方法文章

平行 体内 小鼠乳腺中基因敲除与激活的筛选

DOI：

10.3791/71115

⸱

2026年7月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种可扩展的导管内CRISPR筛选方法，可实现并行 体内 小鼠乳腺中的基因敲除与激活研究

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

正向遗传学筛选通常以混合方式扰动数千个遗传元件，旨在构建大规模的基因型到表型的图谱。尽管此类筛选常在细胞培养系统中进行，但越来越多的证据表明 体内 筛选能够揭示出无法被重现的新生物学现象 体外然而，这一方法的广泛应用受到两个主要挑战的限制：一是研究主要集中于基因功能缺失型扰动，而非基因激活；二是将复杂的基因文库递送至特定组织面临重大的技术难题 体内为克服这些挑战，我们描述了一种简单且多功能的导管内注射策略，可通过生成数万个独立的上皮克隆，在小鼠乳腺中实现高效、快速的功能基因组筛选。此外，我们提供了文库构建、导管内注射、筛选解卷积以及CRISPR敲除和激活文库分析所需的全部细节，以实现全面研究 体内 筛选。利用这些工具——我们称之为CRISPR-KOALA（基因敲除与激活联合检测），已在包含从46个位点到五分之一个基因组范围的混合文库中，鉴定了编码区和非编码区基因组中的新型肿瘤抑制基因和癌基因。重要的是，该方法及分析策略可应用于其他器官，以研究任何基因在稳态或疾病状态下的生物学功能。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

功能基因组学筛选为大规模研究基因功能提供了强大的研究框架1CRISPR-Cas 基因编辑技术的发展使得可并行系统性地扰动数百至数千个基因，基于混合池的 CRISPR 筛选在哺乳动物细胞系中已成为现代癌症生物学研究的核心手段2。这些 体外 方法已鉴定出必需基因3肿瘤抑制因子4，以及合成致死相互作用5 在多种癌症背景下均如此。然而，一个主要局限在于无法捕捉肿瘤复杂的生物学特征 体内，包括与免疫系统和间质的相互作用、微环境中的营养梯度以及组织结构2. 与此局限性一致，近期研究已表明许多 真正有效的 癌症驱动基因未能产生可测量的影响 体外，尤其是当其功能依赖于细胞培养中所缺乏的微环境信号时6,7,8,9,10.

小鼠乳腺为研究提供了独特且极具优势的组织环境 体内 功能基因组学筛选。乳腺上皮细胞具有很强的再生能力，在动情周期中经历多轮克隆扩增，并形成分支状的导管网络结构，该结构易于接触且可进行遗传操作11,12,13这些特性支持了数十年的嵌合体遗传分析和谱系示踪实验，使乳腺成为研究组织稳态及疾病过程中细胞自主性及微环境依赖性基因功能的可操作体系。14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33重要的是，基因扰动可被限制在上皮细胞区室中，从而能够在完整的组织环境中直接研究上皮细胞特异性的转化驱动因素、细胞竞争、谱系保真度以及肿瘤进展。

尽管已开发出多种策略用于将基因扰动直接递送至成年乳腺组织 原位，但在高通量应用方面仍存在重大的技术障碍。腺病毒介导的Cre重组酶递送已广泛用于在成年乳腺中诱导条件性等位基因的体细胞重组34,35,36,37，提供了一种高效调控基因功能的方法，无需传统基因工程小鼠模型（GEMMs）所必需的复杂生殖系育种过程。尽管高滴度腺病毒也可将CRISPR-Cas9组分递送至组织驻留细胞，但这类载体不会整合到宿主基因组中38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49这严重限制了筛选规模至约10–55个基因，因为每个gRNA靶位点都必须使用分子倒置探针进行 individually 测序38,39,40,41,42,43,44,45,46,47此外，目前现有的导管内递送方法虽可直接进入乳腺导管系统，但需要通过侵入性外科手术暴露乳腺组织50 或依赖于使用相对的比较方法 大型Hamilton注射器，使用不便51尽管这些方法在病毒的局部递送方面有效，但相对更具侵入性，技术难度较高，且未针对 pooled lentiviral 文库的规模化递送进行优化。 综上所述，这些研究结果表明 原位 病毒扰动是可行的，但现有工具尚不支持高通量研究所需的稳定、混合且可检索序列的扰动方法 体内 CRISPR 筛选

为了解决这些局限性，我们及其他研究者已转向使用慢病毒载体整合技术，该技术可实现稳定且可遗传的基因修饰。与细胞培养系统相比， 体内 组织对单个器官内可产生的扰动细胞数量施加了严格限制，使得全基因组筛选变得不切实际。因此， 体内 CRISPR 筛选需要设计基于生物学信息、有针对性的文库，以在覆盖范围与可行性之间取得平衡。此外，大多数 体内 CRISPR 筛选，本文综述2，尽管越来越多的证据表明基因激活能够揭示互补且无重叠的生物学见解，但迄今为止的研究几乎完全集中在慢病毒介导的基因功能缺失扰动上52,53,54,55我们及其他研究团队此前已证明，将慢病毒CRISPR扰动整合至成年乳腺上皮组织，可实现稳定且可遗传的基因修饰。 原位 并且能够从基因组DNA中回收并进行定量36,55,56,57,58采用这种方法，我们进行了混合样本分析 体内 发现致癌转化新驱动因子的CRISPR筛选36,55，证实了慢病毒递送和CRISPR筛选在该体系中的可行性和生物学相关性。然而，这些研究也凸显出对一种简单、标准化且可扩展的实验方案的需求，该方案应易于广泛采用，并可拓展至在同一腺体中同时涵盖基因功能缺失和功能获得的筛选模型。

