊断中的诊断效率。乳腺癌患者中miR-362-3p水平显著降低。两组在二维超声参数方面存在显著差异。miR-362-3p、RI和PI对乳腺癌均具有诊断价值，三者联合诊断价值更高。超声联合miR-362-3p显著提高了乳腺癌诊断的敏感性、准确性和阴性预测值。 多普勒超声联合miR-362-3p可提升乳腺癌的诊断效率，可能为乳腺癌提供一种无创且具有潜力的辅助诊断工具。

引言

根据国际癌症研究机构的统计数据，2020年乳腺癌的发病率已超过肺癌¹。乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，是全球女性癌症相关死亡的主要原因之一¹。乳腺癌的及时诊断有助于改善患者的预后。组织活检是诊断乳腺癌的金标准，但属于有创性诊断方法，不适用于早期乳腺癌患者²。

多普勒超声是一种常用于乳腺癌筛查和辅助诊断的影像学技术³。多普勒超声可准确评估结节大小、血流信号以及淋巴结转移状态⁴。由于具有无电离辐射、安全性高、无创，以及可重复检查等优势，乳腺多普勒超声已成为乳腺癌筛查与诊断中最广泛应用的影像学技术之一⁵。然而，在检测低密度或小体积乳腺癌时，多普勒超声易受组织背景干扰，导致诊断敏感性显著下降，难以满足临床对早期诊断的需求⁶。因此，有必要开发能够克服多普勒超声技术局限性的血浆生物标志物。若能将两种方法结合，提高乳腺癌诊断的敏感性，将具有重要的临床价值和实际意义。

微小RNA（miRNAs）是一类长度约为20至24个核苷酸的非编码RNA分子^7,8microRNA（miRNA）的一个特征是在进化过程中具有高度保守性。miRNA在组织中分布广泛，不仅在人体多种组织细胞中特异性表达，还可稳定存在于血液、唾液等多种体液中。⁹这些分布特征为非侵入性诊断标志物的开发提供了优势。在功能上，miRNA 通过与 mRNA 的 3' 非翻译区（UTR）互补结合，从而降解 mRNA^10,11，参与一系列关键的病理和生理过程，如细胞炎症反应、氧化应激、细胞凋亡以及增殖与分化¹²大量研究已证实，miRNA表达谱的异常改变与乳腺癌的发生和发展密切相关^13,14microRNA 表达失调可通过调控原癌基因或抑癌基因的表达网络，促进乳腺上皮细胞的恶性转化。miR-362-3p 是一种典型的抑制肿瘤进展的因子。多项研究发现，miR-362-3p 能抑制乳腺癌的进展^15,16,17Assiri 等报道，miR-362-3p 表达水平降低与乳腺癌患者预后不良及总生存期缩短密切相关¹⁵从机制上讲，miR-362-3p 通过靶向 DEAD-box 解旋酶 5（DDX5）抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，从而发挥抗肿瘤作用¹⁶此外，康领导的团队还发现，miR-362-3p 在乳腺癌组织中显著下调，针对 miR-362-3p 表达的调控可能成为乳腺癌治疗的一种新的潜在策略。¹⁷然而，目前尚未见关于miR-362-3p是否可作为乳腺癌早期诊断标志物的报道。

本研究检测了乳腺癌患者血浆中miR-362-3p的表达水平，同时分析了多普勒超声的核心影像参数。研究系统探讨了血浆miR-362-3p表达水平与多普勒超声影像参数联合应用的价值，明确证实了该联合诊断方法在乳腺癌筛查以及良恶性乳腺疾病鉴别诊断中的有效性。

方案

本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。伦理批准由山东第二医科大学附属医院、山东第二医科大学临床医学院伦理委员会授予（批准编号：wyfy-2023-ky-124）。所有参与本研究的受试者均签署了知情同意书。所使用的试剂和设备列于材料表中。

1. 实验对象

采用 G*Power 3.1 软件基于独立样本 t检验 进行样本量计算。设定中等效应量（Cohen’s d = 0.5，临床观察性研究中广泛使用）、双侧检验、α = 0.05、检验效能（1 − β）= 0.95。计算结果表明，每组至少需要 105 名受试者。最终共纳入 182 例乳腺癌患者和 147 例良性乳腺病变患者，两组实际样本量均远超过最低所需样本量，确保了充分的统计效能以支持研究结论，并将Ⅱ类错误风险控制在可接受范围内。所有受试者均严格按照统一的纳入与排除标准连续入组。

