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一种经济高效的单重与多重免疫荧光工作流程用于玻璃盖玻片上的贴壁二维细胞培养

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DOI：

10.3791/71114

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2026年9月1日

 , 
1Laboratório de Vetores Virais (LVV), Centro de Investigação Translacional em Oncologia (CTO)/LIM24, Centro de Estudos e Tecnologias Convergentes para Oncologia de Precisão (C2PO), Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP), Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (FMUSP)

本文内容

摘要

本方案描述了一种经济高效的单重和多重免疫荧光（IF）实验流程，适用于贴壁的二维细胞培养。该方法采用廉价的玻璃盖玻片、标准的24孔板以及低体积染色条件，显著降低抗体消耗，从而减少实验成本，同时结合标准荧光显微镜技术，提供一种具有代表性的蛋白质定位研究方法。

摘要

免疫荧光（IF）显微技术是一种广泛应用的方法，可在保持细胞形态和亚细胞结构完整的同时，以单细胞分辨率观察蛋白质的定位及共分布情况。本实验方案旨在介绍一种利用常规实验室材料对贴壁二维细胞培养物进行单重和多重免疫荧光染色的实用且经济高效的实验流程。该方法通过将细胞培养在置于标准24孔板中的廉价玻璃盖玻片上实现；多重染色则依赖于不同宿主来源的一抗、光谱可区分的荧光染料，以及严谨的对照设置，包括无一抗对照、无抗体对照、单染对照和串色对照，以确保多重免疫荧光结果的可解释性。实验中采用小体积染色步骤，在不降低信号质量的前提下减少试剂和抗体的消耗。该流程无需使用专用成像板或成像腔室，适用于常规的宽场或共聚焦荧光显微镜观察。总体而言，本方案为贴壁细胞培养物中蛋白质定位与共分布的代表性评估提供了一种易于实施且实用的免疫荧光操作流程。若需将其应用于其他细胞类型或抗体组合，则需针对特定靶标进行优化，包括抗体验证、固定与通透条件、荧光染料选择，以及与显微镜和滤光片组的兼容性等。

引言

免疫荧光（IF）显微镜技术被广泛用于观察固定细胞中蛋白质的亚细胞定位、相对丰度及其共定位情况，从而将分子标志物与细胞形态及亚细胞环境联系起来1,2。与整体检测方法（如免疫印迹）或解离性单细胞检测技术（如流式细胞术）相比，IF 能够保留细胞的空间组织结构，特别适用于在单细胞分辨率下评估细胞间的表型异质性以及亚细胞蛋白分布的变化3,4,5。随着实验需求日益需要同时检测多个标志物，多重免疫荧光技术可在同一标本中同时检测两种或更多靶标，通常通过将来自不同宿主物种的一抗与光谱不同的荧光染料组合来实现6（图1），并采用直接和/或间接检测策略（图2）。然而，多重检测会带来关键的技术挑战，尤其是抗体交叉反应性和光谱串扰问题，若不通过严谨的抗体组合设计和严格的对照条件加以解决，可能会影响结果的可解释性7,8。

该方法的总体目标是提供一种实用且低成本的工作流程，广泛适用于经免疫荧光验证的抗体，并针对贴壁二维培养物的常规成像进行优化。多重检测通过宿主物种分离、光谱 distinct 的荧光染料以及验证背景水平和染色效果的对照组来实现。9,10通过在标准24孔板中使用12 mm玻璃盖玻片，而非专用的带孔载玻片，该实验流程避免了使用特定且成本较高的耗材，转而采用大多数细胞培养实验室常规储备的材料。该流程在单位生长面积上也显著减少了染色液的使用量（150 µL 用于 ≈1.13 cm2，或 ≈133 µL/cm2) 优于类似的带腔室盖玻片格式11,12，通常需要 300–500 µL/cm2，相当于单位面积抗体和试剂消耗量减少了约2至4倍。因此，该方案支持利用常规的宽场或共聚焦显微镜，结合细胞骨架和细胞核复染，对标志物的定位及共分布进行定性多靶标评估。该工作流程适用于基于宿主物种分离和光谱区分的常规固定细胞多重免疫荧光，不适用于迭代式或多维高通量多重检测方法。

方案

本研究未涉及人类参与者或动物受试者。所有实验均使用D17犬骨肉瘤细胞系进行，该细胞系为来自公共细胞库（Banco de Células do Rio de Janeiro，货号：0276）的已建立细胞系。因此，无需伦理审批。

1. 细胞系的维持

  1. 在标准培养条件（37 °C、5% CO₂、加湿培养箱）下，使用适用于所用细胞系的完全培养基培养贴壁细胞。
    注意：以D17犬骨肉瘤细胞（Banco de Células do Rio de Janeiro [BCRJ]，货号 0276）为例，该细胞系在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌剂的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养，使用胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）在细胞融合度达70–80%时进行传代，并在经验证的传代范围内使用（例如第5–20代）。
  2. 在实验前使用经验证的支原体检测方法确认细胞无支原体污染。

