基于免疫荧光法检测卵巢癌细胞核内RAD51焦点以评估同源重组修复的实验方法

摘要

RAD51 核内焦点是同源重组（HR）活性的标志物。本文描述了一种简单的免疫荧光方法，用于检测癌细胞中的这些焦点，从而评估 HR 功能，并支持对 DNA 损伤剂反应的临床前研究。

摘要

RAD51 是同源重组（HR）通路中的核心蛋白，对DNA双链断裂（DSBs）的准确修复至关重要。在DSB形成后，DNA末端切除产生单链DNA底物，促进RAD51在损伤位点的募集及其核蛋白丝的组装。该过程导致细胞核内形成离散的RAD51焦点结构，这些焦点被广泛用作HR活性的功能性读出指标，也是HR功能完整性的替代标志物。由于HR缺陷在多种恶性肿瘤中较为常见，尤其是卵巢癌和乳腺癌，因此对RAD51焦点形成的评估已成为评价DNA修复能力以及预测肿瘤对DNA损伤类治疗（如铂类化合物和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂）反应的重要手段，这些药物的疗效显著依赖于HR修复状态。本文描述了一种基于免疫荧光的简单、可靠且可重复的实验方案，用于检测和定量培养的卵巢癌细胞中细胞核内的RAD51焦点。该方法包括通过电离辐射（IR）诱导DNA损伤，随后进行固定、使用抗RAD51和γH2AX抗体进行免疫染色、共聚焦显微镜观察，以及对RAD51/γH2AX共定位焦点的手动定量分析。该方案可用于基础条件下的检测，也可在基因或药物干预后应用，以评估这些干预对HR功能的影响。代表性结果表明，在DNA损伤后，HR功能完整的卵巢癌细胞中RAD51焦点显著诱导形成；而在DSB水平相当的情况下，RAD51的缺失则显著减少焦点的形成，从而验证了该检测方法的特异性。总体而言，该方案提供了一种稳健且可重复的功能性检测手段，可用于评估HR功能状态，在临床前乃至转化性癌症研究中具有广泛的应用前景。

引言

DNA 双链断裂（DSBs）是最严重的 DNA 损伤形式之一，因为不准确的修复可能破坏基因组稳定性，并导致肿瘤发生或细胞死亡^1,2,3。为了应对这些威胁，细胞采用多种 DNA 修复通路，包括同源重组（HR），该机制被认为是修复 DSBs 最精确的方式^2,4,5。与易出错的修复通路不同，HR 利用同源 DNA 序列作为模板，在损伤位点恢复遗传信息。因此，HR 主要在细胞周期的 S 期和 G2 期发挥作用，此时姐妹染色单体可作为修复模板^2,5。值得注意的是，HR 对于准确修复内源性因素（如复制应激）以及外源性损伤（包括电离辐射（IR）和 DNA 损伤性化疗药物）所引发的 DSBs 至关重要^2,5.

RAD51 是同源重组（HR）通路的核心效应蛋白，在 DSBs 介导的 HR 修复过程中的同源性搜索和链侵入中发挥关键作用^2,5。DSB 形成后，DNA 末端经历切除过程，该过程由 MRE11–RAD50–NBS1（MRN）复合物及相关因子启动，产生 3′ 单链 DNA 突出端。这些单链区域最初被复制蛋白 A（RPA）包裹，以防止二级结构形成并稳定修复中间体^4,5,6。随后，在 BRCA1、PALB2 和 BRCA2 的协同作用下启动 HR，这些蛋白促进 RAD51 被招募并加载到已切除的 DNA 上，取代 RPA，并促进含 RAD51 的核蛋白丝状结构的形成^4,5,6。一旦组装完成，这些丝状结构会搜索姐妹染色单体内的同源 DNA 序列，并催化链交换，从而实现对受损 DNA 的准确修复^4,5,6。RAD51 在 DSB 位点的聚集在显微镜下表现为点状核焦点，可通过免疫荧光检测^7,8,9,10。由于这些焦点的形成反映了 HR 机制的成功激活，RAD51 焦点分析已成为评估细胞 HR 能力和 DNA 修复功能的常用方法^7,8,9,10。重要的是，该检测方法测量的是细胞在 DNA 损伤后执行 HR 反应的能力，而不仅仅依赖于 HR 相关基因或蛋白的表达水平。