本文介绍了一种简单且多功能的导管内注射策略，可在成年小鼠乳腺中并行开展CRISPR基因敲除与激活文库的体内筛选，该方法称为CRISPR-KOALA55。CRISPR-KOALA采用常规的20-21 bp“单导向”（sg）RNA实现CRISPR-KO功能，或采用14 bp“失活导向”（dg）RNA实现CRISPR-A功能。dgRNA可高效引导Cas9至靶位点，但阻止Cas9核酸内切酶活性59,60,61，因此可在表达活性Cas9的同一只小鼠中同时实现基因敲除与基因激活两种模式。在dgRNA的trcr区域引入两个PP7发夹结构，可招募PP7衣壳蛋白:P65:HSF1转录激活复合物62，从而在体内实现基因的高效过表达55（图1）。该方法结合靶向gRNA文库设计、高滴度慢病毒制备以及利用玻璃毛细管进行非手术式导管内递送，可在保持组织结构和微环境相互作用的前提下，在乳腺中生成数万个空间上独立的上皮细胞克隆。重要的是，慢病毒整合至宿主基因组后，可通过高通量测序回收并定量gRNA，从而实现体内混合功能基因组筛选。综上，该策略可在表达Cas9的小鼠同一乳腺组织中，实现CRISPR-KO与CRISPR-A的并行或同步（在同一细胞内）基因扰动。

我们提供了一套详细的逐步操作方案，涵盖gRNA文库设计、慢病毒的制备与浓缩、导管内递送、文库解卷积及数据分析图1。综上所述，该方法为规模化应用提供了一个实用且可扩展的框架 体内 小鼠乳腺中的CRISPR基因敲除和/或激活筛选，可适用于研究基因在组织稳态、不同疾病背景下、其他组织以及其他物种（如大鼠）中的功能。

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方案

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所有动物实验均遵循加拿大动物护理委员会的指南，并已获得表型基因组学中心动物护理委员会（方案编号 26-0272H）的批准。

1. CRISPR 文库克隆

注意：本节描述了将阵列合成的寡核苷酸中的CRISPR基因敲除和CRISPR激活文库通过混合克隆方法插入慢病毒载体的过程。我们常规构建包含多达4,000个gRNA的文库，可在8至20只小鼠中以400X至1,000X的覆盖深度进行筛选。gRNA数量和覆盖深度可根据需要调整，这将影响维持统计功效所需的小鼠数量。我们建议最低覆盖深度保持在400X，这对于强效的获得性功能表型通常已足够。

