开发无细胞COPII囊泡重建方案，用于研究HEK-293细胞系统中的STING分选

摘要

该方案描述了一种优化的无细胞系统，用于重组STING纳入COPII囊泡，实现对内质网出口期间货物分拣的受控生化分析。

摘要

cGAS–STING通路是先天免疫的核心组成部分。激活后，内质网（ER）驻留蛋白STING被封装到COPII囊泡中，并运输到高尔基体以启动下游信号传导。尽管这一过程非常重要，但控制STING分选为COPII囊泡的分子机制仍未完全明了。本文介绍了COPII囊泡体 外 重组的优化工作流程，以便于对货物选择进行受控分析。描述了一种可扩展的方法，用于从HEK-293F悬浮细胞制备高浓度细胞质（30–40 mg/mL），并结合一种简单程序生成半透HEK-293T细胞作为定义的膜源。与传统的基于粘附单元的系统相比，这种方法提高了可扩展性，降低成本，并提高了重复性。以STING为模型载荷，通过Western blot分析验证了COPII囊泡芽出芽和货物掺入，在特定条件下基础包装效率约为20%。该系统允许对生化参数的受控操作，包括核苷酸刺激，以评估其对货物掺入的影响。该方案为研究COPII介导的货物分选提供了稳健且灵活的平台，并可扩展至研究其他跨膜蛋白及参与内质网输出的调控因子。

引言

cGAS-STING信号通路是先天免疫系统的基本机制，感应细胞质双链DNA（dsDNA），启动抗病毒反应。检测到dsDNA后，酶cGAS会产生环状二核苷酸cGAMP，作为第二信使结合STING ^1,2。关键是，STING在稳^{态条件下以}非活性二聚体形式存在于内质网（ER）中。其激活需要从内质网快速且高度调节的易位到高尔基体。正是在高基氏体，STING招募并激活下游激酶TBK1和IRF3，从而产生I型干扰素和促炎细胞因子⁴。

STING的运输由COPII包覆囊泡介导，囊泡是ER⁵蛋白质输出的通用载体。COPII涂层的组装——包括小型GTP酶Sar1、内层Sec23/24复合体和外层Sec13/31复合体——负责将ER膜变形为囊泡，并选择性招募货物^6,7。Sec22b通过COPII⁸的Sec23/24复合体识别的结构表位被分类为COPII囊泡。其他货物包括p24家族和ERGIC标记ERGIC-53，这两者都依赖于C端的疏水φC基序来分^选9。相比之下，某些内质网锚定蛋白，如核糖蛋白I（RPN1），仍局限于内质网，作为内质网结构的标志，因为它们不通过COPII囊泡¹⁰运输。因此，在无细胞COPII囊泡重组实验中，Sec22b和p24常被视为COPII货物，而核糖蛋白则作为监测囊泡制剂中内质网污染的标志物。虽然COPII运输的一般机制已被充分表征，但触发激活STING选择性封存到这些囊泡中的具体分子线索仍然难以捉摸。理解这些分选机制至关重要，因为STING运输失调与多种自身免疫性和自身炎症疾病有关，如婴儿期发病的STING相关血管病变（SAVI）和COPA综合征¹¹。然而，在完整细胞中研究这些瞬时且高度动态的事件仍然具有技术挑战。

为应对这些挑战，开发了一种优化的无细胞重组系统，以探究COPII介导货物分拣的分子需求。虽然体外出芽检测长期以来一直是细胞生物学¹²的主流，但其广泛应用往往受限于制备高质量组分的高成本和复杂性。本研究引入了简化工作流程，利用HEK-293F悬浮细胞作为经济的活性细胞质来源，并以半透HEK-293T细胞作为强韧膜供体。无细胞COPII囊泡重组系统的整体工作流程如图1所示。 在该系统中，Sec22b作为阳性对照以确认货物被囊泡吸收，而RPN1则作为负向对照用于监测和排除内质网膜污染。本研究以STING作为概念验证货物，证明该系统有效模拟了STING分类中关键的生化方面。该平台提供了一种多功能且可扩展的工具，用于识别控制STING分选的细胞质因子和膜信号，并有望应用于研究多种其他囊泡运输途径。

