方法文章

一种用于人和啮齿类动物分离胰岛自动化图像定量分析的网络平台

155 次观看

⸱

DOI：

10.3791/71124

⸱

2026年7月28日

 ,  ,  , 
1Laboratory for Pancreatic Islets, Experimental Medicine Center, Institute for Clinical and Experimental Medicine, 2Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University

本文内容

摘要

本方案描述了利用深度学习辅助的图像分析和可视化质量控制，对分离的人和啮齿类动物胰岛进行标准化取样、染色、图像采集以及基于网络的自动化定量分析。

摘要

本出版物旨在提供一份书面并配有实操视频的分步操作规程，用于标准化使用IsletNet——一个基于网络的自动化平台，可对分离的胰岛图像进行定量分析，流程涵盖从样本采集、图像获取，到图像上传、视觉验证以及自动生成报告的全过程。该平台专为标准化、自动化评估分离胰岛的二维显微图像而开发，以支持临床和实验性胰岛分离工作流程。平台采用基于深度学习的图像分割技术，识别胰岛与外分泌组织，并从中提取轮廓用于图像分析。随后通过计算算法对胰岛数量、体积和纯度进行定量。视觉质量控制工具支持专家对自动图像分析结果进行验证，允许用户接受、手动修正或排除无效图像。临床胰岛分离模块支持纯度分数批次分析，并生成自动化的PDF报告，同时提供可下载的图像和表格数据文件，用于记录保存和 分析。简单比较模块可将自动化分析结果与随样本图像提交的本地参考结果进行比对 ，以评估本地标准化图像是否适用于自动化分析 。本操作规程还概述了在必要时使用本地生成的标准化图像进行重新训练的建议。来自啮齿类动物和人类胰岛分离的代表性数据（包括具有挑战性的案例） 表明，在适当训练后，自动化分析性能得到显著提升。

引言

将分离的胰岛移植到糖尿病受体体内，可减少或消除对外源性胰岛素注射的依赖1。从尸体或活体供体中分离胰岛的过程存在生物学和操作上的异质性，表现为产量和质量的差异。总胰岛体积是确定移植剂量和临床决策（如是否适合移植）的主要依据2。胰岛大小分布直方图和胰岛指数用于反映不同大小胰岛在功能效率上的差异3。因此，除了总胰岛体积（目前作为β细胞含量的替代指标）外，还需关注单个胰岛的特征。分离的人类胰岛密度低于啮齿类动物胰岛，且常与外分泌组织分离不充分，因此在未染色的情况下较难分辨。为此，已采用一种快速简便的锌离子染色法，利用双硫腙（dithizone）使富含锌的胰岛素颗粒呈现强烈的红色反光4。由于组织不透明，仅能收集来自表面的反射光，因此可使用配备光源和相机的普通体视显微镜或倒置显微镜进行观察。

尽管已有多项尝试通过采用数字图像分析工具来减少实验室间的差异5,6,7,8,9,10,11,12，但这些方法仍存在若干局限性。在这些方法中，胰岛与外分泌组织的分割要么依赖于手动设定阈值，容易引入主观误差5,6,7,8,9,10，要么采用完全自动化的分割方法11,12。此外，通常需要在本地安装软件5,6,7,8,9,10,11，且可能受限于特定硬件10,11，从而限制了其通用可及性与标准化应用。

本出版物的总体目标是提供一种标准化的工作流程，通过基于网络的深度学习平台并在人类专家监督下，实现对图像中分离的胰岛进行自动化定量分析。IsletNet 解决了胰岛图像分析在可用性和可靠性方面的局限性。本文提出了胰岛移植物取样、生成合适的显微图像以及正确使用 IsletNet 工具的推荐指南。该方案引入了由人工对自动生成结果进行监督的概念，并为潜在用户和已有用户提供了相应的工作流程（图1）。简单比较工具允许潜在用户将 IsletNet 的分析结果与本地获得的参考方法直接进行比较（图1A）。由于不同中心本地生成的标准图像可能存在显著差异，IsletNet 在实现可靠分析前可能需要重新训练（图1B）。为促进这一过程，本文提供了关于标准化染色和图像采集的建议。对于已有用户，临床胰岛分离工具旨在支持人胰岛分离的工作流程（图1C）。表1 描述了由 IsletNet 生成的可下载报告以及附加表格和可视化结果，而关键的计算参数则在 表2 中进行了总结。