  1. 向导RNA文库设计
    1. 为下游CRISPR文库设计，汇总单次实验中拟筛选的所有小鼠基因，分别为CRISPR敲除（CRISPR-KO）文库和CRISPR激活（CRISPR-A）文库建立独立的靶基因列表。
      注意：CRISPR-KO 和 CRISPR-A 文库需分别构建，可在慢病毒转导阶段合并，以实现同步筛选。
    2. 对于CRISPR-KO文库，使用高分预测算法（如CRISPick）为每个基因选择四到五个单导向RNA（sgRNA）62,63，CHOPCHOP64，或 VBC 评分65.
      注意：VBC评分具有极高的效能和靶向活性66无论使用何种工具，均应优先选择预测靶向活性高、脱靶可能性最小且靶向编码外显子的向导序列。
    3. 对于CRISPR-A文库，使用CRISPick为每个基因选择8到10条向导RNA62,63 或 CHOPCHOP64对于允许用户自定义向导序列长度的工具（如 CHOPCHOP），在生成向导序列前，应将向导长度设置为 14 bp。若使用仅能生成 20 bp 向导序列的工具，则可通过保留原间隔序列邻近基序（PAM）5'端紧邻的 14 bp 序列，将其转换为失活向导 RNA（dgRNA），以靶向基因的启动子区域。
      注意：dgRNA 是截短的引导序列，旨在实现基于 CRISPR 的转录激活，其有效性约为全长 sgRNA 的 50–85%55 不诱导DNA切割59,60,61.
    4. 将对应于单个实验的所有sgRNA或dgRNA归入单独的列表中，以实现统一的克隆、病毒生产及 体内 筛选
      注意：待联合筛选的sgRNA和dgRNA将在病毒制备完成后进行混合。
    5. 生成用于CRISPR-KO和CRISPR-A筛选的 pooled 阴性对照文库，包括非靶向对照55,67 非基因区gRNA序列68如先前所述，以消除与基因破坏或激活无关的背景效应。
      ​注意：如有需要，可分别构建非靶向和非基因区gRNA文库，以创建两个独立的阴性对照文库。
  2. 寡核苷酸池设计与扩增
    1. 设计混合寡核苷酸，使每个gRNA包含靶向序列、与目标慢病毒载体骨架兼容的限制性内切酶突出末端，以及库特异性引物序列，以实现从复杂的寡核苷酸池中选择性扩增图1，表1).
    2. 为每个gRNA文库分配一对独特的引物，以便从共用的寡核苷酸池中独立扩增各个文库。独特的引物对列于 表1.
    3. 从商业化的芯片合成平台订购混合寡核苷酸文库，确保每个文库中所有gRNA的等摩尔比例。
    4. 使用针对文库的特异性引物，以混合的寡核苷酸模板为模板，在以下反应体系中扩增单个gRNA文库。可根据具体DNA聚合酶推荐的组分调整反应体系。准备三份含混合寡核苷酸模板的反应，以及一份无模板的阴性对照反应。
      4 ng 混合寡核苷酸模板
      2.5 μL 10 μM 正向文库特异性引物
      2.5 μL 10 μM 反向文库特异性引物
      10 μL 5x 反应缓冲液
      0.5 μL 高保真DNA聚合酶
      X μL 无核酸酶水
      50 μL 总体积
    5. 使用以下扩增循环条件进行PCR扩增，退火温度需根据文库特异性引物的熔解温度进行调整：
      1个循环：98 °C 预变性30秒
      18个循环：98 °C 变性10 s，62–65 °C 退火20 s，72 °C 延伸3 s
      1个循环：72 °C 下5分钟
      注意：为保持文库中gRNA的均等代表性，扩增循环数不得超过18–19个。
    6. 在2.5%琼脂糖凝胶中以120 V电泳约45分钟分离PCR产物，并切下对应于预期gRNA插入片段大小的条带（约100 bp，具体取决于引物设计）； 图2A).
    7. 使用凝胶回收试剂盒纯化PCR产物，并在最后洗脱步骤中用20 μL超纯水洗脱。
      注意：（暂停点）纯化的gRNA插入片段可在克隆前于-20 °C保存。
  3. 慢病毒骨架的制备与消化
    1. 准备含有可移除填充序列的慢病毒骨架质粒，用于克隆gRNA插入片段。对于 体内 CRISPR-KO 和 CRISPR-A 文库分别使用 pLKO-Cre（Addgene 质粒 #158032 或 256774）和 pXPR502-PPH-Cre（Addgene 质粒 #256776）。
    2. 使用适当的限制性内切酶和缓冲液，在200 μL总反应体系中消化5–10 μg的慢病毒骨架DNA。pLKO-Cre CRISPR-KO骨架使用Esp3I，pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A骨架使用SapI。
      5–10 μg 骨架质粒
      20 μL 10x 酶缓冲液
      5 μL 限制性内切酶
      X μL 无核酸酶水