2. 24孔板和玻璃盖玻片的准备

注意：盖玻片表面应浸入70%乙醇中清洗（5分钟，重复3次）×在采用下述任一方法灭菌之前进行；灭菌后，盖玻片应置于密闭容器中，室温保存至使用。

  1. 将洁净的12 mm圆形玻璃盖玻片放入玻璃培养皿（或盖玻片架）中，并进行高压灭菌。同时高压灭菌一对尖头金属镊子。
  2. 替代方法：使用70%乙醇清洁盖玻片和镊子，静置晾干，然后在生物安全柜内通过紫外线（UV）照射（30分钟）进行表面去污染。灭菌后的盖玻片应储存在密闭容器中，于室温保存直至使用。
  3. 在生物安全柜中，使用无菌镊子将一片无菌盖玻片转移至24孔组织培养板中指定用于实验组的每个孔内。
  4. 可选步骤：如所用细胞类型需要，可按照制造商说明或实验室既定规程，对盖玻片进行促进黏附的包被处理。
    注意：包被试剂选项（聚-L-赖氨酸、I型胶原或纤连蛋白）及其工作浓度详见材料表。对于大多数在玻璃表面培养的贴壁细胞系，未包被的灭菌盖玻片已足够；但包被成分可能具有抗原性，因此所选包被物不应与抗体检测 panel 中的任何抗体发生交叉反应。
  5. 若已进行包被处理，需吸除多余的包被液，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗一次，并在生物安全柜中让盖玻片自然晾干后再进行细胞接种。

3. 实验组

  1. 应包含一组与多重实验设计相适应的对照。
    注意：不加抗体对照（即不加一抗和二抗）可显示组织固有的自发荧光；仅不加一抗对照（使用二抗混合物但不加任何一抗）可同时评估所有检测通道中的非特异性二抗结合及背景信号；由于本方案所用的二抗在光谱上完全不重叠，该单一对照即可在各自对应的通道中独立评估每种二抗，其作用等同于针对每种荧光染料设置单独的仅二抗对照。单染对照是指每对一抗–二抗单独应用，用于在多重组合前验证每种抗体的性能，并通过与多重染色条件的比较，评估每对荧光染料之间的光谱串扰。在条件允许的情况下，应使用表达目标抗原的阳性对照样本以确认检测体系的有效性。

4. 在盖玻片上接种细胞（铺板）

  1. 在生物安全柜中，使用胰蛋白酶（或其他适当的解离方法）消化细胞，中和后重悬于完全培养基中。
  2. 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数。
  3. 将细胞稀释至 6 × 104–1 × 105 个细胞/mL。
  4. 每孔加入 0.5 mL 细胞悬液（终浓度：3 × 104–5 × 104 个细胞/孔）。
    注意：如有需要，可使用无菌移液器吸头轻轻调整盖玻片，使其平整贴附于孔底，避免刮伤。
  5. 将细胞置于标准条件下（37 °C，5% CO₂）培养，直至细胞贴壁并达到所需汇合度或实验时间点。

5. 细胞处理（可选）

  1. 根据实验设计选择处理时机。处理方式可包括药物治疗、细胞因子刺激、基因操作以诱导或敲低目标基因表达，或其他适用的实验干预措施。
  2. 标记孔板以区分对照组和处理组。
  3. 孵育至所需时间点；避免细胞过度融合，因为过度生长会增加背景信号并影响细胞形态。
    注意：除非实验设计要求在接种后立即固定，否则固定前细胞应已贴附于盖玻片上。
  4. 对于快速分泌的靶标（例如细胞因子），在固定前向培养基中加入布雷菲德菌素A（BFA），终浓度为1–10 µg/mL（通常为5 µg/mL），在37 °C、5% CO₂条件下孵育4–6小时。
  5. 移除含BFA的培养基，并立即进入固定步骤。

6. 免疫荧光染色

注意：从固定开始后，无需无菌操作；染色可在实验台上进行，但在处理警示类试剂时需使用化学通风橱。样品在任何步骤均不得干燥；吸液时应保留一层薄的缓冲液膜，并立即加入下一种溶液。