临床胰岛分离与数据训练验证的 IsletNet 模块流程图，流程示意图。
图 1：平台面向潜在用户与现有用户的使用工作流程。（A）使用“简单比较”模块的本地验证工作流程。（B）重新训练需要一组代表本地标准化图像的数据。（C）使用“临床胰岛分离”模块的常规使用工作流程。关键工作流程步骤包括图像上传、分析、视觉质量控制（vQC）和报告生成。比例尺不适用。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：平台生成的可下载结果文件。 由临床胰岛分离工具和简易比较工具生成的可下载输出文件列表，按文件格式和输出类别分组。该表格包括报告文件、分割图像输出、可视化文件，以及胰岛计数、体积、纯度和直方图分析的电子表格导出文件。请点击此处下载此表格。

表2：可下载报告和电子表格输出中包含的关键参数。 临床胰岛分离工具和简单比较工具生成的可下载XLSX和CSV文件中所含的元数据、用户自定义设置以及定量分析参数的详细列表。参数包括会话元数据、图像采集设置，以及针对图像和单个胰岛的胰岛定量指标。 请点击此处下载此表格。

方案

动物实验程序已获得捷克共和国卫生部批准（批准号：49/2023），符合欧洲共同体理事会指令86/609/EEC的规定。人胰岛分离与使用程序已获得国家药品控制研究所批准（批准号：sukls111286/2023）。采用标准化显微图像分析大鼠和人胰岛制备物，使用“简单比较”和“临床胰岛分离”工具比较自动分析与人工计数的结果。人工和自动胰岛当量计算均采用标准（短）换算表13。

1. 人类监督

  1. 初步观察主要结果 (图2)
    1. 等待胰岛数量、体积和纯度的自动生成结果，以及相应的自动标注（如轮廓或分割）的图形化显示，出现在批量结果窗口中。
    2. 在左侧信息面板中查看当前样本图像的汇总结果图2A).
    3. 查看重复值（图2B）和批次平均值（图 2C右侧表格中的）
    4. 浏览图像预览图 2D，E）使用链接（图 2F）。如有需要，可右键单击图像预览，然后按照弹出菜单下载单张图像。
    5. 使用导航箭头浏览示例图像（图 2G）或直接从表格中选择。
    6. 通过点击当前图像预览区域内任意位置，打开检查窗口图2D）以评估自动生成轮廓的质量并验证结果。
  2. 视觉质量控制
    1. 移动图像并缩放图3A) 放大或缩小以检查轮廓是否存在潜在错误。
    2. 在轮廓图（仅被计数的胰岛具有轮廓）、原始图像和其他可视化视图之间切换。
      注意：可用的视图列在窗口右侧图例中（图3B）并可通过键盘快捷键或顶部导航栏中的链接进行访问（图 3C; 表3).
    3. 如果轮廓可接受，则按向下箭头键进入下一张图像表3).
    4. 在可能的情况下手动修正轮廓错误。若存在未被检测到、部分检测到或虚假的胰岛且无法修正，应将该图像分类为无效，并从分析中排除。
      注意：被排除的图像将在批量结果窗口中标记图 2J）以及所有下载的文件中。
  3. 可纠正的错误：未分离的相邻胰岛
    1. 必要时手动分离相邻的胰岛。
    2. 左键单击胰岛外部以启动分割线（图3D).
    3. 通过中间点击鼠标左键，引导相邻胰岛之间的分离线图3E).
    4. 右键点击胰岛外部以完成分离线图3F).
    5. 提交 结果更新的分界线图 3G).
      注意：可根据需要打开或关闭添加的分隔线的可视化显示（图3H).
  4. 可纠正的错误：伪胰岛
    1. 使用分离工具将伪胰岛分割为多个小于胰岛尺寸阈值的独立对象。
    2. 通过设定预定义的最小胰岛尺寸阈值（通常）来避免计数微小的胰岛碎片 50 µm根据当地实验室操作规范，必要时调整阈值。
    3. 右键单击线条上的任意一点，然后从弹出菜单中选择相应选项，以删除一个或全部手动添加的分隔线图 3I).
  5. 无法纠正的错误：缺失、部分分割或虚假的胰岛
    1. 切换至分割视图，以确认胰岛是否已被检测到。
    2. 在批量平均值计算中，排除任何包含未检测到、部分检测到或多个虚假胰岛的无效图像图3J).
  6. 无法纠正的错误：误分类对象
    1. 如果外分泌组织、背景伪影或气泡被错误地分类为胰岛，则应将该图像排除在评估之外。图3J).