      ​200 μL 总体积
    3. 在 37 °C 下孵育消化反应 2–3 小时。
    4. 向每个消化反应中加入 2 μL 重组碱性磷酸酶，在 37 °C 下孵育 1 小时，以去磷酸化消化后的载体骨架。
    5. 在1%琼脂糖凝胶上分离消化产物，并切下对应于线性化载体骨架的条带（图2B，C)
      注意：对于这两种载体，填充片段均表现为一条明显的条带，大小约为2000-2500 bp，具体位置取决于所使用的载体。
    6. 使用凝胶回收试剂盒纯化切除的载体DNA，并用最小体积的超纯水洗脱以保持高DNA浓度（通常为20 μL）。
      注意：（暂停点）纯化的消化后骨架可在连接反应前于 -20 °C 保存。
  4. gRNA文库的消化与连接
    1. 使用750 ng纯化的慢病毒骨架DNA、43 ng gRNA文库插入DNA、3 μL限制性内切酶、7.5 μL T4 DNA连接酶、15 μL 10 mM ATP，以及适量的反应缓冲液和无菌蒸馏水，配制总反应体积为150 μL的一体化消化-连接反应体系。
      注意：使用与质粒骨架消化步骤中相同的限制性内切酶。当采用推荐的骨架时，每750 ng纯化的慢病毒骨架与43 ng文库插入片段DNA的组合可产生约1:7的载体与插入片段摩尔比。
    2. 将每个连接反应混合物均分为三份等量 aliquot，以提高转化效率和文库复杂性。
    3. 准备一个不含gRNA插入片段但含有骨架DNA的单个阴性对照反应，以评估背景连接水平。
    4. 30 °C 下孵育消化-连接反应过夜。
    5. 次日早晨，向每份反应分装液中加入1 μL相应的限制性内切酶，在37 °C孵育1小时，以确保载体完全消化。
    6. 向每个反应中加入2 μL的10 mM ATP和2 μL T4 DNA连接酶，在25 °C孵育2–3小时以完成连接反应。
    7. 将每个文库的三个独立消化-连接反应合并，使用基于柱的寡核苷酸纯化方法对反应产物进行纯化，并用21 μL超纯无菌去离子水洗脱。将单个纯化的阴性对照反应用7 μL超纯无菌去离子水洗脱。
      注意：不要使用含有盐或EDTA的缓冲液洗脱连接产物，因为这些成分会显著降低细菌电转化效率。（暂停点）纯化的连接产物可在电转化前于-20 °C保存。
  5. 文库电穿孔与扩增
    1. 将0.1 cm电穿孔比色皿、含有2 μL纯化连接产物分装液的微量离心管，以及14 mL圆底聚丙烯培养管置于冰上预冷至少20分钟，再进行电穿孔。
    2. 将电转感受态细菌细胞置于冰上解冻，用移液器将25 μL细胞与2 μL纯化的连接产物在预冷的微量离心管中轻轻混匀。
    3. 将细胞-DNA混合物转移至预冷的0.1 cm电穿孔比色皿中，在1.8 kV、25 μF和200–600 Ω条件下进行电穿孔。
      注意：一次成功的电穿孔通常会产生 4.6 ms 至 4.9 ms 之间的时间常数。
    4. 立即向比色皿中加入1 mL预热至37 °C的电转感受态细胞配套复苏培养基，轻轻重悬细胞，然后将悬液转移至14 mL圆底聚丙烯管中。
    5. 将回收的细胞在30 °C、180 rpm条件下振荡培养90分钟。
    6. 将回收的细胞用90 μL LB肉汤稀释后取10 μL，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板，30 °C过夜培养，以评估转化效率和背景连接情况。
      注意：成功克隆后，含插入片段的平板上应出现数百个菌落，而无插入片段的对照平板上菌落应很少（或无）。> 30）仅含骨架的阴性对照平板上的菌落（图3).
    7. 通过从U6启动子区域进行正向Sanger测序，挑选约10个菌落进行小量质粒提取（miniprep）以进一步验证文库。成功构建的文库将具有 < 10个质粒小提物中，90%含有gRNA的清晰测序结果，且gRNA序列在10个样本间无重复。此外，进行限制性内切酶消化 将小量提取的质粒和混合的质粒文库（步骤1.5.10）进行琼脂糖凝胶电泳，以检测条带大小，并确保慢病毒载体未发生异常重组。
      注意：可通过将稀释平板上的菌落数与文库中gRNA的总数进行比较来评估文库的代表性，目标为实现1,000倍的覆盖深度。可使用多次连续稀释以辅助该计算。
    8. 如果转化效率足够，将剩余的回收细胞接种到含有适当抗生素的15 cm LB-琼脂平板上，于30 °C过夜培养，以获得密集的菌落草坪。
      注意：将复苏的细胞以每块15 cm LB琼脂平板接种100 μL，共接种十块平板，以获得足够数量的菌落。
    9. 第二天，使用细胞刮刀 将细菌菌落刮入含有氨苄青霉素的500 mL LB液体培养基中，以制备代表克隆gRNA文库的单个细菌培养物。
    10. 在30 °C条件下振荡培养合并的细菌菌液约3小时，随后使用质粒大提试剂盒提取质粒DNA。