  1. 固定（选择一种）：
    注意：固定剂的选择取决于靶标定位和表位敏感性（见讨论部分）：多聚甲醛（PFA，由多聚甲醛制备的甲醛）适用于大多数靶标，且与鬼笔环肽兼容；甲醇可能有助于某些核内/磷酸化表位的检测，但会损害F-肌动蛋白染色。
    1. PFA固定（推荐用于大多数靶标）：
      1. 吸弃培养基，用 Tris 缓冲盐水（TBS）轻轻冲洗一次（0.5 mL/孔）。
      2. 加入4%多聚甲醛PBS溶液（磷酸盐缓冲液）（每孔0.5 mL），室温孵育10分钟≈25 °C).
      3. 吸去PFA，洗涤3次× 用 TBS 清洗（立即吸弃；切勿让孔干燥）。
        注意：警告：PFA 具有剧毒且可能致癌。配制 PFA 溶液时，务必在经认证的化学通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具）。避免吸入和皮肤接触，并根据机构化学品安全指南妥善处理废弃物。
  2. 或者，甲醇固定（适用于某些核抗原和特定磷酸化表位）：
    1. 预冷100%甲醇至−20 °C.
    2. 将预冷的甲醇直接加入细胞中（每孔 0.5 mL），在 −20°C 下孵育 5 分钟20 °C.
    3. 洗涤 3 次× 用 TBS 洗涤（立即吸净；切勿让孔干燥）。
      注意：甲醇固定后，可能无需额外进行透化处理，应根据具体抗体/表位优化条件。甲醇固定可能破坏膜上表位，影响荧光素偶联鬼笔环肽/F-actin染色效果。警告：甲醇具有毒性、易挥发且高度易燃。操作时应在通风良好处或化学通风橱中进行，穿戴适当的个人防护装备，并远离明火和热源。可选暂停点：固定后，样本可于 4 °C 在含有低浓度固定剂的 PBS 中（例如 PBS + 0.1% PFA）保存，最长可存放一周；需针对每种抗原验证保存时间。
  3. 醛类淬灭（可选）
    1. 在室温下，用 TBS 中的 50 mM 甘氨酸（0.5 mL/孔）孵育 5 分钟（≈25 °C).
    2. 洗涤 3 次× 含0.05%聚山梨酯20的TBS缓冲液
      注意：甘氨酸可中和PFA固定后残留的游离醛基，减少与固定相关的自发荧光，并提高抗体染色的特异性。
  4. 透化
    1. 若靶向膜蛋白，则跳过透化步骤，直接进行步骤 6.5.1。
    2. 若靶向细胞内或核内蛋白，使用含0.1–0.3%非离子型去垢剂的TBS溶液（每孔0.5 mL）在室温下透化处理5–10分钟≈25 °C).
    3. 洗涤 3 次× 含0.05%聚山梨酯20的TBS（TBST）。
      注意：辛基酚聚氧乙烯醚非离子型去污剂的浓度和作用时间需根据靶标进行优化；其适用性应通过正确的区室信号、保存良好的形态结构、清晰的F-actin显影以及低背景信号来判断（见讨论部分）。若使用皂苷，则应在后续所有抗体孵育和洗涤缓冲液中持续添加。警告：辛基酚聚氧乙烯醚非离子型去污剂吸入或接触皮肤有害，可能引起眼部刺激。操作时应佩戴手套，并避免气溶胶生成。
  5. 封闭
    1. 加入 0.5 mL/孔的封闭液（5% 牛血清白蛋白（BSA） 在 TBS 中）于室温孵育 30 分钟（≈25 °C).
    2. 吸去封闭缓冲液。
    3. 直接进行一抗孵育（无需洗涤）。
  6. 一抗孵育
    注意：一抗和二抗的稀释比例需通过滴定实验经验性确定（详见讨论部分）。
    1. 在含有0.05%吐温-20和1%牛血清白蛋白的Tris缓冲盐水（TBST-BSA）中配制单重或多重一抗抗体组合 1%），使用针对每个靶标预优化的抗体浓度。
    2. 对于多重免疫荧光，将针对不同宿主物种来源的不同抗原的未标记一抗（例如，小鼠抗干扰素-β (IFN-β) + 兔抗p14ARF + 山羊抗肌动蛋白）混合为单一抗体混合液。
    3. 添加 150 µL 每孔加入适量抗体溶液，确保完全覆盖整个盖玻片。
      注意：为防止低体积液体蒸发，需将培养板置于加湿的孵育盒中（例如，装有湿润纸巾的密封盒）。
    4. 室温孵育 1.5 小时（≈25 °C）或 12–16 小时在 4 °C.
    5. 洗涤 3 次× 用 TBST 在室温下每次洗涤 3 分钟≈25 °C），每次洗涤后立即吸干。
  7. 二抗孵育（以及直接标记的一抗，如适用）
    注意：从本步骤开始，样品需避光保存，以防止荧光淬灭。在不同二抗以及任何直接偶联的一抗中使用光谱分离良好的荧光染料，以尽量减少信号串扰；同时采用物种特异性高、高度交叉吸附的二抗，以减少与非对应一抗的非特异性结合。荧光染料组合的设计，包括核标记和细胞骨架标记，以及显微镜激发/发射波长的兼容性问题，将在讨论部分详细说明。
    1. 用预优化浓度的TBST-1% BSA溶液稀释二抗。进行多重检测时，将针对所用一抗宿主物种的全部二抗（每种宿主物种对应一种二抗）混合配制成单一的混合抗体工作液。
    2. 添加 150 µL 每孔加入，确保完全覆盖整个盖玻片。
    3. 室温孵育1小时（≈25 °C).
      注意：如果该检测面板包含一种或多种直接偶联的一抗，需将其与二抗混合液一同加入，并在室温下孵育1.5小时（约 25 °C).
    4. 洗涤 3 次× 用 TBST 在室温下每次洗涤 3 分钟≈25 °C），每次洗涤后立即吸净液体。

7. 细胞核复染与F-肌动蛋白染色

  1. 加入用 TBS 稀释的核复染染料 Hoechst 33342（1:5000），室温孵育 15 分钟≈25 °C），避光保存。如果使用鬼笔环肽（phalloidin）而非抗肌动蛋白抗体标记F-肌动蛋白，请在同一溶液中加入鬼笔环肽（1:400）。
  2. 洗涤 3 次× 用 TBST 洗涤，每次洗涤后立即吸净液体（切勿让孔干燥）。
  3. 向每个孔中加入 0.5 mL TBS，以保持盖玻片浸没，直至取出或封片。

8. 盖玻片取出与封片

  1. 在盖玻片仍浸没于TBS中时，将细针或解剖刀的尖端插入盖玻片边缘下方，轻轻撬起，直至一侧部分抬起。用精细镊子夹住盖玻片，从孔中取出。
    注意：当盖玻片未浸没在液体中时将其移除，可能因表面张力而使其牢固粘附于孔底，增加破裂风险。
  2. 用镊子夹住盖玻片，使用真空抽吸器或吸水纸小心地从边缘吸去多余的 TBS。避免触碰覆盖有细胞的表面。
    注意：应避免残留过多液体，因其可能稀释封片介质，影响图像清晰度和对比度。
  3. 将盖玻片细胞面朝下放置于洁净的载玻片上，载玻片上预先滴加一小滴（≈3 µL封片剂的用量。
    注意：可使用市售的自固化抗荧光淬灭封片剂，或基于80%甘油/磷酸盐缓冲液（PBS）的自制封片剂；甘油封片剂需用透明指甲油封固，复染后应选择不含核染料的封片剂。储存期限及荧光染料稳定性的相关建议详见讨论部分。
  4. 让载玻片水平固化 ≈24小时，避光，然后进行成像。