方案

HEK-293F（RRID代码：CVCL_6642）和HEK-293T（RRID代码：CVCL_0063）细胞系来自北京协和医学院细胞资源中心。这两条细胞系均通过短串联重复序列（STR）谱系验证，确认无支原体污染。试剂和所用设备列于 材料表中。

本研究未涉及人类参与者或脊椎动物。因此，无需伦理批准。所有实验程序均按照机构生物安全指南进行。

1. HEK-293F细胞质的制备

1. 以1×10个^6细胞/ mL的HEK-293F细胞，100毫升定义的哺乳动物培养基，辅以1%青霉素-链霉素。将细胞培养在500毫升的锥形瓶中。
2. 将悬浮培养物置于37°C、含5%二氧化碳的摇晃培养箱中孵育60小时。
3. 在300 ×克 、4°C下离心提取细胞，浸泡5分钟。 使用自动单元计数器确定总单元格数。
4. 用50毫升冰冷磷缓冲生理盐水（PBS）清洗细胞沉淀。离心机在300 ×克 ，4°C下5分钟。
5. 将细胞沉淀重新悬浮于等量冰冷B88缓冲液中（20 mM HEPES，pH 7.3;250 mM山梨醇;150 mM醋酸钾;5 mM醋酸镁）。
6. 通过将悬浮液通过装有22号针头的5毫升注射器进行超过100次注射，将细胞冰上溶解。
7. 通过光学显微镜观察细胞裂解。在4°C下，用20,000 × 克离心分离10分钟，去除细胞残渣。
8. 将上清液转移到超速离心管中。离心机在 100,000 × g 下，4°C下离心1小时。
   注意： 确保超速离心管保持适当平衡，以防止设备损坏和安全隐患。
9. 收集澄清后的上清液。使用3千道尔达分子量截止量（MWCO）超滤装置，在4°C下以4000 ×克 进行浓缩。
10. 使用双碳酸（BCA）测定法测量蛋白质浓度。将浓度调整为30–40 mg/mL。
    注意： 使用适当的保护设备处理液氮，以避免低温伤害。
11. 用细胞质来分量。将这些分液置于液氮中快速冷冻，并储存在−80°C（见图2A）
    注意： 避免冻融循环超过两次。将分割卷存放于−80°C，保存最长可达6个月。

2. 制备 半透化HEK-293T细胞

1. 在15毫升DMEM中，涂装HEK-293T细胞，表达全长人类STING细胞，密度为3×10个^6个细胞 ，每15厘米皿，辅以10%胎儿牛血清和1%青霉素-链霉素。在37°C与5%二氧化碳温度下孵育48小时。
2. 在约60%的汇聚度下采集细胞。
3. 抽取培养基，并用10毫升冰冷PBS清洗细胞两次。
4. 加入2毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA。在室温下培养2–3分钟以分离细胞。
5. 添加200微升大豆胰蛋白酶抑制剂（1 mg/mL）以阻止胰蛋白酶化。将细胞重新悬浮在10毫升冰冷KHM缓冲液中（20 mM HEPES，pH 7.2;110 mM醋酸钾;2 mM醋酸镁）。
6. 用离心法在250 ×克 下沉淀细胞，浸泡3分钟。丢弃上清液。
   注意： 去吉顿是有毒的。在排气柜内处理，配备适当的个人防护装备。
7. 将细胞重新悬浮在6毫升冰冷KHM缓冲液中。加入6微升地吉托宁液（DMSO中40 mg/mL）。
8. 用倒置轻柔混合。冰上孵育5分钟。
9. 加入8毫升KHM缓冲液稀释地基酮。在250 ×克 离心机下3分钟采集渗透细胞。
10. 将沉淀再悬浮于14毫升冰冷HEPES缓冲液中（50 mM HEPES，pH 7.3;90 mM醋酸钾）。在冰上孵育10分钟。
11. 离心机在250×克下离心3分钟。将沉淀液重新悬浮于1毫升冰冷KHM·氯缓冲液（20 mM HEPES，pH 7.3;110 mM KCl;2 mM MgCl₂）。
12. 离心机压力为10,000 g× 15秒。丢弃上清液。
13. 将沉淀液重新置于50微升KHM·氯联缓冲。使用BCA测定法测量蛋白质浓度，并调整至5–7 mg/mL。