2023年至2024年期间，所有患者均来自山东第二医科大学附属医院临床医学院。良性病变：经病理学确诊为非恶性病变。乳腺癌：经病理学确诊为恶性肿瘤。所有受试者在隔夜禁食后采集静脉血样本。静脉血样本经抗凝处理后，严格按照标准操作程序离心分离血浆，并立即转移至−80 °C长期保存，后续用于miRNA提取。所有血浆样本在RNA提取前严格限制冻融次数不超过两次，以防止miRNA降解。所有患者均充分了解研究方案，并在入组前自愿签署书面知情同意书。

乳腺癌患者的纳入标准：（1）经病理学确诊为原发性乳腺癌的患者。（2）入组前未接受过手术治疗。（3）样本采集前未接受过放疗或化疗。

良性乳腺疾病患者的纳入标准：（1）经病理学确诊为良性乳腺病变。（2）无其他系统性恶性肿瘤或癌前病变。（3）非妊娠期及非哺乳期。（4）无严重急性感染或慢性炎症性疾病。

乳腺癌及良性乳腺病变患者的排除标准：（1）严重乳腺感染或急性危重疾病。（2）严重肝肾功能不全或自身免疫性疾病。（3）在过去6个月内接受过激素治疗的患者。

2. 多普勒超声检查

采用多普勒超声对患者双侧乳房的四个象限进行详细检查。使用二维超声扫描记录病灶特征，包括病灶边界、形态、内部回声、后方回声以及纵横比。应用彩色多普勒血流成像评估病灶的血流参数，包括阻力指数（RI）、搏动指数（PI）和最大血流速度（V_max）。根据既往报道的分类系统¹⁸对血流信号进行分级：0级：无血流信号；I级：少量血流信号；II级：血流信号长度超过病灶直径的一半；III级：丰富血流信号。

3. 乳腺癌超声诊断的阳性定义

这些标准包括：（1）边界模糊；（2）形态不规则；（3）内部回声不均；（4）后方回声减弱；（5）纵横比>1；（6）阻力指数（RI）>0.70；（7）搏动指数（PI）>1.50；（8）最大血流速度（Vmax）>18.00 cm/s；（9）血流信号≥II级。符合上述任一可疑标准的病灶均被归类为超声阳性，而无可疑特征的病灶则被归类为超声阴性。

4. 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

采用特异性miRNA提取试剂盒提取血浆中的miRNA。将成功提取的RNA样本用于cDNA合成，所用试剂为特异性miRNA逆转录试剂盒。miR-362-3p的逆转录反应条件如下：总反应体系为20 µL。（1）混合物在37 °C孵育15分钟；（2）在42 °C进行50分钟的逆转录反应；（3）在95 °C灭活酶5分钟。反应产物储存于4 °C。qPCR反应条件：反应体系总体积为20 µL。扩增条件如下：（1）cDNA预变性，并在95 °C激活DNA聚合酶2分钟；（2）DNA链在60 °C退火并延伸30秒。上述两个步骤共进行40个循环。基因相对表达量通过公式2^-(ΔΔCt)计算。miR-362-3p的相对表达以U6进行校准。为验证将U6作为内参基因的合理性，采用BestKeeper算法评估了血浆队列中U6的稳定性。所有样本中U6的Ct值变异系数（CV）小于2%，表明其表达高度稳定。因此，U6在本研究中被验证并选为miR‑362‑3p表达标准化的参考基因。引物的下游序列由试剂盒提供。引物序列如下：

miR-362-3p：GCCGAGAACACACCTATTCA。

U6：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT。

5. 受试者工作特征（ROC）曲线

采用Youden指数通过计算ROC曲线的灵敏度和特异度来确定miR-362-3p在诊断乳腺癌中的最佳截断值。使用SPSS软件中的二元逻辑回归构建联合诊断模型，将miR-362-3p、RI和PI作为自变量。采用进入法（Enter method）纳入变量，以生成每位受试者联合诊断的预测概率值。预测概率（PRE）的公式为：。根据PRE绘制ROC曲线。采用DeLong检验比较不同ROC曲线下面积（AUC）值之间的差异。

6. 结局参数的定义

主要结局指标是血浆miR-362-3p与多普勒超声联合模型对乳腺癌的总体诊断效能，以病理诊断作为金标准。次要结局指标包括单独使用多普勒超声以及单独使用血浆miR-362-3p的诊断性能。

7. 数据统计

采用统计学与绘图软件分析miR-362-3p的表达水平及两组患者的ROC曲线。t检验用于比较两组间连续变量的差异。卡方检验与四格表法通过SPSS 26.0软件进行分析，其中卡方检验用于评估分类变量之间的统计学差异；双指标联合（miR-362-3p + 彩色多普勒超声）作为主要分析内容，代表临床实践中常规的定性诊断结论；若乳腺影像报告和数据系统（BI-RADS）分类中存在任何可疑特征，则将病灶定义为阳性；四格表法用于计算彩色多普勒超声与miR-362-3p联合诊断的特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性。彩色多普勒超声与miR-362-3p的诊断结果包括真阳性（a）、假阳性（b）、假阴性（c）和真阴性（d）。计算公式如下：灵敏度 = a / (a + c)；特异性 = d / (d + b)；阳性预测值 = a / (a + b)；阴性预测值 = d / (d + c)；准确率 = (a + d) / (a + b + c + d)。三种诊断方法（miR-362-3p、超声及联合诊断）采用Pearson χ²检验进行R×C列联表分析。P < 0.05被认为具有统计学意义。