结果

本方案支持对培养在玻璃盖玻片上的贴壁犬肿瘤细胞进行单重和多重免疫荧光染色，可在保持细胞形态的同时，实现细胞核、细胞质和细胞骨架标志物的同步可视化。代表性结果如图3所示。

在成功的实验中，通过基因操作（第5.1节）改造后表达犬p14ARF和犬IFN-β的D17犬骨肉瘤细胞显示出强烈且空间定位准确的荧光信号，背景低，非特异性染色极少。对于表达p14ARF的细胞（图3A），免疫荧光显示其主要定位于细胞核，这与已知的p14ARF亚细胞分布一致。使用0.3%辛基酚聚氧乙烯醚非离子型去污剂进行透化处理，可在保持细胞核形态和细胞骨架完整性的前提下，有效促进抗体进入细胞核表位，这一点通过抗肌动蛋白抗体（发射橙色荧光的荧光染料）清晰显示的细胞核复染和肌动蛋白结构得以证实。

对于表达干扰素-β（IFN-β）的细胞（图3A），在使用布雷菲德菌素A（BFA）孵育以阻断蛋白质分泌后，可观察到胞质信号。该处理可使这种可溶性细胞因子在细胞内积累并被检测到。在此条件下，较温和的透化处理已足以允许抗体进入，同时避免胞质内容物过度流失。成功的染色表现为从点状至弥散分布的胞质荧光、极低的细胞核串扰信号，以及完整保留的肌动蛋白结构。

当关键参数未得到适当优化时，观察到次优结果。通透不充分会导致细胞核内p14ARF信号微弱或缺失，如未通透条件（0% 辛基酚聚氧乙烯醚非离子型去污剂）所示； 图3B 和 补充图1）。相反，过度透化（≥0.5% 辛基苯基聚氧乙烯醚非离子型去污剂或孵育时间过长）可能导致细胞骨架染色部分丢失、背景荧光增强以及细胞形态受损。在快速分泌蛋白（如 IFN-β），省略BFA通常会导致较弱的细胞内信号，这反映了快速分泌，而非实验方案失败。

单染对照（补充图2）显示信号仅出现在对应各靶标的通道中，证实了所观察到的免疫荧光染色的特异性。阴性对照条件（包括无一抗和无抗体对照）（补充图2）显示出预期的细胞核染色，而在依赖抗体的通道中信号可忽略不计，表明自发荧光较低，且二抗的非特异性结合极少。

综上所述，这些代表性结果表明，当固定、通透强度以及针对特定目标的策略（例如，分泌阻断）与目标蛋白的生物学特性相匹配时，该方案能够实现对具有不同亚细胞定位的蛋白质的检测。经过适当优化后，可获得强而特异的荧光信号，背景低，细胞形态保持良好；而条件非最优时，则会导致信号减弱或背景噪声增加，并出现细胞结构的改变。

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图1：单重与多重免疫荧光实验流程概览流程图。 从细胞培养维持到图像采集的主要步骤，包括两个需根据靶标特性进行选择的关键决策点：固定方法（多聚甲醛 versus 甲醇）和通透处理（依据靶标亚细胞定位）。在固定前的分支步骤中显示了可选的实验处理，例如对快速分泌型靶标进行布雷菲德菌素A（BFA）预处理。为保持图示清晰，未显示部分可选步骤（如醛类淬灭），详见完整实验方案。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：基于抗体的荧光检测策略示意图。 直接检测法使用与荧光染料偶联的一抗，而间接检测法使用未偶联的一抗，并配合与荧光染料偶联的二抗，本实验方案全程采用的是间接检测法。在多重检测应用中，间接检测需要使用来自不同宿主物种的未偶联一抗，从而使每种二抗能够特异性识别其对应的一抗，避免交叉反应。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：D17 犬骨肉瘤细胞的多重免疫荧光染色。D17 细胞（5 × 104）接种于24孔板中的玻璃盖玻片上，在25 °C下用4%多聚甲醛（PFA）固定10分钟。细胞经多重免疫荧光染色处理，一抗包括抗-p14ARF（1:200；绿色荧光染料）、抗-肌动蛋白（1:200；橙色荧光染料）和抗-干扰素-β（IFN-β）（1:200；远红荧光染料），二抗按1:500稀释使用。细胞核进行复染。在检测IFN-β前，细胞用BFA（5 µg/mL，处理4小时）处理以阻断蛋白质分泌。（A）细胞在25 °C下用0.3%非离子型去污剂透化处理10分钟。（B）未经透化处理的细胞（0%非离子型去污剂）。图像来自两次独立的生物学重复实验，每次实验均设有两次技术重复。本图仅显示合并通道图像；各单独通道图像见补充图1。不同处理条件之间的染色存在可观察差异，尤其是对于位于细胞核内的靶标p14ARF（A；箭头），在未透化组（B）中信号缺失。图A和图B使用完全相同的成像与处理参数获取（补充表1）。该图对应的阴性对照及单染对照见补充图2。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：对应于图3的各个荧光通道，按标志物排列，左侧列为透化处理样本，右侧列为未透化处理样本。 并列显示的条件：Hoechst 33342（A，B），p14ARF（C，D；绿色发射荧光团），肌动蛋白（E，F；橙色发射荧光团），以及 IFN-β (G，H；远红发射荧光染料），以及相应的合并图像面板（I，J），分别对应于图3A和3B。箭头指示典型的p14ARF核染色；椭圆指示典型的肌动蛋白（E) 和 IFN-β (G) 染色。p14ARF 核信号的缺失，以及 IFN-β 在非通透条件下，肌动蛋白（actin）的信号明显可见。（D；星号）反映了共存荧光染料之间的光谱串扰，该现象在相应的单染及仅二抗对照中缺失，从而得到证实（补充图2。比例尺： 100 µm. 请点击此处下载该文件。