胰岛纯化分析；显微镜数据，使用CKX41；批次汇总；中等纯度评估。
图 2．批次结果窗口。（A）当前样本结果汇总。（B）重复样本图像的结果。（C）仅来自已接受图像的批次平均值。（D、E、F）带链接的图形化结果预览。（G）样本导航箭头。（H、I、J）已修改、已接受和被排除的图像。（K）IsletNet 顶部导航栏。（L、M）批次结果窗口的页眉和页脚。请点击此处查看此图的放大版本。

用于细胞分割的显微镜图像分析轮廓界面，突出显示胰岛。
图3．vQC检查窗口及手动轮廓校正。 （A）图像缩放显示。（B）图例与导航提示。（C）检查窗口的顶部导航栏。（D–G）构建并提交相邻胰岛的手动分割线。（H）切换显示或隐藏手动分割线。（I）删除手动分割线。（J）切换将图像从统计中排除。此界面视图中未显示比例尺。请点击此处查看此图的放大版本。

表3：检测窗口中可用的视图模式、键盘快捷键和导航控制。 该表总结了在检测窗口中进行虚拟质量控制（vQC）和手动审查分割结果时可用的图像可视化模式、键盘快捷键以及导航功能。内容包括轮廓叠加、分割结果显示、直方图可视化以及在临床胰岛分离和简单比较工具中使用的图像导航控制。请点击此处下载该表格。

2. 平台导航

  1. 查看版本和技术信息
    1. 在顶部导航栏中查看当前软件版本和最新培训日期（图2K）。
    2. 打开“主页”部分以访问技术说明及相关参考信息。
  2. 本地图像的初步评估
    1. 根据步骤1.2.4和1.5.2中描述的误差标准，判断本地生成的标准图像是否已可被平台正确分析，或是否需要对本地标准图像进行重新训练（图1A 和 图1B）。

3. 使用本地图像进行简单比较与外部训练

  1. 简单比较
    注意：使用“简单比较”工具将自动化分析结果与本地建立的参考方法进行比较，通常为标准手动计数13、替代换算表7,11,18 或模型5,6。上传本地生成的标准图像以及相应的参考值和参考方法类型。输出结果包括可下载的表格、图像和PDF报告（表1）。
    1. 从顶部导航栏打开简单比较仪表板（图4A和4B）。
    2. 查看提示部分中对图像属性的要求（图4C）。
    3. 下载form.xlsx模板文件（图4D）。
    4. 使用本地建立的参考方法对多个样本中的胰岛进行计数。
    5. 获取与已计数样本相对应的标准显微图像。
    6. 确保所有已计数的胰岛完全包含在图像帧内。
    7. 使用英文句点作为小数点，将确切的图像文件名及对应的参数值填入form.xlsx模板中（图4E）。
    8. 通过拖放操作或使用上传按钮，上传完成的电子表格及相应的图像文件（图4F）。
    9. 选择用于胰岛体积估算的换算表或模型（图4G）。
    10. 点击提交批次以生成并列比较结果。
    11. 等待分析结果出现。
    12. 打开检查窗口，对轮廓进行视觉验证。
    13. 如果轮廓不正确，则将图像从分析中排除（图3J）。
      注意：简单比较工具中不提供手动轮廓编辑功能。
    14. 将结果下载为表格、图像和PDF报告（表1）。
  2. IsletNet 针对本地标准化图像的训练
    1. 联系实验医学研究所（IKEM）的开发团队，邮箱为info@isletnet.com。
    2. 提供能够覆盖本地当前图像质量范围的代表性图像。
    3. 与开发团队讨论图像质量要求。
      注意：关键的图像质量参数包括足够的对比度、胰岛完全包含在图像帧内，以及相邻胰岛之间的重叠尽可能少。只要胰岛与外分泌组织之间的区分清晰，其着色可从红色到粉红色或紫色不等。
    4. 创建一个训练图像集，涵盖预期范围内的胰岛纯度、放大倍数和颜色变化。

