基于免疫荧光法检测卵巢癌细胞核内RAD51焦点以评估同源重组修复的实验方法

摘要

RAD51 核内焦点是同源重组（HR）活性的标志物。本文描述了一种简单的免疫荧光方法，用于检测癌细胞中的这些焦点，从而评估 HR 功能，并支持对 DNA 损伤剂反应的临床前研究。

摘要

RAD51 是同源重组（HR）通路中的核心蛋白，对DNA双链断裂（DSBs）的准确修复至关重要。在DSB形成后，DNA末端切除产生单链DNA底物，促进RAD51在损伤位点的募集及其核蛋白丝的组装。该过程导致细胞核内形成离散的RAD51焦点结构，这些焦点被广泛用作HR活性的功能性读出指标，也是HR功能完整性的替代标志物。由于HR缺陷在多种恶性肿瘤中较为常见，尤其是卵巢癌和乳腺癌，因此对RAD51焦点形成的评估已成为评价DNA修复能力以及预测肿瘤对DNA损伤类治疗（如铂类化合物和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂）反应的重要手段，这些药物的疗效显著依赖于HR修复状态。本文描述了一种基于免疫荧光的简单、可靠且可重复的实验方案，用于检测和定量培养的卵巢癌细胞中细胞核内的RAD51焦点。该方法包括通过电离辐射（IR）诱导DNA损伤，随后进行固定、使用抗RAD51和γH2AX抗体进行免疫染色、共聚焦显微镜观察，以及对RAD51/γH2AX共定位焦点的手动定量分析。该方案可用于基础条件下的检测，也可在基因或药物干预后应用，以评估这些干预对HR功能的影响。代表性结果表明，在DNA损伤后，HR功能完整的卵巢癌细胞中RAD51焦点显著诱导形成；而在DSB水平相当的情况下，RAD51的缺失则显著减少焦点的形成，从而验证了该检测方法的特异性。总体而言，该方案提供了一种稳健且可重复的功能性检测手段，可用于评估HR功能状态，在临床前乃至转化性癌症研究中具有广泛的应用前景。

引言

DNA 双链断裂（DSBs）是最严重的 DNA 损伤形式之一，因为不准确的修复可能破坏基因组稳定性，并导致肿瘤发生或细胞死亡^1,2,3。为了应对这些威胁，细胞采用多种 DNA 修复通路，包括同源重组（HR），该机制被认为是修复 DSBs 最精确的方式^2,4,5。与易出错的修复通路不同，HR 利用同源 DNA 序列作为模板，在损伤位点恢复遗传信息。因此，HR 主要在细胞周期的 S 期和 G2 期发挥作用，此时姐妹染色单体可作为修复模板^2,5。值得注意的是，HR 对于准确修复内源性因素（如复制应激）以及外源性损伤（包括电离辐射（IR）和 DNA 损伤性化疗药物）所引发的 DSBs 至关重要^2,5.

RAD51 是同源重组（HR）通路的核心效应蛋白，在 DSBs 介导的 HR 修复过程中的同源性搜索和链侵入中发挥关键作用²

方案

本方案中使用的所有材料和试剂均列于材料表中，包括生产厂家信息、目录编号以及抗体稀释比例。图1展示了本方案的总体流程。

注意：本方案中使用的卵巢癌细胞系为 OVCAR-8 和 ABT^R2，这些细胞系此前已有描述^{15,16,17,18,19,20}。OVCAR-8 细胞由 Larry Karnitz 博士（梅奥诊所）惠赠，其最初来源于 Dominic Scudiero 博士（美国国家癌症研究所，美国国立卫生研究院）。ABT^R2 细胞由 Scott Kaufmann 博士（梅奥诊所）惠赠²⁰。ABT^R2 是一种对 PARP 抑制剂（PARPi）耐药的细胞系，源自携带 BRCA2 基因突变的卵巢癌细胞系 PEO1，其耐药性通过恢复 BRCA2 的表达而获得。由于 BRCA2....

结果

电离辐射在 OVCAR-8 细胞中诱导 DNA 双链断裂处形成 RAD51 焦点
为了功能性评估同源重组（HR）活性，在通过电离辐射（IR）诱导 DNA 双链断裂后，检测了同源重组功能完整的 OVCAR-8 卵巢癌细胞中 RAD51 焦点的形成。为建立检测的特异性，并证实所观察到的焦点代表真正的依赖 RAD51 的同源重组事件，细胞在 IR 处理前分别转染了非靶向对照 luciferase siRNA（siLUC）或靶向 RAD51 的 siRNA（siRAD51）^15,16,17。

在无电离辐射（IR）的情况下，转染siLUC和siRAD51的OVCAR-8细胞均表现出极少的γH2AX和RAD51焦点，表明在未受应激条件下基础DNA损伤水平较低，且.......