补充图2：对应于图3多重检测面板的联合免疫荧光对照 每个对照组均分别显示各个通道（Hoechst 33342、绿色荧光染料、橙色荧光染料和远红荧光染料），以及合并图像（第五列）。A–E) 无抗体对照：未使用一抗或二抗处理的细胞。F–J) 仅二抗对照：细胞在无一抗的情况下孵育二抗混合液。K–Op14ARF 单染对照（绿色荧光染料）。P–T) 肌动蛋白单染对照（橙色发射荧光染料）。(U–Y) IFN-β 单染对照（远红光发射荧光染料）。采集和处理参数与图3中所使用的相同。补充表1。比例尺： 100 µm. 请点击此处下载该文件。

补充表1：荧光滤光片组规格及采集顺序。图像在倒置宽场荧光显微镜上依次采集40×/0.80 物镜使用下表所列的滤光立方体，按照所示顺序，对图3、补充图1和补充图2中每个成像视野进行采集。图像以单个光学切面（无z轴层叠）获取。激发强度通过荧光强度控制设置为指定水平，所有通道的入射光视场光阑均保持在位置6。相机设置（8位数字化，3072×2048 格式，伽马值 1.0）和固定的数字锐化设置在所有通道和图版中均保持一致，包括对照图像 补充图2对所有通道和图版应用相同的线性亮度/对比度调整以供显示。图像以 TIFF 格式导出。 请点击此处下载该文件。

补充表 2： 免疫荧光实验流程中常见技术问题的故障排除指南。 本表列出了实验过程中常见问题、可能原因及相应的纠正措施。请点击此处下载该文件。

讨论

该基于盖玻片的免疫荧光实验流程中，多个步骤对于结果的稳定性至关重要。所有操作均在24孔培养板的单个孔内有限空间中进行，这简化了操作流程，减少了样本处理步骤，并可通过较低的试剂用量实现盖玻片的完全覆盖，从而降低每次实验的抗体消耗量。由于低体积溶液容易蒸发，孵育步骤最好在湿化环境中进行，且样本绝不能干燥：即使短暂干燥也会增加背景荧光并破坏细胞形态。在吸液时，应在盖玻片表面保留一层薄薄的缓冲液，并立即加入下一种溶液。

在固定时，适当的细胞接种密度和可控的汇合度对于降低背景信号和保持细胞形态至关重要，因为过度生长会增加背景并破坏细胞结构。整个过程中同样需要精确控制孵育时间和温度，因为二者均会影响固定效率、抗体结合以及背景信号5,13。当环境条件波动时，使用设定为 25 °C 的温控培养箱或干式恒温仪，并在各重复样本间保持一致的孵育时间，可提高实验的可重复性。

固定是第一个关键步骤，因为它决定了抗原的保存效果和细胞结构的完整性5，固定剂的选择需根据靶标的定位和表位敏感性而定。对于大多数膜相关、胞质、核内及细胞骨架靶标，推荐使用PFA，因为它能良好维持细胞结构，保持抗原分布，并且与基于鬼笔环肽的F-actin染色兼容。对于某些经交联固定后难以检测的核抗原（特别是磷酸化表位或对醛类敏感的表位），可能更宜选用甲醇；但甲醇会破坏膜完整性，提取可溶性蛋白，并影响鬼笔环肽/F-actin染色效果；因此每种靶标均需验证其兼容性13,14,15,16。对于可溶性细胞因子及其他快速分泌的蛋白质，可在固定前采用BFA预处理结合PFA固定，以保留细胞内信号：BFA可阻断蛋白质从内质网向高尔基体的转运，促进分泌蛋白在细胞内积聚，从而使其可通过免疫荧光法检测。当需要同时检测具有不同固定要求的靶标时，需进行经验性优化。乙二醛是一种小分子二醛，已有文献报道可作为PFA的替代品，具有更快的交联速度、更优的抗原保存能力，并适用于免疫荧光和超分辨率显微镜成像；我们尚未直接使用过乙二醛固定，此处仅将其作为文献支持的一种可选方案17,18。