胰岛体积计算界面、上传与参数输入、数据表及转换方法。
图4。简易比较工具、仪表板与工作流程。（A）顶部导航栏。（B）简易比较仪表板。（C）上传提示与操作说明。（D, E）form.xlsx 模板下载及已上传参数的可视化展示。（F）用于图像和电子表格的拖放上传区域。（G）选择胰岛尺寸到体积的转换方式。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 取样

注意：胰岛会根据大小和形状快速且差异性地沉降，这可能导致取样结果出现偏差。

注意：所有胰岛操作步骤均须在层流罩内进行，并佩戴适当个人防护装备。

  1. 使用 50 mL 或 250 mL 离心管盛装胰岛悬液。
  2. 根据观察到的沉淀体积和纯度，按照本地标准操作程序确定所需的取样比例。
  3. 在取样前，立即轻轻倒置试管五次，充分混匀胰岛悬液。
  4. 使用大孔径移液器吸头立即吸取样品，以防止外分泌组织堵塞并尽量减少胰岛损伤。

5. 优化胰岛图像采集

  1. 二苯硫腙（Dithizone）的配制
    注意：必须确保二苯硫腙染色的一致性，以充分区分胰岛与外分泌组织。以下介绍两种常用的配制方法。
    警告：二苯硫腙可能具有生殖毒性。二甲基亚砜（DMSO）具有毒性且可经皮肤吸收。氢氧化钠具有强腐蚀性，可能导致严重的化学灼伤。操作所有化学品时应穿戴适当的个人防护装备，避免皮肤接触，并按照机构的危险废物处理程序处置废弃物。
    1. DMSO 溶解法13
      1. 称取 50 mg 二苯硫腙粉末。
      2. 将二苯硫腙溶解于 5 mL DMSO 中。
      3. 将溶液在 37°C 下孵育，每 5 分钟剧烈涡旋 1 分钟，直至完全溶解。
      4. 取 1 mL 原液，加入含 2% 胎牛血清的 Hank’s 平衡盐溶液 20 mL，配制成工作液。
      5. 用 0.22 µm 注射器滤器过滤溶液。
      6. 用铝箔包裹试管，避光保存。
        ​注意：工作液应在约 12 小时内使用完毕。
    2. 碱性醇溶液重悬法（替代参考文献 8 的方法）
      1. 称取 50 mg 二苯硫腙粉末。
        注意：如需要，可预先分装成小份。
      2. 向二苯硫腙中加入 800 µL 70% 乙醇。
      3. 加入 400 µL 1 M 氢氧化钠溶液，充分涡旋至完全溶解。
      4. 用含 0.2 mg/mL 人血清白蛋白的磷酸盐缓冲液稀释至终体积 20 mL。
      5. 用 0.22 µm 注射器滤器过滤溶液。
      6. 用铝箔包裹试管，避光保存。
        注意：工作液应在约 12 小时内使用完毕。
  2. 胰岛染色
    1. 将 25 µL 二苯硫腙工作液加至 35 mm 培养皿中央。