结果

乳腺癌患者中miR-362-3p的水平显著降低

比较了182例乳腺癌患者和147例良性乳腺病变患者的临床基线信息及临床病理学特征。详细数据汇总于表1。采用RT-qPCR检测两组患者血浆中miR-362-3p的水平。结果显示，乳腺癌患者循环miR-362-3p的表达水平显著低于良性乳腺疾病患者（图1A）。ROC曲线分析表明，miR-362-3p在区分乳腺癌与良性乳腺病变方面具有良好的诊断效能（图1B）。根据miR-362-3p表达中位值作为截断点，将182例乳腺癌患者分为miR-362-3p高表达组和低表达组。采用卡方检验分析不同临床因素与miR-362-3p表达水平之间的相关性。结果表明，miR-362-3p的表达水平与乳腺癌患者的组织学分级、TNM分期及淋巴结转移情况具有统计学关联。在miR-362-3p低表达组中，III级肿瘤患者、TNM III期患者以及存在淋巴结转移的患者比例均显著高于高表...

讨论

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，已成为威胁人类健康的重大公共卫生问题^19,20。其高发病率和高死亡率不仅给患者家庭带来严重的心理创伤，也给社会和经济带来巨大负担。大多数乳腺癌患者在确诊时已出现局部侵犯或远处转移^21,22，这显著增加了临床治疗的难度，并降低了患者的生存率。因此，早期、精准的筛查与诊断是改善乳腺癌患者预后的关键步骤。

多普勒超声已广泛应用于乳腺癌筛查、病灶定性诊断以及治疗后预后监测的全过程^23,24。然而，在良恶性乳腺病变的鉴别诊断中，多普勒超声仍存在一定的争议和局限性。主要原因是血流信号评估的特异性不足。大多数恶性乳腺肿块表现为丰富的血流信号，但部分良性病变也可出现血流信号，从而导致误诊或漏诊

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Vacutainer K2EDTA 血液采集管（紫色盖）	中国	367861	用于静脉采血及miRNA分析用血浆的制备。
CFX96 Touch 实时荧光定量PCR检测系统	Bio-Rad Laboratories	1855195	96孔6通道荧光定量PCR仪，采用光纤传导和冷CCD成像技术，可实现各孔同步无延迟荧光采集。动态范围达10个数量级，兼容常规qPCR和高分辨率熔解曲线（HRM）分析。软件支持RDML格式导出，适用于科研与临床检测，常用于基因表达定量、SNP分型和甲基化分析等实验。
Kirgen 0.1 mL PCR管（或8联排PCR管），无菌	中国上海	KG0811	用于qPCR反应的配制和扩增。
Kirgen 1.5 mL 微量离心管，无菌	Kirgen 生物科技有限公司	KG2911	用于miRNA提取和逆转录过程中的样品储存、试剂配制及离心操作。
miRcute miRNA提取试剂盒（离心柱法）	中国北京	DP501	用于从人血浆样本中分离纯化包含miRNA在内的总RNA，采用离心柱技术。
miRcute Plus miRNA第一链cDNA合成试剂盒	中国北京	KR211	通过poly(A)加尾法将纯化的miRNA逆转录为第一链cDNA。
miRcute Plus miRNA qPCR试剂盒（SYBR Green法）	中国北京	FP411	基于SYBR Green I化学法进行miRNA的实时荧光定量PCR检测。
Roche LightCycler 480 96孔多孔板，白色	德国曼海姆	4729692001	用于在Roche LightCycler 480仪器上进行实时荧光定量PCR实验。
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP 线阵探头	Siemens Healthineers	10041226	高频线阵探头，频率范围为5–14 MHz，专为乳腺、甲状腺等浅表器官检查设计，具有高分辨率和优异的组织对比度，支持弹性成像和自动乳腺容积扫描。
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000 超声系统	Siemens Healthineers	/	彩色多普勒超声诊断系统，支持实时3D/4D成像和弹性成像功能，广泛应用于腹部、心血管、妇产科及乳腺等多个科室。
Veriti 96孔梯度PCR仪	Thermo Fisher Scientific	4375786	96通道梯度PCR仪，支持梯度温度优化，具备高精度温控能力，用于cDNA合成和常规PCR扩增。