固定后，适当的通透处理可在保持结构完整性的前提下，使抗体进入细胞内和核内的抗原表位5。通透不足通常会导致信号微弱或缺失，尽管形态保持完整，表明抗体无法有效进入；而通透过度则会抽提可溶性蛋白，破坏膜结构，导致细胞骨架染色丢失，并增加背景信号。因此，需根据靶标优化去污剂的类型、浓度和孵育时间。充分的通透效果可通过以下四个标准判断：（i）在预期的亚细胞区域出现特异性信号；（ii）形态保持良好，细胞核和细胞质边界清晰，分别通过Hoechst 33342和鬼笔环肽（phalloidin）染色确认；（iii）F-actin染色清晰明确，因为弥散或缺失的细胞骨架信号提示通透过度；（iv）阴性对照中背景信号低。若未满足上述标准，需经验性调整辛基苯基聚氧乙烯醚（octylphenol ethoxylate）非离子型去污剂的浓度和/或孵育时间。当在同一检测面板中同时检测膜相关和细胞内抗原时，宜采用较温和的条件（较低去污剂浓度、较短孵育时间），以在允许抗体进入细胞内的同时保护膜表位；此时可从5分钟开始进行时间梯度实验，并逐步延长孵育时间。若使用皂苷（saponin）作为通透剂，则必须在后续所有抗体孵育和洗涤缓冲液中持续保留，因其通透作用是可逆的。

抗体浓度需通过滴定实验经验性确定，而非直接采用通用推荐值。一种实用的方法是进行系列稀释，浓度范围应至少涵盖制造商建议稀释度上下3–4个梯度（例如，若推荐稀释度为1:200，则测试1:50、1:100、1:200和1:400），并在相同条件下平行施加于多个盖玻片。每个稀释度均需评估以下指标：目标亚细胞结构中的特异性信号强度；通过与无一抗对照比较染色样本的信噪比，以及通过无抗体对照比较二抗背景信号；以及形态结构的保持情况。选择能够产生强而特异信号且背景最低的最低抗体浓度。若背景持续偏高，通常可通过进一步滴定、延长封闭时间或提高洗涤严格性来改善；而信号过弱可能源于固定过度、抗体浓度不理想、一抗未能识别其靶向表位、二抗与一抗宿主物种不匹配（例如将抗兔二抗用于小鼠来源的一抗）、或因试剂过期、储存不当（尤其是反复光照）导致二抗荧光团降解而引起信号丢失。若所有稀释度均无信号，可尝试延长一抗孵育时间或改为4 °C过夜孵育，确认该细胞系中抗原的表达情况，验证抗体与固定和通透条件的兼容性，检查一抗和二抗的批号、储存状态及有效期，确认显微镜配备适用于该荧光染料的激发和发射滤光片；若问题仍存在，则应测试另一种克隆号的抗体。配制工作液时，所需混合液体积为孔数乘以150 µL，并额外增加约10%以补偿移液损耗；每种抗体的储存液用量等于总体积除以其稀释倍数（例如，总体积825 µL，1:200稀释时为825 µL ÷ 200 = 4.13 µL），其余体积用含1% BSA的TBST补足。相同计算方法适用于二抗混合液，仅需替换相应的稀释倍数。

多重检测的性能最终取决于荧光染料组合的设计。针对主要靶标的荧光染料、核复染剂以及细胞骨架标记物所选用的荧光染料必须协调搭配，以避免光谱重叠或信号重复；同时，成像系统必须能够支持所选每种荧光染料的激发与检测9,10；各滤光片组的激发和发射波长范围详见补充表1，便于直接比较整个染料组合的光谱兼容性。用户若将本方案中的染料组合替换为其他荧光染料，建议尽可能选择相邻通道间重叠最小的组合，并在合并靶标前通过单染对照验证是否存在串扰，如同本研究中所进行的操作。在多重染色组合的所有采集通道中均观察到由共存荧光染料引起的残余信号（补充图1），但在相应的单染及仅二抗对照中则未见该现象（补充图2），表明该串扰来源于宽场成像所使用的宽带滤光片组（若采用共聚焦激光激发，可能降低此类干扰）。鉴于p14ARF的核仁定位与肌动蛋白及IFN-β的丝状/胞质分布具有空间分离性，这种光谱串扰并不影响对多重染色组合中p14ARF定位结果的判读。本工作流程依赖于传统的基于荧光染料的多重检测技术，其可同时分辨的靶标数量受限于可用的一抗宿主物种及光谱上可区分的荧光染料种类。更高阶的多重检测可通过循环免疫荧光或光谱成像实现，前者允许进行重复的染色/漂白循环，后者可对重叠的荧光信号进行线性解混，但这些方法需要特殊的设备和软件支持，不在本文讨论范围内19,20。

封片剂会影响图像质量和信号的持久性。可使用市售的自固化抗荧光淬灭封片剂，或作为自制替代方案，使用 PBS 中的 80% 甘油（无抗荧光淬灭剂，无自固化功能）；自制甘油封片剂需用透明指甲油封固，以防止干燥和盖玻片移动。若已完成细胞核复染，则应选择不含核染料的封片剂。图像最好在封片剂固化后尽快采集。若无法立即成像，固化后的载玻片可置于暗盒中，于 4 °C 保存 2–4 周，或于 −20 °C 保存长达 6 个月。需注意的是，高度光不稳定的荧光染料（例如发射绿光的荧光染料）即使在最佳储存条件下，信号也会随时间逐渐减弱。与自制甘油封片剂相比，市售抗荧光淬灭封片剂可显著延长荧光染料的稳定性；当使用后者时，强烈建议在 24–48 小时内完成图像采集。透明指甲油与大多数荧光染料兼容，只要在储存前给予至少 30 分钟的避光固化时间，便不会显著影响信号的保存。