    2. 加入 50 µL 悬浮于含白蛋白的 Hank’s 平衡盐溶液、完全培养基或移植培养基中的胰岛。
      注意：实际样品体积根据纯度分级沉淀物的不同在 20–50 µL 范围内变化，最终二苯硫腙浓度为 0.85 mg/mL 至 1.37 mg/mL。
    3. 使用移液器缓慢吸取并吹打悬液三次（使用第一停点），轻柔混匀溶液，避免产生气泡。
    4. 将样品在 20°C–25°C 下孵育 1–2 分钟，同时在显微镜下观察染色情况，直至胰岛呈现亮红色。某些制备样品中可能存在染色不佳的胰岛，IsletNet 也针对此类情况进行了训练。
    5. 使用 10 mL 注射器迅速将 4 mL 含 0.2 mg/mL 白蛋白的磷酸盐缓冲液直接注入染色样品中，避免产生气泡和飞溅。
    6. 立即快速地以环形方式剧烈摇动培养皿，使溶液混合，并使胰岛向中心聚集后沉降。
      选项 1：小心地在周围加入 4 mL PBS/白蛋白，保持含二苯硫腙的胰岛区域不受扰动。然后轻柔地以环形方式摇动培养皿，使溶液混合，同时保持胰岛位于中央。等待二苯硫腙在培养皿中充分扩散。
      选项 2（适用于体视显微镜）：不进行稀释，而是使用移液器吸头或针头将二苯硫腙-胰岛液滴铺展成薄层，以减少反光。
    7. 在显微镜下检查样品，若发现胰岛移位，立即用移液器吸头轻轻搅动周围液体，将胰岛轻柔地回移至摄像视野中。
    8. 立即开始图像采集，以尽量减少细胞毒性及胰岛体积变化。
  3. 图像采集
    注意：使用配备低倍物镜和稳定光源的体视或倒置显微镜。屏蔽培养皿免受额外光源（如室内照明）的影响。
    1. 打开光源，让卤素灯预热 5 分钟。
    2. 设定标准化的光照强度，避免眩光和曝光不足。具体范围取决于所使用的成像硬件。
      注意：最佳光照强度可能因放大倍数和样品纯度而异。
    3. 选择合适的物镜和变焦设置，确保所有胰岛均位于相机视野范围内。
    4. 同一批次内所有样品应保持相同的放大倍数，最好在所有纯度批次间也保持一致。
    5. 如有必要，使用标准白色校准片校正白平衡。若因胰岛制备的特殊性导致图像质量仍不理想，可调整 RGB 值和/或伽马设置。
    6. 调整曝光时间，必要时通过彩色直方图调节光照强度或增益，避免过曝。
      注意：含有大量外分泌组织的样品可能因非胰岛组织的反光而需要不同的相机或照明设置。为确保可重复性，应将这些参数保存为独立的配置文件以供后续参考。
    7. 采集图像，并以支持的格式保存文件，包括 JPG、PNG、TIFF 或 BMP。
      注意：在文件名中包含日期、纯度分级、放大倍数或像素尺寸以及稀释信息，以便后续重新分析（例如：iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg）。
    8. 使用与样品成像相同的放大倍数和变焦设置，采集载物台微尺的图像。