同源重组（HR）缺陷在癌症中经常被观察到，尤其是在携带BRCA1、BRCA2、RAD51 旁系同源基因或其他参与HR通路的基因发生改变的肿瘤中，这类缺陷在卵巢癌和乳腺癌中尤为常见^{4,11,12,13,14}。HR缺陷具有重要的治疗意义，因其通过合成致死效应使肿瘤细胞对DNA损伤剂（如铂类化疗药物）以及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂表现出更高的敏感性^{4,11,12,13,14,15}。因此，可靠的功能性检测方法用于评估HR活性，对于机制研究和转化医学研究均至关重要。

本方案描述了一种基于免疫荧光的检测与定量方法，用于检测DNA损伤后卵巢癌细胞中核内RAD51灶状聚集物的形成。该实验流程包括利用电离辐射（IR）诱导DNA双链断裂（DSBs），随后通过免疫荧光技术检测RAD51和γH2AX，并利用共聚焦显微镜对共定位的核灶状结构进行定量分析。本方案以同源重组（HR）功能完整的OVCAR-8细胞及获得性PARP抑制剂耐药的ABT^R2细胞为例进行演示，提供了一种可重复的功能性方法，用于评估DSB形成后的HR活性。尽管RAD51灶状结构分析被广泛用作HR活性的功能性指标，但现有方法通常局限于特定实验条件，且常缺乏关于可控DNA损伤诱导、DNA双链断裂形成确认、实验验证对照以及标准化图像定量分析的详细指导。此外，其他评估HR功能的方法，如基因组疤痕检测、突变特征分析以及基因或蛋白表达分析，仅能间接反映HR状态，无法直接评估细胞将RAD51募集至DNA损伤位点的能力。基于报告基因的检测方法（如DR-GFP）虽可直接测量HR活性，但需要稳定的基因工程改造，难以广泛适用于多种实验模型。因此，本文所述流程结合了电离辐射诱导的DNA损伤与双标记RAD51/γH2AX免疫荧光染色，可同时验证DSB的形成并定量RAD51在受损染色质上的募集情况。该方法提供了一种实用、生物学相关性强且适用范围广泛的直接功能性评估手段，可用于培养的癌细胞中HR功能的评估，同时整合了实验对照、验证步骤以及标准化的灶状结构定量流程。

方案

本方案中使用的所有材料和试剂均列于材料表中，包括生产厂家信息、目录编号以及抗体稀释比例。图1展示了本方案的总体流程。

注意：本方案中使用的卵巢癌细胞系为 OVCAR-8 和 ABT^R2，这些细胞系此前已有描述^{15,16,17,18,19,20}。OVCAR-8 细胞由 Larry Karnitz 博士（梅奥诊所）惠赠，其最初来源于 Dominic Scudiero 博士（美国国家癌症研究所，美国国立卫生研究院）。ABT^R2 细胞由 Scott Kaufmann 博士（梅奥诊所）惠赠²⁰。ABT^R2 是一种对 PARP 抑制剂（PARPi）耐药的细胞系，源自携带 BRCA2 基因突变的卵巢癌细胞系 PEO1，其耐药性通过恢复 BRCA2 的表达而获得。由于 BRCA2 表达的恢复重新建立了 RAD51 的加载以及同源重组（HR）活性，因此 ABT^R2 细胞可作为同源重组功能完整（HR-proficient）的代表性模型。细胞系的身份通过来源信息及文献中已报道的特征进行验证^{15,16,17,18,19,20}。实验使用低代次细胞（第 3–12 代），解冻后培养时间不超过 1 个月。每 6 个月使用支原体检测试剂盒对细胞系进行常规支原体污染检测，本研究中所用的所有培养物均确认无支原体污染。

注意：多聚甲醛具有毒性，应在经认证的化学通风橱内配制和操作，并穿戴适当的个人防护装备。人源性细胞系应根据机构的生物安全规程，采用适当的 containment 操作规范进行处理。Triton X-100、封片剂和指甲油应按照制造商的安全建议进行操作。电离辐射（IR）仅可由经过培训的人员操作，并须遵守机构的辐射安全政策。化学、生物和放射性相关废弃物应根据当地机构和监管要求进行处置。