讨论

本文所述基于免疫荧光法检测细胞核内RAD51灶性聚集，为评估培养的卵巢癌细胞中同源重组（HR）活性提供了一种可靠且功能性的方法。与通过基因组或转录组分析间接推断HR状态的方法不同，RAD51灶的形成直接反映了细胞在DNA双链断裂（DSB）位点招募并组装核心HR机制的能力。因此，该检测方法可作为DNA损伤后HR功能状态的敏感读出手段，适用于研究HR修复调控机制或治疗反应的机理性研究。本方案中采用电离辐射（IR）诱导可控且可重复水平的DSB，从而引发γH2AX形成及随后的RAD51募集。选用6 Gy剂量并设置6小时恢复期，已优化至可在活跃的HR修复过程中捕获RAD51灶形成的峰值²¹。这些参数可能需根据细胞类型、增殖速率或基础DNA修复能力进行调整，当将该方案应用于其他细胞系模型时，建议进行条件优化。

该实验的成功实施需考虑若干关键技术要点。固定和通透条件必须在保持细胞核结构完整性的同时，允许抗体充分渗透；因为固定条件不佳可能导致RAD51染色弥散或信号微弱。此外，使用高质量且经过充分验证的RAD51抗体至关重要，非特异性核染色会干扰焦点.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 聚丙烯酰胺凝胶配方（下层胶缓冲液 20 ml，ddH2O 33.4 mL，30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）26.6 mL，10% 过硫酸铵（新鲜配制）200 µL  TEMED 70 µL）	自制	NA	SDS-PAGE 分离胶
10% 聚丙烯酰胺凝胶配方（上层胶缓冲液 10 mL，ddH2O 23.6 mL，30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）6.4 mL，10% 过硫酸铵（新鲜配制）160 µL  TEMED 40 µL）	自制	NA	SDS-PAGE 浓缩胶
100 mL 胰蛋白酶 EDTA 1×，含 0.25% 胰蛋白酶/2.21 mM EDTA 的碳酸氢钠溶液	Corning	25-053-C1	用于常规传代及细胞接种前使贴壁细胞脱落
10× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Bio-Rad	1610780	稀释至 1× 后用于洗涤步骤、封闭液、抗体稀释、固定和通透处理
10× 电泳缓冲液（6 L）：Tris 181.8 g + 甘氨酸 864.0 g + SDS 60 g	自制	NA	用于在凝胶中电泳分离蛋白质样品
10× 转膜缓冲液（6 L）：Tris 181.8 g + 甘氨酸 864 g	自制	NA	用于将蛋白质从凝胶转移至膜上
10× Tris 缓冲盐水	Bio-Rad	1706435	缓冲液
30% （w/v）丙烯酰胺；0.8（w/v）/双丙烯酰胺储存液（37.5:1）	Ultrapure EC-890	EC-890	用于 SDS-PAGE
ABTR2 细胞	梅奥诊所（Mayo Clinic）	NA	获得性 PARP 抑制剂耐药的卵巢癌细胞系
AKT 裂解缓冲液配方（50 mM HEPES（pH 7.6），150 mM NaCl，1 mM EDTA，1% Triton X-100，10 mM NaF，30 mM 焦磷酸钠，1 mM Na3VO4，10 mM 2-磷酸甘油，10 μg/mL 亮抑蛋白酶肽，5 μg/mL 抑肽酶，5 μg/mL 胃蛋白酶抑制剂，以及 20 mM 微囊藻毒素-LR）	自制	NA	细胞裂解缓冲液
过硫酸铵	Bio-Rad	16107000	分子生物学中用作凝胶聚合的氧化剂，作为自由基引发剂
抗磷酸化组蛋白 H2A.X（Ser139）抗体，克隆 JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	一抗，用于检测 γH2AX 焦点，使用稀释比例为 1:1000
抗 Rad51（Ab-1）兔多克隆抗体	Sigma-Aldrich	PC130	一抗，用于检测作为同源重组活性标志的 RAD51 核焦点，使用稀释比例为 1:1000
无蛋白酶牛血清白蛋白	GoldBio	A-420-250	用于配制封闭液（PBS 中含 5% BSA），以减少免疫荧光染色过程中非特异性抗体结合
ChemiDoc 成像系统	Bio-Rad	12003154	成像系统
共聚焦激光扫描显微镜	ZEISS	Zeiss LSM 780	用于免疫荧光成像、γH2AX 焦点分析、RAD51 焦点定量、蛋白共定位及三维图像采集
Countess II FL 自动细胞计数仪	Life Technologies	AMQAF1000	自动细胞计数仪
盖玻片	Cardinal Health	M6045-10A	覆盖在封片样本上，以保护染色细胞并实现高分辨率成像
ECM 830 方波电穿孔系统	Hbio-BTX	45-2052	适用于哺乳动物细胞基因递送的电穿孔系统
胎牛血清	Corning	35-010-CV	添加至 RPMI-1640 培养基中（终浓度 8%），以支持细胞生长和存活
甘氨酸	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	缓冲液
山羊抗小鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	二抗，用于检测 γH2AX 一抗，使用稀释比例为 1:350