6. 临床胰岛分离工具

注意：关键工作流程步骤总结于图1C。随着样品的获取，按纯度组分批次对图像进行分析。

  1. 设置像素大小
    注意：仅当使用与分析样本相同的放大倍数和缩放设置获取载物台测微尺图像时，计算出的像素大小才有效。
    1. 打开 临床胰岛分离 仪表板。
    2. 点击 上传载物台测微尺，并选择载物台测微尺图像。
    3. 在数字标尺上已知距离处绘制红色测量线的两个端点。
      注意：尽可能使用较长的校准距离，以提高测量准确性。
    4. 输入已知距离（单位为微米，µm）。
    5. 提交计算出的像素大小。
      注意：平台将保留计算出的像素大小，直至手动修改。
  2. 纯度组分图像的批量上传
    注意：使用 3–4 个重复样本来确保批量均值和标准差值的可靠计算。同一批次内的所有样本应使用相同的稀释倍数。
    1. 将代表同一纯度组分重复样本的图像拖放到上传区域。
      注意：平台会根据文件名识别防止同一图像被重复使用。
    2. 如有必要，修改像素大小。
    3. 输入最小胰岛尺寸阈值。
    4. 输入样本稀释值（例如，1000）。
    5. 输入从原始烧瓶中记录的沉淀体积（单位为毫升）。
    6. 输入操作员姓名缩写。
      注意：操作员姓名缩写将显示在生成的报告中。
    7. 输入代表当前分离操作的会话编号（Session ID）。
    8. 输入批次编号（Batch ID）（例如，1 高纯度）。
      注意：平台将根据批次编号按字母数字顺序对组分进行排序。
    9. 点击 提交批次 以开始分析。
  3. 查看并确认批次结果
    注意：如有必要，点击标题关闭之前的“批次结果”窗口（图 2L）。
    1. 等待数值和图形结果出现在“批次结果” 窗口中。
    2. 在“批次结果”窗口中双击图像预览以打开检查窗口。
    3. 查看并根据第 1 步所述方法必要时修正轮廓。
    4. 若轮廓可接受，使用向下箭头键进入下一张图像。
    5. 使用窗口底部的按钮添加另一个批次，或进入会话汇总（图 2M）。
  4. 批次编辑
    注意：平台在整个会话期间会存储图像文件名，以防止无意中重复使用同一图像，包括已被移除的图像。如有需要，请在重复使用前重命名图像。
    1. 点击 编辑批次 以添加或删除图像、更正样本参数或重命名批次（图 2L）。
      注意：如果预计会重复使用图像，请在修改批次前记录图像文件名。
    2. 点击 删除批次 以完全移除该批次（图 2L）。
  5. 查看汇总信息并生成报告
    1. 点击 显示汇总 以显示会话概览（图 2M）。
      注意：如有必要，可返回之前的批次并进行编辑。
    2. 查看本次会话的总胰岛数量、体积和沉淀体积值，以及相应的批次平均值。
  6. 下载报告。
    注意：简要报告包含总胰岛数量、体积、纯度、沉淀值、直方图及纯度组分汇总信息。完整报告额外包含每张样本图像的图形信息，其中被接受的值以红色显示，被排除的值以黑色显示。

结果

纯化的大鼠胰岛

在第一次实验中，共进行了四次独立的成像实验，获取了代表12个样本的36张图像，这些样本总共包含249个纯化的鼠胰岛。图像使用体视显微镜在三种标准化但不同的照明条件下生成，照明光源包括卤素灯和发光二极管（LED），并结合了不同的相机设置。IsletNet训练专家对三张代表性图像进行了手动标注，生成了真实值（GT）分割结果。

当使用 Simple Comparison 工具的公开版本分析图像时，所有自动生成的轮廓均未通过视觉质量控制（vQC，图5F）。随后，该平台使用具有代表性的本地图像重新训练，由重新训练后的实验版本生成的所有轮廓均通过了vQC（图5C）。

重新训练后，在三种成像条件下，自动与手动胰岛体积估计值的比值表现出一致的性能，照明条件A、B和C的中位数分别为1.03、0.98和0.94（图5A）。与原始训练模型相比，这些结果代表了显著的改进（图5B）。

与真实分割结果进行逐像素比较表明，重新训练后，自动分割与手动生成的轮廓具有高度一致性（图5D），在代表性图像中表现为轮廓定位准确（图5C）。相比之下，原始训练模型显示出更高比例的假阴性像素（图5G）以及轮廓定位错误（图5F），导致相应的胰岛大小直方图向较小的胰岛类别偏移（图5E 与5H对比）。

IsletNet 比较、箱形图和图像分析；显示胰岛分割准确性和数据的示意图。
图 5。使用三种成像设置和大鼠胰岛样本对平台重新训练的评估。 （A）使用三种成像设置重新训练后，IsletNet 与人工胰岛当量（IEQ）估算值的比较。（B）使用原始公开训练模型时，IsletNet 与人工 IEQ 估算值的比较。（C, F）分别在模型重新训练后和重新训练前，使用 vQC 工具进行的代表性轮廓标注。白色箭头指示正确的轮廓标注，品红色箭头指示错误的轮廓标注。（D, G）分别在重新训练后和使用原始训练模型时，与真实情况的逐像素比较。真阳性、假阳性、假阴性和真阴性区域在图例中注明。（E, H）分别在重新训练后和使用原始训练模型时，代表性胰岛大小直方图，并与人工计数结果进行比较。成像设置 1 = LED 照明；成像设置 2 = 卤素照明；成像设置 3 = LED 暗场照明。比例尺 = 100 µm。箱形图按 Tukey 方法绘制；须线延伸至距第一和第三四分位数 1.5 × 四分位距范围内的数据点。请点击此处查看该图的放大版本。

