本方案描述了一种可扩展的导管内CRISPR筛选方法，可实现并行 体内 小鼠乳腺中的基因敲除与激活研究
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本文内容
摘要
摘要
正向遗传学筛选通常以混合方式扰动数千个遗传元件，旨在构建大规模的基因型到表型的图谱。尽管此类筛选常在细胞培养系统中进行，但越来越多的证据表明 体内 筛选能够揭示出无法被重现的新生物学现象 体外然而，这一方法的广泛应用受到两个主要挑战的限制：一是研究主要集中于基因功能缺失型扰动，而非基因激活；二是将复杂的基因文库递送至特定组织面临重大的技术难题 体内为克服这些挑战，我们描述了一种简单且多功能的导管内注射策略，可通过生成数万个独立的上皮克隆，在小鼠乳腺中实现高效、快速的功能基因组筛选。此外，我们提供了文库构建、导管内注射、筛选解卷积以及CRISPR敲除和激活文库分析所需的全部细节，以实现全面研究 体内 筛选。利用这些工具——我们称之为CRISPR-KOALA（基因敲除与激活联合检测），已在包含从46个位点到五分之一个基因组范围的混合文库中，鉴定了编码区和非编码区基因组中的新型肿瘤抑制基因和癌基因。重要的是，该方法及分析策略可应用于其他器官，以研究任何基因在稳态或疾病状态下的生物学功能。
引言
功能基因组学筛选为大规模研究基因功能提供了强大的研究框架1CRISPR-Cas 基因编辑技术的发展使得可并行系统性地扰动数百至数千个基因，基于混合池的 CRISPR 筛选在哺乳动物细胞系中已成为现代癌症生物学研究的核心手段2。这些 体外 方法已鉴定出必需基因3肿瘤抑制因子4，以及合成致死相互作用5 在多种癌症背景下均如此。然而，一个主要局限在于无法捕捉肿瘤复杂的生物学特征 体内，包括与免疫系统和间质的相互作用、微环境中的营养梯度以及组织结构2. 与此局限性一致，近期研究已表明许多 真正有效的 癌症驱动基因未能产生可测量的影响 体外，尤其是当其功能依赖于细胞培养中所缺乏的微环境信号时6,7,8,9,10.
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方案
所有动物实验均遵循加拿大动物护理委员会的指南，并已获得表型基因组学中心动物护理委员会（方案编号 26-0272H）的批准。
1. CRISPR 文库克隆
注意：本节描述了将阵列合成的寡核苷酸中的CRISPR基因敲除和CRISPR激活文库通过混合克隆方法插入慢病毒载体的过程。我们常规构建包含多达4,000个gRNA的文库，可在8至20只小鼠中以400X至1,000X的覆盖深度进行筛选。gRNA数量和覆盖深度可根据需要调整，这将影响维持统计功效所需的小鼠数量。我们建议最低覆盖深度保持在400X，这对于强效的获得性功能表型通常已足够。
- 向导RNA文库设计
- 为下游CRISPR文库设计，汇总单次实验中拟筛选的所有小鼠基因，分别为CRISPR敲除（CRISPR-KO）文库和CRISPR激活（CRISPR-A）文库建立独立的靶基因列表。
注意：CRISPR-KO 和 CRISPR-A 文库需分别构建，可在慢病毒转导阶段合并，以实现同步筛选。 - 对于CRISPR-KO文库，使用高分预测算法（如CRISPick）为每个基因选择四到五个单导向RNA（sgRNA）62,63，CHOPCHOP
- 为下游CRISPR文库设计，汇总单次实验中拟筛选的所有小鼠基因，分别为CRISPR敲除（CRISPR-KO）文库和CRISPR激活（CRISPR-A）文库建立独立的靶基因列表。
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结果
本文提供了一种在小鼠乳腺中进行混合型体内CRISPR筛选的实验方案。该流程可全程用于从寡核苷酸阵列设计并扩增混合gRNA文库，将gRNA文库克隆至慢病毒载体，制备高滴度慢病毒，通过乳腺导管内递送将混合慢病毒文库导入成年小鼠乳腺，并回收gRNA，进而通过基于测序的方法解析文库中gRNA的代表性分布（图1）。
首先通过琼脂糖凝胶电泳评估混合gRNA文库的扩增和克隆是否成功。gRNA文库的PCR扩增产生清晰的条带，表明来自混合寡核苷酸芯片阵列的均一扩增（图2A）。对pXPR502 PPH-Cre和pLKO Cre载体骨架进行限制性酶切，可实现线性化骨架与填充片段的明显分离（图2B、C）。高效的酶切及骨架的纯净回收对于在克隆过程中最大限度减少背景连接并获得高文库复杂性至关重要。
使用CRISPR-KOALA.......