1. 细胞培养与维持

1. 在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中，使用添加了8%胎牛血清的RPMI-1640生长培养基培养细胞。
   注意：这些培养条件与我们先前对OVCAR-8和ABT^R2细胞研究所采用的条件一致^{15,16,17,18,19}。在这些条件下，两种细胞系均表现出旺盛的生长状态以及可重复的DNA损伤应答表型。
2. 如需要，可在优化的实验条件下进行干预处理（例如基因敲低/敲除）^15,17。
   注意：本方案中以siRNA介导的RAD51基因敲低为例，说明免疫荧光分析前的典型基因干预操作。
   1. 将5 × 10⁶个细胞重悬于180 µL含8%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。
   2. 加入20 µL浓度为20 µM的siRNA溶液（每转染体系终浓度为2 µM siRNA），轻轻混匀。
      注意：使用以下siRNA序列：非靶向对照荧光素酶siRNA（siLUC）：5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′；RAD51 siRNA（siRAD51）：5′-GGGAUUUGUGAAGCCAAA-3′。所有siRNA均购自Horizon Discovery。
   3. 将细胞悬液转移至4 mm电穿孔比色皿中。
   4. 使用BTX ECM 830电穿孔仪，在280 V条件下施加两个持续10 ms的脉冲进行电穿孔。
   5. 将细胞转移至完全生长培养基中，在10 cm培养皿中按标准培养条件孵育24 h。
   6. 按照步骤1.2.1–1.2.4所述相同条件重复一次siRNA电穿孔操作。
   7. 将细胞继续在15 cm培养皿中按标准培养条件孵育额外48 h。
   8. 取部分细胞用于后续免疫荧光检测（见步骤2）。剩余细胞保留用于通过免疫印迹验证RAD51敲低效果。
   9. 通过免疫印迹验证RAD51敲低效果
      1. 使用预冷的裂解缓冲液裂解细胞，缓冲液组成为：50 mM HEPES（pH 7.6）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1% Triton X-100、10 mM NaF、30 mM焦磷酸钠、1 mM Na₃VO₄、10 mM β-甘油磷酸钠以及蛋白酶抑制剂混合物（每10 mL裂解缓冲液加入1片）。
      2. 在4 °C下以18,800 × g离心5 min澄清裂解物，将上清转移至新的微量离心管中，并使用适当的蛋白定量方法测定蛋白浓度。
      3. 取适量蛋白裂解液与4× Laemmli上样缓冲液混合，使终浓度为1×。
      4. 加入β-巯基乙醇至终浓度20%，并在95 °C加热12 min，随后进行SDS-PAGE。
      5. 通过SDS-PAGE分离等量蛋白，并将蛋白转移至适合免疫印迹分析的膜上。
      6. 在室温下用5%脱脂奶粉封闭膜30 min，并持续振荡。
      7. 用1× TBST（含吐温20的Tris缓冲盐水）在室温下振荡洗涤膜三次，每次5 min。
      8. 在4 °C下用兔多克隆抗RAD51抗体（1:1,000稀释）或抗ACTIN抗体（1:1,000稀释）孵育膜16–18 h，并持续振荡。
      9. 用1× TBST在室温下振荡洗涤膜三次，每次5 min。
      10. 在室温下用辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔或抗小鼠IgG二抗（1:10,000稀释）孵育膜1 h，并持续振荡。
      11. 用1× TBST在室温下振荡洗涤膜三次，每次5 min，然后使用适当的化学发光检测方法显影免疫反应条带，并相对于转染非靶向对照siRNA的细胞确认RAD51蛋白的耗竭情况。