临床人胰岛制备

在第二次实验中，使用该平台的公开版本分析了代表一次人胰岛分离过程的17张图像，这些图像包含三组纯度分级样本。其中一份样本丢失。经过视觉质量控制（vQC）后，由于出现伪胰岛检测，所有代表中等和低纯度组分的图像均被排除（数据未显示）。随后，该平台使用具有代表性的本地图像进行了重新训练。

重新训练后，所有图像在添加三条手动分割线后均通过了vQC。与手动计数的批次比较显示，总胰岛数量和体积估计值的整体低估不超过5%。稀释2,000至4,000倍的样品中，胰岛数量根据纯度组分的不同介于80至4个之间。各纯度组分对最终制备样品的相对贡献如图6A所示。与中等纯度组分2SC1相比，高纯度组分1VC2主要含有较小的胰岛。该平台自动生成的整体胰岛大小直方图如图6B所示。

胰岛分割分析；使用 IsletNet 和手动方法进行的柱状图、散点图及显微镜图像比较。
图 6．人胰岛分离样本的定量与分析。 （A）使用 IsletNet 和手动计数方法对完整移植物各纯度组分中的胰岛数量及胰岛当量体积进行估计。（B）由 IsletNet 基于批次平均值生成的最终胰岛尺寸直方图。（C）在17张独立图像上，IsletNet 与手动方法在计数和体积估计上的比较。（D）来自样本3NC1的代表性图像细节，显示原始图像及经重新训练的 IsletNet 生成的轮廓定位。（E）IsletNet 分割结果与人工计数专家（GT1）和 IsletNet 训练专家（GT2）生成的真值之间的像素级比较（GT1 vs. GT2）。图例中标明了真阳性、假阳性、假阴性和真阴性区域。（F）同一图像中 IsletNet 与手动方法结果的代表性胰岛尺寸直方图。品红色箭头指示轮廓及胰岛尺寸类别的偏移。比例尺 = 100 µm。箱形图按Tukey惯例绘制；须线延伸至距第一和第三四分位数1.5 × 四分位距范围内的数据点。请点击此处查看该图的放大版本。

随后对所有单个图像的自动与手动估算结果进行了比较（图6C）。自动与手动估算的中位数比值在胰岛数量上为1.00，在胰岛体积上为0.93，并观察到若干离群值。在一个代表性低纯度样本（3NC1）中，该平台识别出的胰岛数量与手动计数相同（5个胰岛），但估算的胰岛体积低29%。这些数据点在图6C中以箭头标示。

在此代表性图像中，最大的胰岛部分被困在外分泌组织中，如图6D所示，包括原始图像和自动生成的轮廓叠加。与两位专家独立生成的金标准分割结果进行逐像素比较的结果如图6E所示。相应的胰岛大小直方图显示了手动分割与自动分割之间在大小分布上的偏移（图6F）。

自动分析的操作性能

在标准网络条件下，以平均50 Mbps的下载速度和30 Mbps的上传速度，对简单比较工具和临床胰岛分离工具的操作性能进行了评估。使用图像大小范围从0.5 MB的JPEG文件到20 MB的TIFF文件，对五批图像（每批包含12张图像）进行了分析。测量了完整ZIP结果包的下载耗时。

两种工具的分析可视化时间和下载持续时间均随着图像尺寸的增加而逐步延长（表4）。对于相同的图像数据集，临床胰岛分离工具所需的处理时间长于简易比较工具。这些结果表明，在常规操作过程中，图像分辨率、文件格式与分析通量之间存在实际关联。

表4：临床胰岛分离工具和简单比较工具的分析可视化时间及下载持续时间。 使用不同文件大小和格式的图像批次，对结果可视化和文件下载所需的处理时间进行比较。测量数据采用包含12张图像的批次获得，报告的时间为从提交批次到结果可视化或下载完成之间的实际耗时。请点击此处下载该表格。