3. 游细胞COPII囊泡重建实验

1. 准备材料 表中列出的所有试剂。分额并储存在−80°C。
2. 制备一个50微升反应混合物，含110 mM KCl、20 mM HEPES（pH 7.2）、2 mM MgCl₂、蛋白酶抑制剂组合（1×）、0.2 mM GTP，以及一个ATP再生系统（40 mM肌酸磷酸，0.2 mg/mL肌酸磷酸酶，1 mM ATP）。
3. 将cGAMP加入最终浓度10微米。在室温下培养反应15分钟。
4. 添加50微克半通HEK-293T细胞。轻轻搅拌。
5. 添加80微克HEK-293F细胞质以启动囊泡形成。在37°C下孵育45分钟。
6. 将反应冰冻以终止出芽。离心机在 12,000×克 ，4摄氏度下进行20分钟。
7. 收集含有囊泡的上清液。保留含有细胞器的沉淀。
8. 在100,000 × g 下，4°C下对上清液进行超速离心1小时。 将囊泡沉淀重新悬浮在30微升蛋白质加载缓冲液中。
9. 在95°C下加热采样5分钟。在20,000 ×克 离心机下离心5分钟以去除沉淀物。
10. 进行SDS-PAGE并将蛋白质转移到PVDF膜上。带有针对Sec22b、STING和RPN1抗体的探针。

结果

在HEK-293F细胞质制备过程中，评估了两个参数以评估细胞质质量。HEK-293F细胞在高密度下培养，得到高蛋白浓度的细胞质提取物。此外，通过光学显微镜评估注射器切割后细胞破坏的程度，确认在该条件下细胞溶解效率（见图2B）。

为生成半透HEK-293T细胞，培养物采集约为60%的汇聚率。此时，细胞器分布均匀且形态完整，显微镜观察到，为囊泡重建检测提供了合适的膜源（见图3）。

利用该优化系统，研究了STING信号与囊泡运输之间的耦合。如本工作流程所述，样本被分馏为全细胞器、囊泡组和上清液组分以供后续分析（图4A，B）。在游离COPII囊泡重建后，样本通过SDS-PAGE分辨并转移到PVDF膜进行Western blot分析。分析了三种COPII货运类...

讨论

体外中关键生化反应的重建为无细胞系统奠定了基础，这些系统在众多里程碑式发现中发挥了关键作用。其中包括鉴定cGAS作为细胞质DNA传感器^14,15，阐明细胞色素c在凋亡中的作用，以及发现首个组蛋白去甲基化酶JHDM1^16,17。这种明确的生化方法对于剖析STING运输中紧密耦合的步骤尤为有效，从其从内质网（ER）排出到到达高基氏体，这一过程对先天免疫信号传导至关重要。