从固定步骤开始，不再需要无菌操作，染色过程可在实验台上进行，仅将标注“注意”的试剂置于经认证的化学通风橱中使用。D17 及其他肿瘤来源的细胞系应根据机构生物安全指南，按照风险等级1或2材料的要求进行操作。所有接触过培养细胞、盖玻片、移液头、培养基和液体废弃物的材料在丢弃前均需去污染处理：液体废弃物需用漂白剂处理至终浓度10%，作用时间至少30分钟；固体废弃物应丢弃于适当的生物危害废物容器中。含有PFA、甲醇或辛基酚聚氧乙烯醚非离子型去污剂的化学废弃物应单独分类，并按照机构化学安全规定进行处置。

尽管该实验流程设计为具有广泛的适用性，但最好将其视为可根据靶标进行调整的方法，而非一成不变的通用操作步骤；其成功应用取决于研究者对每个抗原的定位、溶解性、表位可及性以及对抗原固定和通透处理敏感性的理解。应强调两点局限性。第一，此处的染色评估为定性分析，依据是与阴性对照及预期亚细胞定位的比较，而非正式的信号与背景比值定量；因此，此处报告的一致性反映的是在重复盖玻片和对照条件下可重复的定性染色结果，而非经过定量验证的性能表现。常见问题、可能原因及纠正措施的综合故障排除指南见补充表2。需要定量读数的实验室可使用开源图像分析软件进行平均强度测量、背景扣除、基于感兴趣区域（ROI）的定量分析以及强度分布分析21。第二，代表性数据来源于一种单一的贴壁犬肿瘤细胞系（D17），因此将其推广至其他细胞类型、物种或抗原组合时，需针对特定靶标重新优化固定、通透和抗体反应条件。