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讨论
混合池构建中的一个关键考虑因素 体内 CRISPR筛选的关键在于实现足够的文库覆盖，同时保持稀疏的单细胞转导，以维持克隆分辨率2在小鼠乳腺中，上皮区室保守地包含约 3.5 × 105 每腺体细胞数36在平均慢病毒转导率为15%的条件下（该转导率可最大限度降低单个细胞多重感染的频率），导管内递送可实现约5 × 104 每腺体转导的上皮细胞36,55因此，同时对第三胸段和第四腹段乳腺进行双侧注射，可获得约 2 × 105 每只小鼠转导的上皮细胞36,55根据这些参数，包含 4,000 个 gRNA 的文库（相当于 CRISPR-KO 筛选约 1,000 个基因或 CRISPR-A 筛选约 500 个基因）需要约 4 × 10
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披露
D.S. 是 ViVerita Therapeutics 的顾问及创始人，其实验室与 ViVerita Therapeutics 拥有赞助研究协议和服务协议。
致谢
我们感谢实验室所有成员对本工作相关问题提出的宝贵意见和讨论。我们还要感谢并致谢加拿大安大略省多伦多市伦德尔-塔嫩鲍姆研究所（LTRI）表型基因组中心在小鼠实验方面提供的全部帮助与专业支持。本研究获得了加拿大卫生研究院项目资助（PJT462506）、特里·福克斯研究研究所项目资助（TFRI 项目 #1107）以及尼科尔家族基金会对 D.S. 的资助。E.R.L. 获得了加拿大癌症协会研究培训奖和弗兰克·弗莱彻纪念基金的支持。 K.N.A. 获得了 H.L. 霍姆斯博士后奖以及加拿大癌症研究协会资助（编号 1318698 和 26089）的支持。J.N. 获得了加拿大卫生研究院加拿大研究生奖学金—硕士阶段以及加拿大卫生研究院博士研究奖（#193389）的支持。Y.L. 获得了加拿大卫生研究院研究卓越、多样性与独立性博士后奖学金（#ED6-190718）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 微米滤膜 | Sigma | S2HVU02RE | |
| 12k 或 92k 寡核苷酸芯片 | Customarray Inc. (Genscript) | ||
| 15 cm 细胞培养板 | Corning | CLS353004 | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | |
| 293NT | Systems Biosciences | LV900A-1 | |
| 碱性磷酸酶 | NEB | M0290L | |
| 氨苄青霉素 | Fisher Scientific | BP1760-25 | |
| ATP | NEB | 9804S | |
| ATP | NEB | P0756S | |
| Cutsmart 缓冲液 | NEB | B6004S | |
| 深度测序（Next-Seq 或 Hi-Seq） | Illumina | ||
| DNAesy 血液与组织 DNA 提取试剂盒 | Qiagen | 69506 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基 | Wisent | 319-015-CL | |
| Endura 电转感受态细胞 | Lucigen | 60242-1 | |
| EpiCult-B 小鼠培养基试剂盒 | Stemcell Technologies | 05610 | |
| Esp3I | NEB | R0734L | |
| 胎牛血清 | Wisent | 090-150 | |
| 凝胶 DNA 纯化试剂盒 | Zymo Research | D4008 | |
| Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔比色皿 | BioRad | 1652089 | |
| 温和型胶原酶/透明质酸酶 | Stemcell Technologies | 7919 | |
| H11-Cas9 | Jackson Labratories | JAX#028239 | |
| 高速离心机 | Beckman Coulter | MLS-50 | |
| Kim-wipe 擦拭纸 | Kimberly-Clark | 34155 | |
| LB 琼脂 | Wisent Technologies | 800-011-LG | |
| 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument | P97 | |
| 质粒小提试剂盒 | Frogga Bio | PDH300 | |
| NEBuffer 3.1（BsmBI 缓冲液） | NEB | R0580L | |
| 寡核苷酸纯化与浓缩试剂盒 | Zymo Research | D4061 | |
| 寡核苷酸纯化试剂盒 | Zymo research | D4060 | |
| PAGE 纯化的 Illumina 测序引物 | IDT DNA | ||
| PCR 微量移液器 | Drummond | 5-000-1001-X10 | |
| PEI（聚乙烯亚胺） | Sigma | 408727-100ML | |
| 青霉素和链霉素 | Wisent | 450-201-EL | |
| pLKO-Cre | Addgene | 158032 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P2636-100MG | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pXPR502-PPH-Cre | Addgene | 256776 | |
| Q5 聚合酶 2x 预混液 | NEB | M0494L | |
| Qubit 荧光定量系统 | Invitrogen | Q33327 | |
| R26-LSL-Cas9-EGFP | Jackson Labratories | JAX#024857 | |
| R26-LSL-TdTomato 小鼠 | Jackson Labratories | JAX#007909 | |
| SapI | NEB | R0569L | |
| T4 DNA 连接酶 | NEB | M0202L | |
| 超速离心管 | Beckman Coulter | 344058 | |
| 真空过滤装置 | Fisher Scientific | SCHVU02RE |
参考文献
- Moresco, E. M. Y., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics. Am J Pathol. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- Santinha, A. J., Strano, A., Platt, R. J. Methods and applications of in vivo CRISPR screening. Nat Rev Genet. 26 (10), 702-718 (2025).
- Evers, B., et al.
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