2. 慢病毒生产的制备 体内 筛选

注意：对于导管内给药和 体内 汇集筛选，慢病毒制备物必须浓缩以达到高滴度（理想范围为 1 x 108 pfu/mL 和 1 × 109 pfu/mL）以确保乳腺上皮细胞的高效转导。以下方案描述了针对高滴度慢病毒生产的优化流程 体内 使用。

  1. 慢病毒生产细胞的制备
    1. 在添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293TN细胞，并于37 °C、5% CO₂条件下培养2.
    2. 每2–3天传代一次细胞，以维持对数生长期，并确保细胞融合度不超过90%。使用传代次数在 <20，以实现最佳病毒产量。
    3. 转染前一天，将15 cm的组织培养板用聚-L-赖氨酸（0.02 mg/mL）在室温下孵育1小时进行包被。每批次病毒制备需准备九块培养板。
    4. 移除聚-L-赖氨酸溶液，并用磷酸盐缓冲液洗涤平板两次。
    5. 接种 1.1 × 107 将HEK293TN细胞接种至九块经多聚-L-赖氨酸包被的15 cm组织培养板上，确保细胞在转染时汇合度达到约90%。
      注意：对于不需要最高病毒滴度的应用，可将慢病毒生产规模缩小至较少的培养板（例如三块或六块），相应减少产量。转染所用试剂（质粒DNA、PEI和DMEM）应按比例减少。
  2. 基于PEI的慢病毒转染
    1. 使用三质粒系统制备用于慢病毒生产的质粒DNA，包括95 μg gRNA文库质粒、95 μg包装质粒psPAX2（Addgene质粒#12260）和65 μg VSV-G包膜质粒pMD2.G（Addgene质粒#12259）。
    2. 将用于慢病毒生产的三种质粒溶于10.8 mL无血清DMEM中，涡旋振荡约10秒，充分混匀。
    3. 向稀释的DNA溶液中逐滴加入366 μL 1 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI），涡旋振荡约10秒以充分混匀，室温孵育10–30分钟，形成DNA-PEI复合物。
    4. 在复合物形成过程中，吸出 HEK293TN 培养板中的培养基，并加入 14 mL 无血清 DMEM。
      注意：胎牛血清可能抑制细胞对质粒的摄取。
    5. 将1.2 mL DNA-PEI复合物逐滴加入培养板中，轻轻摇动以确保均匀分布。
    6. 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 6–8 小时。
    7. 更换每块培养板中的培养基，加入 20 mL 预热的 DMEM，该培养基添加 10% 胎牛血清（不含 1% 青霉素-链霉素），并在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续培养细胞2.
      注意：不建议进行过夜转染，因为延长暴露于PEI以及缺乏血清会降低病毒产量。
  3. 病毒收获与超速离心
    1. 将40 g蔗糖、11.7 g氯化钠、4 mL 1 M HEPES（pH 7.4）和1 mL 0.5 M EDTA（pH 7.9）溶于适量无菌去离子水中，定容至200 mL，通过0.45 μm低蛋白结合聚醚砜滤器过滤除菌。该溶液可在4 °C保存数月。
    2. 转染后48–72小时收集慢病毒上清液。
    3. 将10 mL添加了10%胎牛血清的DMEM通过0.45 μm低蛋白结合聚醚砜滤器。弃去滤过液。将上清液加载至滤器中，并施加真空。
      注意：如果无法立即进行浓缩，请将澄清的病毒上清液在 4 °C 下保存过夜。
    4. 向超速离心管中加入30 mL澄清的病毒上清液。
    5. 在澄清的病毒上清液下方缓慢加入4 mL蔗糖垫溶液。
    6. 将超速离心管放入适配的摆桶转子适配器中，并精确平衡离心管。
    7. 将离心管在 104,000 × g 在 4 °C 下至少 2 小时。
      注意：必须使用摆桶式转子（如 Beckman JS24.38 转子），才能通过蔗糖垫充分沉淀病毒。
    8. 小心倾倒上清液，避免扰动病毒沉淀，后者可能呈现为管底一层浅白色或半透明的薄膜。
    9. 让离心管在空气中干燥至少10分钟，并用实验室擦拭纸尽可能去除管内残留液体，注意不要扰动沉淀。
      注意：试管的充分干燥对于获得高病毒浓度至关重要，因为它可减少最终的回收体积。
    10. 将病毒沉淀重悬于20 μL预冷的磷酸盐缓冲液中，轻轻吹打混匀，注意避免产生气泡。
    11. 将试管置于冰上，轻轻振荡孵育2小时，以充分重悬病毒沉淀。
    12. 将浓缩的病毒转移至洁净的微量离心管中，于2,000 × g离心澄清溶液 g 4 °C下离心5分钟。
      注意：此离心步骤旨在去除可能堵塞手术过程中注射针头的碎屑和残留颗粒。
    13. 将浓缩的病毒分装成单次使用体积，以避免反复冻融，并于 -80 °C 保存。
  4. 使用LSL-tdTomato小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）进行慢病毒滴度测定
    1. 在感染前一天，将100,000个LSL-tdTomato MEFs（源自Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]）接种于6孔板中，培养基为添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM，于37 °C、5% CO₂条件下培养2额外接种一个孔用于细胞计数。
      注意：LSL-tdTomato 胚胎成纤维细胞（MEFs）可作为慢病毒中 Cre 重组酶的报告系统。也可使用任何适用于其他载体病毒滴度测定的合适报告系统。
    2. 次日，从一个额外的孔中计数LSL-tdTomato MEFs的数量，以量化感染时存在的细胞数量。
    3. 用含有10%胎牛血清的2 mL杜尔贝科改良伊格尔培养基，对编码Cre重组酶的浓缩慢病毒进行系列稀释。通常情况下，0.4 μL、0.1 μL和0.025 μL的浓缩病毒可产生清晰的动态线性范围图4A–D).
    4. 向每孔LSL-tdTomato MEFs中加入2 mL病毒稀释液，并向每孔加入2 μL的10 mg/mL polybrene。
    5. 以400 × g离心感染MEF细胞 g 37 °C 下孵育 90 分钟。
    6. 更换为 2 mL 添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 病毒培养基，于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞2 48–72 小时。
    7. 通过荧光显微镜或流式细胞术定量分析 tdTomato 阳性细胞，以确定各稀释度下的感染细胞比例。
    8. 根据感染细胞的比例和感染时存在的细胞数量计算功能滴度。
      ​注意：CRISPR-KO 和 CRISPR-A 病毒需分别制备、浓缩和滴定。在导管内注射前，使用 LSL-tdTomato MEFs 测定其功能滴度，并据此将两种病毒按预定比例混合。
  5. 质粒与慢病毒文库的质量评估
    1. 为确保gRNA文库在克隆过程中具有足够的深度/覆盖度，并且所有gRNA在克隆及病毒制备过程中均得以保留，强烈建议对质粒池以及转导后的MEFs进行测序。
    2. 为评估慢病毒覆盖度，用慢病毒感染MEFs >基于计算的病毒滴度进行1000倍覆盖。此步骤中无需确保细胞的单次感染。
    3. 48–72 小时后，使用胰蛋白酶或细胞刮刀收集细胞，并离心成团。使用商品化的基因组DNA提取试剂盒提取DNA。
    4. 使用第5节中所述方案，对1 µg质粒和3 µg提取的MEF DNA进行测序。对于大多数定制文库，深度测序达到500万条读长已足够 <5000 个 gRNA。
      注意：存在强相关性（R2> 0.6）在质粒文库的读段之间，以及向导序列的相对均等分布（>文库中70%的向导序列在1个对数数量级范围内，且无单一向导序列占据主导，表明质量良好（图4E).