综上所述，本方案为贴壁的二维培养细胞提供了一种灵活且成本效益高的单重和多重免疫荧光工作流程，可在标准实验室设备上实现试剂消耗量低且染色效果稳定，同时允许根据靶标特性进行合理、有针对性的调整。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本研究得到了圣保罗研究基金会（Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo，FAPESP）的资助，项目编号为 2023/01697-7（JL）和 2022/15913-0（BES）。同时获得了国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico，CNPq）的支持，包括项目编号 401811/2024-7（BES）和研究奖学金 310497/2021-3（BES）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔组织培养板Corning3524盖玻片接种与染色
抗生素-抗真菌剂Gibco15240062用于防止细胞培养中的细菌和真菌污染。
抗体稀释液（含1% BSA的TBST）实验室自制—配制10 mL：将2 mL 5% BSA封闭液 + 5 µL Tween-20 + 7.995 mL 1× TBS（工作液），定容至10 mL（终浓度：TBS中含1% BSA和0.05% Tween-20；pH 7.6）。现用现配；如需储存，应于4 °C避菌保存，并在1周内使用。
封闭液实验室自制—配制10 mL：将0.5 g BSA溶于10 mL 1× TBS（1 mL 10× TBS储备液 + 9 mL去离子水）；pH 7.6。25 °C孵育30分钟；现用现配。
（TBS中含5% BSA）
Brefeldin ASigma-AldrichB7651终浓度5 µg/mL；细胞因子检测前进行4小时预处理，以阻断蛋白质分泌。
BSA（牛血清白蛋白）Sigma-AldrichA7906用于封闭时配制成TBS中5%的溶液；用于抗体稀释时配制成含1% BSA和0.05% Tween-20的TBS溶液。
基于胶原的试剂（用于盖玻片包被，可选）Corning 354231来源于牛皮的I型胶原；用0.01 N HCl稀释至50 µg/mL；每孔加样5–10 µg/cm²（≈100 µL/孔）；室温（≈25°C）孵育1小时；接种细胞前吸除并用PBS冲洗。
盖玻片，玻璃材质，直径12 mm圆形Knittel Glass100013贴壁细胞培养与染色的基底材料。
D17犬骨肉瘤细胞系Banco de células do Rio de Janeiro276代表性细胞模型；在添加10% FBS和抗生素-抗真菌剂的DMEM中维持培养；培养条件为37 °C、5% CO2。
（BCRJ）
去离子水/蒸馏水实验室自制—用于缓冲液配制。
DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）Gibco12100-046细胞培养用完全培养基。
乙醇Supelco1.00983用于盖玻片/镊子去污。
胎牛血清Sigma-AldrichF7524细胞培养基中的添加物。
（FBS）
纤连蛋白Gibco33016015细胞外基质糖蛋白；用细胞培养基稀释至0.0125 mg/mL；每孔加100 µL，在室温（≈25°C）孵育1小时后再接种细胞。
细尖金属镊多种品牌—用于操作盖玻片。
荧光显微镜Leica MicrosystemsDMi8DMi8宽场荧光显微镜（Leica Microsystems），配备HC PL FLUOTAR 40×/0.80 DRY物镜；适用于本实验所用荧光染料（AF488、AF555、AF647、Hoechst）。
玻璃载玻片Bioslide—用于固定染色后的盖玻片以便成像。
玻璃培养皿或盖玻片储存容器多种品牌—用于盖玻片的高压灭菌或储存。
甘氨酸Sigma-Aldrich8.16E+09配制10 mL 50 mM溶液：将37.5 mg甘氨酸溶于10 mL 1× TBS；pH 7.6。25 °C孵育5分钟；固定后、通透前可选的醛基淬灭步骤；现用现配。
Hoechst 33342InvitrogenH3570配制10 mL工作液：将原液用TBS稀释1:5000。作为细胞核复染剂；避光孵育；现用现配。
湿盒多种品牌/实验室自制—用于抗体孵育；也可由密封塑料盒内放置湿润吸水纸自行组装。
ImageJ开源软件（NIH）—用于图像采集后的分析。
图像采集软件Leica Microsystems LAS X 3.7.3用于Leica DMi8显微镜的图像采集。
甲醇Merck1.06009替代固定方法（适用于核抗原或磷酸化表位）；预冷至−20 °C，孵育5分钟；可能影响鬼笔环肽/F-肌动蛋白染色效果。
封片介质Sigma-AldrichG2289配制10 mL：8 mL甘油 + 2 mL PBS，pH 7.6，充分混匀。无抗荧光淬灭性能，且不会自固化。需用指甲油密封盖玻片边缘以防干燥或移位，载玻片应于4 °C避光保存，并尽快成像以减少光漂白。
（甘油基）
封片介质（ProLongTM Glass）InvitrogenP36984含抗荧光淬灭试剂，可在室温避光条件下约24小时内自固化（硬化），形成永久封片（无需指甲油密封）。封片后载玻片应于2–8 °C避光保存直至成像。
NaClSigma-AldrichS9888TBS缓冲液的离子组分；在洗涤和抗体孵育步骤中维持生理渗透压，以保持细胞和组织形态。
针头（细规格，例如25–27G）多种品牌—用作杠杆，轻柔地将盖玻片从孔底抬起或分离，避免损伤细胞单层。
多聚甲醛（PFA）Sigma-Aldrich158127配制10 mL：将0.4 g多聚甲醛粉末溶于8 mL PBS中，加入几滴1N NaOH后加热至60–65 °C直至澄清，冷却后调节pH至7.4，再用PBS定容至10 mL；使用前经0.2 µm滤膜过滤。建议现用现配，或分装后于−20 °C保存，避免反复冻融。
鬼笔环肽，荧光染料偶联Invitrogen根据所选荧光染料而定配制10 mL工作液：根据厂商说明，将原液用TBS（pH 7.6）稀释1:400。作为细胞骨架/F-肌动蛋白的替代标记物；现用现配，避光操作。
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichP4474-1L等渗磷酸盐缓冲液（pH 7.4）；在固定和洗涤步骤中维持生理渗透压，以保持细胞形态。
（PBS）
聚-L-赖氨酸（用于盖玻片包被，可选）Sigma-AldrichP8920一种合成的多聚阳离子包被试剂，可增强细胞的静电粘附；用去离子水配制成0.1 mg/mL溶液，用量以覆盖盖玻片表面为宜；接种细胞前于25 °C孵育30分钟。
一抗，抗肌动蛋白（山羊来源）Santa Cruz BiotechnologySC-1615抗肌动蛋白抗体；多克隆，未偶联，通过抗山羊二抗进行检测。工作稀释比例为1:200。
一抗，抗IFN-β（小鼠来源）Aviva Systems BiologyOAPB00536抗IFN-β抗体；多克隆，未偶联，通过抗小鼠二抗进行检测。工作稀释比例为1:200。
一抗，抗p14ARF（兔来源）CalbiochemPC409抗p14ARF抗体；多克隆，未偶联，通过抗兔二抗进行检测。该产品已停产，若计划继续研究该靶点，需验证新的抗体。工作稀释比例为1:200。
二抗，抗兔，Alexa Fluor 488偶联Thermo Fischer ScientificA32731TR抗兔Alexa Fluor 488偶联抗体。工作稀释比例为1:500。
二抗，抗山羊，Alexa Fluor 555偶联Thermo Fischer Scientific A-21432抗山羊Alexa Fluor 555偶联抗体。工作稀释比例为1:500。
二抗，抗小鼠，Alexa Fluor 647偶联Thermo Fischer ScientificA-21235抗小鼠Alexa Fluor 647偶联抗体。工作稀释比例为1:500。
Tris缓冲盐水（TBS），10×储备液实验室自制—配制100 mL：将6.06 g Tris碱和8.77 g NaCl溶于80 mL去离子水中，用浓HCl调节pH至7.6，定容至100 mL，高压灭菌。使用时用去离子水1:10稀释得到工作液（1× TBS）（终浓度：50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.6）；可室温或4 °C保存最长3个月。
TBST（含0.05% Tween-20的TBS）实验室自制—配制10 mL：1 mL 10× TBS储备液 + 8.995 mL去离子水 + 5 µL Tween-20（0.05% v/v）；pH 7.6。作为染色步骤间的洗涤缓冲液；现用现配，在4 °C条件下可使用约1周。
Tris碱Sigma-Aldrich252859用于配制TBS储备液的缓冲剂；在免疫荧光实验的洗涤和稀释缓冲液中维持生理pH范围（pH 7.6）的稳定性。
Triton X-100（辛基酚聚氧乙烯醚非离子型去污剂）Sigma-AldrichX100配制10 mL：在9.99 mL 1× TBS中加入10 µL Triton X-100，得0.1% TX100；或在9.97 mL 1× TBS中加入30 µL，得0.3% TX100（根据靶标而定；核靶标通常需要较高浓度）。
胰蛋白酶-EDTAGibco25200056用于细胞解离。
Tween-20Sigma-AldrichP9416用于TBS中配制洗涤缓冲液（TBST）和抗体稀释液（含1% BSA的TBST）。

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