2. 细胞接种

1. 当细胞进入对数生长期（约70–80%融合度）时，吸除培养基，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞一次，以去除残留血清。
2. 加入足量0.25%胰蛋白酶–EDTA溶液覆盖单层细胞（例如，每T175培养瓶加入1–2 mL），于37 °C孵育2–5分钟，并在显微镜下观察细胞脱落情况。
3. 细胞脱落后，立即加入等体积含胎牛血清（FBS）的完全培养基以中和胰蛋白酶活性。
4. 将细胞悬液收集至15 mL锥形离心管中。
5. 接种前，使用台盼蓝排斥法结合血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞活力和浓度。
6. 用完全生长培养基制备浓度为4 × 10⁴ 个细胞/mL的单细胞悬液。
7. 向8孔玻璃腔载玻片的每个孔中接种200 µL细胞悬液，使每孔最终细胞密度为8,000个细胞。
8. 将腔载玻片置于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时，以促进细胞贴壁。
   注意： 接种细胞数量可能因细胞类型而异。建议额外多准备足够至少一个孔使用的细胞悬液，以补偿移液操作的变异性。每个实验条件应设置至少两个复孔，以确保结果可重复性。若需进行HR的药理学调控，应在细胞过夜贴壁后（接种后12–16小时）开始处理。应根据处理及后续分析时所需的融合度，结合药物对细胞增殖或活力的预期影响，适当调整接种密度。由于HR主要发生在细胞周期的S期和G2期，因此应维持细胞处于对数生长期，避免过度融合。对于可能影响细胞周期进程的实验，可进行EdU掺入、DNA含量分析或其他细胞周期检测，以辅助解释RAD51焦点结果。每次实验均应包括未处理（–IR）和经辐照（+IR）对照组，分别用于确定基础水平和DNA损伤诱导的RAD51焦点形成情况。若采用siRNA干扰实验，应包括非靶向对照siRNA（如siLUC）和靶基因特异性siRNA处理组（如siRAD51.）。在抗体优化过程中，建议设置无一抗对照和无二抗对照，以评估非特异性染色和背景荧光水平。

3. 通过电离辐射诱导DNA损伤

1. 将培养在腔室载玻片上的细胞暴露于6 Gy剂量的电离辐射²¹ 以诱导DNA双链断裂。
2. 立即将载玻片放回37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中。
3. 孵育细胞，照射后6小时。
   注意： 使用RS-2000生物辐照仪（工作条件：160 kV，25.0 mA，搁板位置5）进行电离辐射处理。细胞在室温下接受单次6 Gy剂量辐照（约4.8 Gy/min），随后立即放回37 °C、5% CO₂培养箱中恢复培养。辐照仪定期根据制造商建议进行校准，所有操作均遵循机构辐射安全指南。辐照后6小时的培养条件已有先前研究确立^15,17,22最佳时间可能因细胞类型而异，应针对每种细胞系进行优化。

4. 固定与通透处理

1. 小心吸去孔中的培养基，避免扰动细胞。
2. 用新鲜配制的含3%多聚甲醛的1× PBS在室温下固定细胞12分钟。
3. 轻轻吸去固定液，每孔加入500 µL 1× PBS，洗涤三次。
4. 用含0.2% Triton X-100的1× PBS在室温下对细胞进行通透处理，持续12分钟。
5. 用1× PBS洗涤孔内物质三次。
   注意： 进行固定、通透和洗涤步骤时，应沿每孔孔壁缓慢加入和移除溶液，动作轻柔，以尽量减少细胞脱落。除非另有说明，每次洗涤均使用500 µL 1× PBS。

5. 封闭

1. 将5% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）溶于1× PBS中，配制封闭液。
2. 将细胞在封闭液中于室温孵育60分钟，以减少非特异性抗体结合。

6. 一抗孵育

1. 移除封闭液，并用1× PBS洗涤细胞3次。
2. 用封闭液将一抗稀释至适当比例。使用兔多克隆抗RAD51抗体（1:1000）和鼠单克隆抗磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）抗体（1:1000），其中γH2AX作为DNA双链断裂（DSBs）的标志物^23,24。
3. 向每孔中加入100 µL稀释后的一抗溶液。
4. 将玻片置于湿盒中，室温孵育16–18 h，以防止蒸发。
   注意：两种一抗可混合于同一溶液中，实现同步染色。

7. 二抗孵育

1. 用封闭液将二抗稀释至适当比例。使用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（1:350）检测RAD51，使用Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG（1:350）检测γH2AX。
2. 吸除一抗溶液，用1× PBS洗涤细胞3次。
3. 每孔加入100 µL稀释后的二抗溶液。
4. 室温避光孵育1小时。
   注意：两种二抗可混合后同时使用以实现共检测。从本步骤开始，所有操作均需在避光环境中进行，以尽量减少荧光淬灭。

8. 细胞核复染与封片

1. 用1× PBS将Hoechst 33342溶液按1:1,000稀释，用于细胞核染色。
2. 吸除二抗溶液，用1× PBS洗涤细胞一次。
3. 将细胞与稀释后的Hoechst 33342溶液在室温下孵育90秒。
4. 吸除Hoechst 33342溶液，用1× PBS洗涤细胞三次。
5. 移除1× PBS，将上层小室从玻片上取下，每孔加入约25 µL抗荧光淬灭封片剂。
6. 将盖玻片覆盖在封片的细胞上，确保与封片剂均匀接触。
7. 轻柔去除气泡，并用指甲油密封边缘。
   注意：核复染可提供细胞核的参考定位，有助于准确识别和定量核内RAD51及γH2AX焦点。