3. 小鼠乳腺导管内慢病毒注射

  1. 针头与病毒稀释
    1. 使用微毛细管拉针仪拉制玻璃微毛细管针，制备出适合注入9–10 μL体积的细尖毛细管。用一对精细镊子折断针尖最末端。
      注：最佳位置应使针头尺寸足够大以便于液体装载，同时又足够细，能够轻松插入乳头开口。
    2. 将慢病毒制剂用无菌磷酸盐缓冲液稀释至终浓度为1 × 107 pfu/mL，并添加0.05%（w/v）亮蓝FCF染料。
    3. 若需混合CRISPR-KO与CRISPR-A病毒以在同一复杂文库中进行筛选，应使用无菌磷酸盐缓冲液将两种文库调整至相同的病毒滴度，并按比例混合，以确保两个文库中的gRNA均等表达。
  2. 小鼠的导管内注射前准备
    1. 使用4%异氟烷（氧气流速1 L/min）对成年雌性小鼠（8–20周龄）进行麻醉，并在双眼涂抹无菌眼用润滑剂，以防止操作过程中角膜干燥。
      注：导管内注射为非侵入性操作，无需镇痛处理。本实验可使用Rosa26-LSL-Cas9、H11-Cas9或Rosa-LSL-tdTomato小鼠。
    2. 将小鼠仰卧固定于设定为低档的加热垫上以维持体温，并在整个操作过程中通过鼻罩持续给予2%异氟烷（氧气流速1 L/min）维持麻醉状态。
    3. 使用无菌棉签蘸取脱毛膏，在第三胸段和第四腹段乳头周围约0.5 cm半径范围内以环形方式涂抹10–15秒。立即用无菌纱布和无菌水清除脱毛膏，以防皮肤刺激。
      注：第三和第四乳腺通常最容易注射。也可采用相同方法准备第二和第五乳腺进行注射。
    4. 使用无菌纱布依次以70%异丙醇和碘伏擦拭乳头周围皮肤进行消毒。
    5. 将小鼠置于生物安全柜内的解剖显微镜下，以便清晰观察乳头结构。
    6. 使用经70%乙醇清洁的精细镊子，轻轻去除覆盖在乳头表面的死亡皮肤，暴露导管开口。
      注：该层死亡角质化组织附着较松，可能阻碍针头进入。去除时不应损伤活性皮肤或皮下组织。
  3. 导管内注射
    1. 将8 μL稀释后的病毒液吸入拉制好的玻璃微毛细管中。
    2. 用一对精细镊子夹住乳头区域，将针尖轻柔插入乳头开口（图5A）。位置恰当的针头应能以最小阻力进入导管。在5–10秒内缓慢将病毒悬液注入乳腺导管。
      注：8 μL浓度为1 × 107 pfu/mL的慢病毒可实现约30%的腔面乳腺上皮细胞感染率和5%的基底乳腺上皮细胞感染率，而对间质的感染可忽略不计（< 0.5%）36。可根据需要调整病毒滴度以获得更高或更低的感染率。
    3. 在注射过程中，通过解剖显微镜观察亮蓝染料的扩散情况。若观察到染料在皮肤下方的导管网络中扩散，即可确认导管内递送成功（图5B）。
    4. 若染料聚集于乳头旁的乳腺脂肪垫内而非沿导管树分布，则提示注射失败（图5C）。
    5. 对双侧第三胸段和第四腹段乳腺重复注射操作，每只小鼠共注射四个乳腺。
      注：随着操作经验积累，导管内递送成功率可达>95%。局限于脂肪垫的失败注射未见不良反应，其余乳腺仍可继续使用。可通过免疫组织化学和流式细胞术进一步验证注射效果（图5D、E）。
    6. 停止麻醉，将小鼠转移至清洁的恢复笼中。
    7. 持续监测小鼠直至其完全恢复自主活动能力，并在观察到正常行为后将其送回指定的生物安全饲养环境。
    8. 注射后第三天，进行全笼更换，将所有笼具和垫料作为病毒废弃物处理，并将小鼠转移至清洁笼具，之后可返回常规饲养环境。

4. 从乳腺和肿瘤中分离基因组DNA

注意：根据动物护理指南，通过 CO2 暴露或麻醉剂过量后行颈椎脱位法处死小鼠。根据监管指南，在预定时间点或人道终点时收获乳腺组织或乳腺肿瘤。感染细胞最早可在慢病毒感染后 48 小时36,55 收获，最晚可在野生型小鼠注射后 5 个月以上36，或在致癌背景小鼠中注射后 >24 个月收获55。以下步骤应在使用 DNA 消除剂清洁的空间中进行，并使用不含含 sgRNA/dgRNA 盒子质粒的设备。即使微量质粒 DNA 也可能导致组织样本污染，因此应运行后续深度测序 PCR 及阴性（无组织）对照，以确保制备过程无污染。