本研究开发并验证了一种优化的无细胞COPII囊泡重组系统，并以STING为模型货物进行了验证。该工作流程解决了研究STING资源资源导出相关的若干挑战。首先，使用HEK-293F悬浮细胞提取的细胞质，提供了可扩展且可重复的COPII组分来源。这对STING研究尤为重要，因为HEK-293细胞是cGAS–...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5毫升无菌注射器	我们	V526273	用于机械细胞裂解
腺苷5′三磷酸（ATP）	MCE	HY-B2176	水中100毫米库存，pH值7.3，储存为负值;80 & dg;C
Adobe 插画师	Adobe 系统公司	SCR_010279	用于创建概念性插图和示意图
ATP再生系统（10次以上）	—	—	含有肌酸磷酸、肌酸激酶和ATP的能量再生混合物
BCA蛋白质检测套件	赛莫飞舍尔	23227	比色蛋白测定
生物渲染	生物渲染	SCR_018361	用于创建概念性插图和示意图
BSA	双源	BN20815	阻断试剂
二氧化碳摇晃孵化器	志初	ZCZY-CS8	维持温度、二氧化碳<>2层及搅拌以供悬浮培养
CO2 孵化器	赛莫飞舍尔	3110	维持粘附培养的温度和COs2
传统显微镜	奥林匹斯	CX43	用于评估细胞裂解和形态
肌酸激酶	罗什	CKRO	缓冲液中20 mg/mL存货，储存为负值;80 & dg;C
肌酸磷酸	罗什	CRPHO-RO	ATP再生系统的组成部分
桌面离心机	埃彭多夫	5810R	用于低速离心
去码托宁	西格玛	D5628	DMSO中40 mg/mL的存量，储存为负值;20 & deg;C
DMEM	科宁	10-013-CMR	HEK-293T细胞培养基
D-山梨醇	桑贡	A100691	1 M存液浸于水中，储存在4 & 度;C
ECL检测试剂	双源	BN16009	化学发光基底
电泳罐	生物辐射	1658001	SDS-PAGE 的装置
胎儿牛血清（FBS）	科宁	35-015-CV	血清补充剂
固定角转子（TFT 80.2）	赛莫飞舍尔	54456	超速离心转子
FreeStyle 293-F 单元	赛莫飞舍尔	R79007	用于细胞质制备
山羊抗老鼠IgG（H+L）	Invitrogen	31430	HRP结合二级抗体
山羊抗兔IgG（H+L）	Invitrogen	31460	HRP结合二级抗体
GraphPad 棱镜	GraphPad 软件	SCR_002798	用于进行统计分析（单向方差分析）并生成图4D中的定量条形图。
鸟苷5′-三磷酸（GTP）	MCE	HY-113225	水中10毫毫米库存，pH值7.3，储存为负值;80 & dg;C
表达人类刺痛的HEK-293T细胞	—	—	内部生成;用作膜源
HEPES缓冲液（1 M，pH 7.3）	碧昂泰姆	C0215	溶液制备用缓冲剂组件
成像系统	生物辐射	12003153	用于信号检测
醋酸镁四水合物	汉普顿研究	HR2-561	B88制备缓冲成分
六水酸盐氯化物	汉普顿研究	HR2-559	缓冲分量
微离心机	埃彭多夫	5420R	用于中速离心
微离心机	埃彭多夫	5420	用于常规离心
纳米滴光度计	赛莫飞舍尔	840-317400	用于蛋白质定量
OPM-CD Trans293 介质	人事管理局	P82019	HEK-293F悬浮培养的无血清培养基
青霉素&达什;链霉素（100次以上）	服务简介	G4003	细胞培养用抗生素补充剂
苯甲基磺酰氟化物（PMSF）	桑贡	A610425	蛋白酶抑制剂
磷酸酶抑制剂	实验室	C0104	防止蛋白质去磷酸化
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	服务简介	G4202	洗涤槽缓冲
醋酸钾	西格玛	236497	1 M存液浸于水中，储存在4 & 度;C
电源	生物辐射	1645052	为电泳提供电压
蛋白酶抑制剂鸡尾酒，无EDTA	罗什	4693132001	广谱蛋白酶抑制剂混合物
PVDF膜	米利波尔	ISEQ00010	用于西方印迹的膜
RPN1抗体（兔子单抗抗体）	阿布卡姆	AB197888	内质地标记
SDS-PAGE凝胶（4–20%)	—	—	用于蛋白质分离
SDS-PAGE 加载缓冲区（5×）	太阳生物	P1040	蛋白质样品制备缓冲液
Sec22b抗体（兔子单抗抗体）	阿布卡姆	AB181076	COPII货物标记
大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）	西格玛	T9128	1 mg/mL PBS存量，储存为负值;20 & deg;C
STING抗体（兔子单抗抗体）	CST	13647	一级抗体
TBST 缓冲区	服务简介	G0004	用于免疫印迹的洗涤缓冲液
热循环器	生物辐射	186-1096	用于加热和孵化
恒温金属浴	DLAB	5062102100	保持恒定温度
转移单元	生物辐射	1703930	用于蛋白质转移
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	服务简介	G4011	用于细胞分离
超速离心机	赛莫飞舍尔	75000100	用于高速离心
超速离心管（2毫升）	赛莫飞舍尔	54460	支持超速离心的管子
超滤管（4 mL，10 kDa MWCO）	米利波尔	UFC8010	用于细胞质浓度