山羊抗兔 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	二抗，用于检测 RAD51 一抗，使用稀释比例为 1:350
GraphPad Prism	GraphPad Software	version 10.6.1	用于统计分析、图表生成和数据可视化
HEPES 1 M	Corning	25060-C1	用于维持 pH 在 7.2–7.6 范围内的缓冲液
Hoechst 33342 溶液（20 mM，5 mL）	Thermo Fisher Scientific	62249	用于细胞核染色
辣根过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白 G	Cell Signaling Technology	7076S	二抗，用于 Western 印迹中检测小鼠（β-actin）一抗
辣根过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白 G	Cell Signaling Technology	7074S	二抗，用于 Western 印迹中检测兔一抗（RAD51）
即溶脱脂奶粉	Hyvee	G461A323	封闭试剂
Laemmli 样品缓冲液（4×）	Bio-Rad	1610747	样品缓冲液
Lonza MycoAlert 支原体检测试剂盒	Lonza Bioscience	LT07-218	用于常规确认细胞培养物无支原体污染
下层胶配方（1 L）：Tris 181.7 g + SDS 4.0 g，用浓 HCl 调 pH 至 8.8	自制	NA	SDS-PAGE 分离胶
小鼠单克隆抗 β-肌动蛋白抗体	Abcam	ab8226	一抗，用于 Western 印迹中检测 β-actin 作为上样对照
非靶向对照荧光素酶 siRNA（siLUC）：5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′	Horizon Discovery	NA	工作浓度为 20 nmol
Nunc Lab Tek II，8 孔带盖玻片玻璃培养皿，无菌	Thermo Fisher Scientific	154534	用于细胞接种和培养，以进行免疫荧光染色和共聚焦成像
OVCAR-8 细胞	美国国家癌症研究所（NIH）	NA	卵巢癌细胞系
16% 甲醛水溶液，电镜级	Electron Microscopy Sciences	15710-S	稀释至 3% 后用于免疫荧光染色前的细胞固定
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36930	用于封片并保持共聚焦成像过程中的荧光信号
蛋白酶抑制剂	Roche / Sigma-Aldrich	11836170001	蛋白酶抑制剂混合物
蛋白检测试剂浓缩液	Bio-Rad	5000006	蛋白质定量
PVDF 膜（Immobilon-P，0.45 µm）	Millipore	IPVH00010	转膜用膜
RAD51 siRNA（siRAD51）：5′-GGGAUUUGUGAAGCCAAA-3	Horizon Discovery	NA	工作浓度为 20 nmol
RPMI-1640（含 L-谷氨酰胺和葡萄糖）	Corning	10-041-CV	用作培养卵巢癌细胞系（OVCAR-8 和 ABTR2）的基础生长培养基
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	S271-500	缓冲液
十二烷基硫酸钠（SDS）	Bio-Rad	1610302	缓冲液
氟化钠	Sigma-Aldrich	S7920	磷酸酶抑制剂
正钒酸钠	Sigma-Aldrich	S6508-50G	磷酸酶抑制剂
焦磷酸钠十水合物	Sigma-Aldrich	221368	缓冲液
磷酸甘油钠五水合物β	Thermo Scientific Chemicals（原 Alfa Aesar）	L03425.22	磷酸酶抑制剂
SuperSignal™ West Pico PLUS 化学发光底物	Thermo Fisher Scientific	34580	检测系统
TEMED 50 mL	Bio-Rad	1610801	在分子生物学中与 10% APS 配合使用，作为聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化剂
Topcoat 快干透明指甲油	Electron Microscopy Sciences	72180	用于密封盖玻片边缘，防止封片样本干燥或移动
Triton X-100	Bio-Rad	1610407	用于固定细胞的通透处理，使抗体能够进入细胞核蛋白
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379-1L	缓冲液
UltraPure EDTA	Thermo Fisher Scientific	15576028	二价金属阳离子螯合剂，适用于生物化学或分子生物学应用
上层胶配方（1 L）：Tris 60.6 g + SDS 4.0 g，用浓 HCl 调 pH 至 6.8	自制	NA	SDS-PAGE 浓缩胶
Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜	Carl Zeiss, Germany	NA	用于获取高分辨率共聚焦图像，以可视化和定量分析 RAD51 和 γH2AX 核焦点
β-巯基乙醇	Bio-Rad	1610710	还原剂