  1. 组织解离
    1. 对于乳腺组织，将每份乳腺组织置于含有2 mL完全型Epicult-B培养基（小鼠）的15 mL锥形管中，并加入0.2 mL温和型胶原酶/透明质酸酶进行消化，于37 °C孵育过夜。
    2. 在室温下以450 × g离心5分钟，收集解离后的细胞沉淀。
    3. 使用经牛血清白蛋白包被的移液枪头小心转移上层脂肪层至新的15 mL锥形管中，弃去剩余上清液。
      注意：此步骤中的上层脂肪层通常含有尚未分离、仍与脂肪组织结合的上皮类器官。将该组分在单独的管中处理可显著提高上皮细胞的回收率。
    4. 用5 mL磷酸盐缓冲液分别洗涤脂肪组分和细胞沉淀一次，在室温下以450 × g离心5分钟，弃去上清液。
    5. 将洗涤后的脂肪组分和来自同一乳腺组织的细胞沉淀合并至一个含有5 mL磷酸盐缓冲液的15 mL锥形管中。
    6. 以450 × g离心5分钟收集合并物，弃去上清液。
    7. 对于乳腺肿瘤组织，使用无菌剪刀或手术刀将其切成小块，直接转移至2 mL微量离心管中。
  2. 基因组DNA提取
    ​注意：可按照试剂盒说明书使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue试剂盒提取基因组DNA，或采用以下酚-氯仿法。
    1. 通过混合5 mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）、1 mL EDTA（pH 8.0）、25 mL 5 M NaCl和50 mL 10% SDS，并用无菌蒸馏水定容至500 mL，配制DNA裂解缓冲液。
    2. 向每个样品中加入1 mL DNA裂解缓冲液和10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），通过反复颠倒充分混匀。
    3. 于56 °C孵育过夜，以实现完全裂解。
    4. 在室温下以16,000 × g离心5分钟，沉淀不溶性碎片。
    5. 将澄清的上清液转移至新的2 mL微量离心管中。
      警告：酚:氯仿:异戊醇具有毒性和腐蚀性。所有涉及有机溶剂的操作均须在化学通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备。
    6. 加入等体积的酚:氯仿:异戊醇，涡旋剧烈振荡约15秒，直至形成均一混合物。
    7. 在4 °C下以16,000 × g离心10分钟，以分离有机相和无机相。
    8. 小心地将上层水相转移至新管中，避免扰动中间相。
      注意：避免吸取白色中间相中的物质，以最大限度减少蛋白质和RNA污染。
    9. 向回收的水相中加入0.7倍体积的异丙醇，涡旋剧烈振荡约15秒。
    10. 在4 °C下以16,000 × g离心10分钟。
    11. 小心弃去上清液，并用500 μL 70%乙醇冲洗DNA沉淀。
    12. 在4 °C下以16,000 × g离心10分钟，彻底去除乙醇。
    13. 将DNA沉淀在室温下空气干燥10分钟。
    14. 将DNA沉淀重悬于50 μL无菌蒸馏水中。
    15. 于37 °C孵育1小时，或于4 °C过夜，以促进基因组DNA完全重悬。
    16. 使用NanoDrop或荧光定量法测定DNA浓度和纯度。

5. CRISPR 文库的下一代测序


注意：生成参考样本，以实现对gRNA随时间变化的倍数变化进行计算。可在感染后第3天收获的转导MEF细胞（第2节）或乳腺组织（第4节），以及原始质粒大提产物，用于确定起始文库和病毒原液中的向导序列丰度。

  1. 从基因组DNA中进行gRNA表达盒的PCR扩增
    1. 使用 表2 中列出的引物对对样品进行唯一性索引，以便在测序后实现最多306个样品的多重检测与解复用。
    2. 以1 µg基因组DNA为模板，配制总反应体积为50 µL的PCR反应体系，其中包含25 µL的2x Q5 Master Mix、2.5 µL的10 µM正向引物和2.5 µL的10 µM反向引物。
    3. 同时设置无模板对照反应，以监测是否存在污染。
    4. 采用以下循环条件进行PCR扩增，退火温度需根据文库特异性引物的熔解温度进行调整：
      1个循环：98 °C，30秒
      5个循环：98 °C，10秒；68 °C（每循环降低1 °C），10秒；72 °C，15秒
      20个循环：98 °C，10秒；63 °C，30秒；72 °C，15秒
      1个循环：72 °C，2分钟
    5. 将PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶上电泳，以确认扩增片段大小正确。
    6. 对于基于pLKO的sgRNA文库，应确认约306 bp处有条带；对于基于pXPR502的dgRNA文库，应确认约430 bp处有条带（图6）。
      注意：清晰的无模板对照 可确保试剂的纯净性 ，并证实实验无交叉污染。
    7. 使用合适的DNA纯化方法纯化PCR产物，并采用荧光定量法测定DNA浓度。
  2. 下一代测序
    1. 根据预期的文库复杂性和样品克隆性确定所需的测序深度。
      注意：对于疑似为克隆性的肿瘤，每个样品约100万条读段即可准确量化向导序列的丰度。若需从乳腺组织计算测序深度，可将文库中向导序列的数量乘以1000倍覆盖深度，再乘以每细胞6 pg基因组DNA，以计算每个样品应进行PCR扩增的基因组DNA总质量。测序所需的总读段数等于文库中向导序列数量乘以1000。
    2. 将来自不同样品的纯化文库以等摩尔浓度混合。
    3. 使用短读长Illumina测序平台对混合文库进行测序。
  3. 数据分析
    1. 利用样品特异性索引对原始测序FASTQ文件进行解复用。
    2. 使用Trimmomatic69将读段修剪至gRNA原间隔序列。对于CRISPR-A样品，将读段修剪为14 bp；对于CRISPR-KO样品，从正向引物末端起修剪为20 bp。
    3. 使用Bowtie70将修剪后的读段比对至相应的gRNA参考文库。CRISPR-KO比对参数为 -v 2 和 -m 1 ，CRISPR-A及混合文库的比对参数为 -v 2 和 -m 2 。
      注意：通常超过90%的读段可成功比对。比对率低通常由修剪错误、输入文件格式不正确或PCR过程中样品污染所致。
    4. 使用MAGeCK72中的 count 功能对每个gRNA的比对读段进行定量，生成最终的gRNA计数表，用于后续分析。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提供了一种在小鼠乳腺中进行混合型体内 CRISPR 筛选的实验方案。该流程可实现从头到尾的完整操作，包括：基于寡核苷酸阵列设计并扩增混合的 gRNA 文库，将 gRNA 文库克隆至慢病毒载体骨架，制备高滴度慢病毒，通过乳腺导管内递送将混合慢病毒文库导入成年小鼠乳腺组织，以及回收 gRNA 并通过测序手段对文库中各成分的代表性进行解析（图 1）。