9. DSB 处 RAD51 焦点的成像与定量分析

1. 立即成像或在避光条件下将载玻片置于4 °C的玻片盒中保存，直至进行分析。
   注意：为尽量减少潜在的信号降解和荧光淬灭，应尽快获取图像，最好在封片后1周内完成。
2. 使用共聚焦显微镜，配备适当的激光线和滤光片组合进行成像：Hoechst 33342（405 nm）标记细胞核，Alexa Fluor 488（488 nm）标记RAD51，Alexa Fluor 594（561/594 nm）标记γH2AX。
3. 采用高倍物镜进行共聚焦成像，以清晰分辨亚细胞结构。
4. 通过手动计数与γH2AX共定位的离散性细胞核内RAD51灶点进行定量分析；排除未与γH2AX共定位的灶点。
   注意：在定量分析前，需验证抗体性能，确认经电离辐射（IR）处理的对照细胞中出现RAD51和γH2AX的细胞核灶点，且在RAD51 siRNA处理后RAD51信号减少。仅对具有完整形态和清晰染色模式的细胞核中与γH2AX共定位的离散性RAD51灶点进行定量；排除弥散性或非细胞核染色、未共定位的RAD51信号、重叠或多个细胞核的细胞、有丝分裂细胞以及凋亡细胞。每次实验内保持一致的成像参数，并在所有实验条件下应用统一的手动评分标准。每个生物学重复中，从多个视野中分析约50个细胞核，并至少进行三次独立的生物学重复实验。采用适当的统计学方法报告每个细胞核中RAD51/γH2AX共定位灶点的数量。

10. 统计分析

1. 每种条件下定量分析约 50 个细胞核中 RAD51/γH2AX 共定位的焦点。
2. 数据以至少三次独立生物学重复实验的均值 ± 标准差表示。
3. 采用适当的统计学方法进行比较分析（例如，两组间比较使用非配对双尾 Student t 检验，多组间比较使用单因素方差分析）。
4. 认为 p. < 0.05 具有统计学显著性。
5. 使用 GraphPad Prism（版本 10.6.1）进行统计学分析和图表绘制。

结果

电离辐射在 OVCAR-8 细胞中诱导 DNA 双链断裂处形成 RAD51 焦点
为了功能性评估同源重组（HR）活性，在通过电离辐射（IR）诱导 DNA 双链断裂后，检测了同源重组功能完整的 OVCAR-8 卵巢癌细胞中 RAD51 焦点的形成。为建立检测的特异性，并证实所观察到的焦点代表真正的依赖 RAD51 的同源重组事件，细胞在 IR 处理前分别转染了非靶向对照 luciferase siRNA（siLUC）或靶向 RAD51 的 siRNA（siRAD51）^15,16,17。

在无电离辐射（IR）的情况下，转染siLUC和siRAD51的OVCAR-8细胞均表现出极少的γH2AX和RAD51焦点，表明在未受应激条件下基础DNA损伤水平较低，且...

讨论

本文所述基于免疫荧光法检测细胞核内RAD51灶性聚集，为评估培养的卵巢癌细胞中同源重组（HR）活性提供了一种可靠且功能性的方法。与通过基因组或转录组分析间接推断HR状态的方法不同，RAD51灶的形成直接反映了细胞在DNA双链断裂（DSB）位点招募并组装核心HR机制的能力。因此，该检测方法可作为DNA损伤后HR功能状态的敏感读出手段，适用于研究HR修复调控机制或治疗反应的机理性研究。本方案中采用电离辐射（IR）诱导可控且可重复水平的DSB，从而引发γH2AX形成及随后的RAD51募集。选用6 Gy剂量并设置6小时恢复期，已优化至可在活跃的HR修复过程中捕获RAD51灶形成的峰值²¹。这些参数可能需根据细胞类型、增殖速率或基础DNA修复能力进行调整，当将该方案应用于其他细胞系模型时，建议进行条件优化。

该实验的成功实施需考虑若干关键技术要点。固定和通透条件必须在保持细胞核结构完整性的同时，允许抗体充分渗透；因为固定条件不佳可能导致RAD51染色弥散或信号微弱。此外，使用高质量且经过充分验证的RAD51抗体至关重要，非特异性核染色会干扰焦点...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 聚丙烯酰胺凝胶配方（下层胶缓冲液 20 ml，ddH2O 33.4 mL，30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）26.6 mL，10% 过硫酸铵（新鲜配制）200 µL  TEMED 70 µL）	自制	NA	SDS-PAGE 分离胶
10% 聚丙烯酰胺凝胶配方（上层胶缓冲液 10 mL，ddH2O 23.6 mL，30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（29:1）6.4 mL，10% 过硫酸铵（新鲜配制）160 µL  TEMED 40 µL）	自制	NA	SDS-PAGE 浓缩胶
100 mL 胰蛋白酶 EDTA 1×，含 0.25% 胰蛋白酶/2.21 mM EDTA 的碳酸氢钠溶液	Corning	25-053-C1	用于常规传代及细胞接种前使贴壁细胞脱落
10× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Bio-Rad	1610780	稀释至 1× 后用于洗涤步骤、封闭液、抗体稀释、固定和通透处理
10× 电泳缓冲液（6 L）：Tris 181.8 g + 甘氨酸 864.0 g + SDS 60 g	自制	NA	用于在凝胶中电泳分离蛋白质样品
10× 转膜缓冲液（6 L）：Tris 181.8 g + 甘氨酸 864 g	自制	NA	用于将蛋白质从凝胶转移至膜上
10× Tris 缓冲盐水	Bio-Rad	1706435	缓冲液
30% （w/v）丙烯酰胺；0.8（w/v）/双丙烯酰胺储存液（37.5:1）	Ultrapure EC-890	EC-890	用于 SDS-PAGE
ABTR2 细胞	梅奥诊所（Mayo Clinic）	NA	获得性 PARP 抑制剂耐药的卵巢癌细胞系
AKT 裂解缓冲液配方（50 mM HEPES（pH 7.6），150 mM NaCl，1 mM EDTA，1% Triton X-100，10 mM NaF，30 mM 焦磷酸钠，1 mM Na3VO4，10 mM 2-磷酸甘油，10 μg/mL 亮抑蛋白酶肽，5 μg/mL 抑肽酶，5 μg/mL 胃蛋白酶抑制剂，以及 20 mM 微囊藻毒素-LR）	自制	NA	细胞裂解缓冲液
过硫酸铵	Bio-Rad	16107000	分子生物学中用作凝胶聚合的氧化剂，作为自由基引发剂
抗磷酸化组蛋白 H2A.X（Ser139）抗体，克隆 JBW301	Sigma-Aldrich	05-636	一抗，用于检测 γH2AX 焦点，使用稀释比例为 1:1000
抗 Rad51（Ab-1）兔多克隆抗体	Sigma-Aldrich	PC130	一抗，用于检测作为同源重组活性标志的 RAD51 核焦点，使用稀释比例为 1:1000
无蛋白酶牛血清白蛋白	GoldBio	A-420-250	用于配制封闭液（PBS 中含 5% BSA），以减少免疫荧光染色过程中非特异性抗体结合
ChemiDoc 成像系统	Bio-Rad	12003154	成像系统
共聚焦激光扫描显微镜	ZEISS	Zeiss LSM 780	用于免疫荧光成像、γH2AX 焦点分析、RAD51 焦点定量、蛋白共定位及三维图像采集
Countess II FL 自动细胞计数仪	Life Technologies	AMQAF1000	自动细胞计数仪
盖玻片	Cardinal Health	M6045-10A	覆盖在封片样本上，以保护染色细胞并实现高分辨率成像
ECM 830 方波电穿孔系统	Hbio-BTX	45-2052	适用于哺乳动物细胞基因递送的电穿孔系统
胎牛血清	Corning	35-010-CV	添加至 RPMI-1640 培养基中（终浓度 8%），以支持细胞生长和存活
甘氨酸	Thermo Fisher Scientific	A13816.0C	缓冲液
山羊抗小鼠 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 594	Thermo Fisher Scientific	A-11032	二抗，用于检测 γH2AX 一抗，使用稀释比例为 1:350
山羊抗兔 IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 488	Thermo Fisher Scientific	A-11034	二抗，用于检测 RAD51 一抗，使用稀释比例为 1:350
GraphPad Prism	GraphPad Software	version 10.6.1	用于统计分析、图表生成和数据可视化