首先通过琼脂糖凝胶电泳评估混合gRNA文库的扩增和克隆是否成功。gRNA文库的PCR扩增产生清晰的条带，表明来自混合寡核苷酸芯片阵列的均一扩增（图2A）。对pXPR502 PPH-Cre和pLKO Cre载体骨架进行限制性酶切，可实现线性化骨架与填充片段的明显分离（图2B、C）。高效的酶切及骨架的纯净回收对于在克隆过程中最大限度减少背景连接并实现高文库复杂性至关重要。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

混合池构建中的一个关键考虑因素 体内 CRISPR筛选的关键在于实现足够的文库覆盖，同时保持稀疏的单细胞转导，以维持克隆分辨率2在小鼠乳腺中，上皮区室保守地包含约 3.5 × 105 每腺体细胞数36在平均慢病毒转导率为15%的条件下（该转导率可最大限度降低单个细胞多重感染的频率），导管内递送可实现约5 × 104 每腺体转导的上皮细胞36,55因此，同时对第三胸段和第四腹段乳腺进行双侧注射，可获得约 2 × 105 每只小鼠转导的上皮细胞36,55根据这些参数，包含 4,000 个 gRNA 的文库（相当于 CRISPR-KO 筛选约 1,000 个基因或 CRISPR-A 筛选约 500 个基因）需要约 4 × 10

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S. 是 ViVerita Therapeutics 的顾问及创始人，其实验室与 ViVerita Therapeutics 拥有赞助研究协议和服务协议。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢实验室所有成员对本工作相关问题提出的宝贵意见和讨论。我们还要感谢并致谢加拿大安大略省多伦多市伦德尔-塔嫩鲍姆研究所（LTRI）表型基因组中心在小鼠实验方面提供的全部帮助与专业支持。本研究获得了加拿大卫生研究院项目资助（PJT462506）、特里·福克斯研究研究所项目资助（TFRI 项目 #1107）以及尼科尔家族基金会对 D.S. 的资助。E.R.L. 获得了加拿大癌症协会研究培训奖和弗兰克·弗莱彻纪念基金的支持。 K.N.A. 获得了 H.L. 霍姆斯博士后奖以及加拿大癌症研究协会资助（编号 1318698 和 26089）的支持。J.N. 获得了加拿大卫生研究院加拿大研究生奖学金—硕士阶段以及加拿大卫生研究院博士研究奖（#193389）的支持。Y.L. 获得了加拿大卫生研究院研究卓越、多样性与独立性博士后奖学金（#ED6-190718）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 微米滤膜SigmaS2HVU02RE
12k 或 92k 寡核苷酸芯片Customarray Inc. (Genscript)
15 cm 细胞培养板CorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
碱性磷酸酶NEBM0290L
氨苄青霉素Fisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart 缓冲液NEBB6004S
深度测序（Next-Seq 或 Hi-Seq）Illumina
DNAesy 血液与组织 DNA 提取试剂盒Qiagen69506
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基Wisent319-015-CL
Endura 电转感受态细胞Lucigen60242-1
EpiCult-B 小鼠培养基试剂盒Stemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
胎牛血清Wisent090-150
凝胶 DNA 纯化试剂盒Zymo ResearchD4008
Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔比色皿BioRad1652089
温和型胶原酶/透明质酸酶Stemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
高速离心机Beckman CoulterMLS-50
Kim-wipe 擦拭纸Kimberly-Clark34155
LB 琼脂Wisent Technologies800-011-LG
微量移液器拉制仪Sutter InstrumentP97
质粒小提试剂盒Frogga BioPDH300
NEBuffer 3.1（BsmBI 缓冲液）NEBR0580L
寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒Zymo ResearchD4061
寡核苷酸纯化试剂盒Zymo researchD4060
PAGE 纯化的 Illumina 测序引物IDT DNA
PCR 微量移液器Drummond5-000-1001-X10
PEI（聚乙烯亚胺）Sigma408727-100ML
青霉素和链霉素Wisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
聚-L-赖氨酸SigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 聚合酶 2x 预混液NEBM0494L
Qubit 荧光定量系统InvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
R26-LSL-TdTomato 小鼠Jackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA 连接酶NEBM0202L
超速离心管Beckman Coulter344058
真空过滤装置Fisher ScientificSCHVU02RE

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