HEPES 1 M	Corning	25060-C1	用于维持 pH 在 7.2–7.6 范围内的缓冲液
Hoechst 33342 溶液（20 mM，5 mL）	Thermo Fisher Scientific	62249	用于细胞核染色
辣根过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白 G	Cell Signaling Technology	7076S	二抗，用于 Western 印迹中检测小鼠（β-actin）一抗
辣根过氧化物酶标记的抗兔免疫球蛋白 G	Cell Signaling Technology	7074S	二抗，用于 Western 印迹中检测兔一抗（RAD51）
即溶脱脂奶粉	Hyvee	G461A323	封闭试剂
Laemmli 样品缓冲液（4×）	Bio-Rad	1610747	样品缓冲液
Lonza MycoAlert 支原体检测试剂盒	Lonza Bioscience	LT07-218	用于常规确认细胞培养物无支原体污染
下层胶配方（1 L）：Tris 181.7 g + SDS 4.0 g，用浓 HCl 调 pH 至 8.8	自制	NA	SDS-PAGE 分离胶
小鼠单克隆抗 β-肌动蛋白抗体	Abcam	ab8226	一抗，用于 Western 印迹中检测 β-actin 作为上样对照
非靶向对照荧光素酶 siRNA（siLUC）：5′-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3′	Horizon Discovery	NA	工作浓度为 20 nmol
Nunc Lab Tek II，8 孔带盖玻片玻璃培养皿，无菌	Thermo Fisher Scientific	154534	用于细胞接种和培养，以进行免疫荧光染色和共聚焦成像
OVCAR-8 细胞	美国国家癌症研究所（NIH）	NA	卵巢癌细胞系
16% 甲醛水溶液，电镜级	Electron Microscopy Sciences	15710-S	稀释至 3% 后用于免疫荧光染色前的细胞固定
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36930	用于封片并保持共聚焦成像过程中的荧光信号
蛋白酶抑制剂	Roche / Sigma-Aldrich	11836170001	蛋白酶抑制剂混合物
蛋白检测试剂浓缩液	Bio-Rad	5000006	蛋白质定量
PVDF 膜（Immobilon-P，0.45 µm）	Millipore	IPVH00010	转膜用膜
RAD51 siRNA（siRAD51）：5′-GGGAUUUGUGAAGCCAAA-3	Horizon Discovery	NA	工作浓度为 20 nmol
RPMI-1640（含 L-谷氨酰胺和葡萄糖）	Corning	10-041-CV	用作培养卵巢癌细胞系（OVCAR-8 和 ABTR2）的基础生长培养基
氯化钠（NaCl）	Fisher Scientific	S271-500	缓冲液
十二烷基硫酸钠（SDS）	Bio-Rad	1610302	缓冲液
氟化钠	Sigma-Aldrich	S7920	磷酸酶抑制剂
正钒酸钠	Sigma-Aldrich	S6508-50G	磷酸酶抑制剂
焦磷酸钠十水合物	Sigma-Aldrich	221368	缓冲液
磷酸甘油钠五水合物β	Thermo Scientific Chemicals（原 Alfa Aesar）	L03425.22	磷酸酶抑制剂
SuperSignal™ West Pico PLUS 化学发光底物	Thermo Fisher Scientific	34580	检测系统
TEMED 50 mL	Bio-Rad	1610801	在分子生物学中与 10% APS 配合使用，作为聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化剂
Topcoat 快干透明指甲油	Electron Microscopy Sciences	72180	用于密封盖玻片边缘，防止封片样本干燥或移动
Triton X-100	Bio-Rad	1610407	用于固定细胞的通透处理，使抗体能够进入细胞核蛋白
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379-1L	缓冲液
UltraPure EDTA	Thermo Fisher Scientific	15576028	二价金属阳离子螯合剂，适用于生物化学或分子生物学应用
上层胶配方（1 L）：Tris 60.6 g + SDS 4.0 g，用浓 HCl 调 pH 至 6.8	自制	NA	SDS-PAGE 浓缩胶
Zeiss LSM 780 激光扫描共聚焦显微镜	Carl Zeiss, Germany	NA	用于获取高分辨率共聚焦图像，以可视化和定量分析 RAD51 和 γH2AX 核焦点
β-巯基乙醇	Bio-Rad	1610710	还原剂