讨论

本文所述方案为 IsletNet 平台的新用户和现有用户提供了一个实用的操作流程，重点介绍该平台的两个关键功能：专家视觉质量控制（vQC）和神经网络重新训练。代表性结果表明，准确的自动化定量不仅依赖于图像分割的性能，还取决于用户在接受结果前对轮廓位置和图像适用性进行批判性评估的能力。另外两个高级工具——像素对像素比较（Pixel-to-Pixel Comparison）和我的分割（My Segmentations）——被用于生成部分验证结果；然而，这些工具主要用于支持神经网络训练，因此未包含在本方案的操作流程中。

IsletNet 是作为一个协作性且广泛可访问的参考工具而开发的，旨在实现不同实验室之间标准化的胰岛图像分析。该神经网络使用人工标注的原始二维显微图像中分离的人和大鼠胰岛的金标准（GT）分割数据进行训练和验证14,15,16。已分别建立了针对二苯硫腙（dithizone）染色样本的两个独立模型，以及一个用于未染色大鼠胰岛的研究模型，后者可根据请求获取使用权限。 平台版本号和训练日期将在用户界面中显示。 IsletNet 可自动分割胰岛和外分泌组织，并基于用户定义的像素尺寸和最小胰岛尺寸阈值，计算胰岛数量、体积和纯度。胰岛尺寸阈值的选择应依据图像质量及分析目的（例如与手动计数进行并行比较，或针对小胰岛的研究），而非物种差异。鉴于常规显微镜的分辨率，有意义的最小胰岛尺寸为 50 µm7,8,9,12，但对于使用适当仪器获得的图像，该阈值可降低至 10 µm10。胰岛体积估算采用标准的基于球体的换算表13，同时也支持其他替代性换算方法7,18,19，包括拟合椭圆近似法5,6，以及基于轮廓的 Spinacle 和 Sphiracle 模型17。结果以胰岛当量（islet equivalents）和纳升（nanoliters）表示，而纯度则可通过组织面积或估算的组织体积进行计算。本方案中的关键步骤是获取适用于自动分割的标准化显微图像。IsletNet 的训练所使用的图像是通过配备多种互补金属氧化物半导体（CMOS）相机和照明系统的体视显微镜和倒置显微镜采集的。低倍物镜（1–2×）具有优势，因其可在保持像素尺寸适合可靠检测小胰岛的同时，使整个样本保留在视野范围内。一致的照明、稳定的白平衡以及避免图像过曝，对于生成可靠的轮廓至关重要。代表性结果表明，在异质成像条件下，利用具有代表性的本地图像进行再训练，可显著提升分割性能。作为实用指导原则，当经验丰富的观察者能够清晰区分胰岛与外分泌组织边界时，此类图像通常适用于 IsletNet 的训练 。应尽可能避免使用包含成簇或严重重叠胰岛的图像。

该方案还强调了与自动图像分析相关的若干局限性和故障排除注意事项。尽管与完全手动计数相比，IsletNet 显著提高了通量、客观性和可重复性，但该方法仍对图像质量敏感。偶尔可能出现轮廓定位错误（虚假胰岛检测，或未能分离相邻胰岛），从而影响后续的定量分析。在接受自动分析结果之前，常规的视觉质量控制（vQC）仍然至关重要。在现场立即应用 IsletNet 具有优势，因为图像质量不理想时可调整成像参数后重新采集。在检查窗口中，除遗漏胰岛或多个虚假胰岛的情况外，自动轮廓的手动校正操作是可行的。此外，自动分离算法基于轮廓几何特征和胰岛大小分布的统计信息，因此其结果可能与个别专家的初步判断存在差异，但仍处于可接受的分析范围内。

IsletNet 的可靠性主要取决于局部图像质量与训练数据集之间的一致性，而非仅由物种决定。尽管当前的训练集包含不同纯度的人胰岛和高纯度的大鼠胰岛，但只要图像特征与训练数据保持一致，该平台便可扩展至其他物种。 例如，通过培养纯化的猪胰岛可能与训练数据集中所含的包埋人胰岛相似。相比之下，在训练过程中并未包含经长期培养且双硫腙染色较弱的胰岛，此类样本可能需要额外的训练。因此，简单比较工具为新用户或新的成像配置提供了一个重要的验证步骤。本文结果强调了专家对包埋胰岛的不同解读如何影响真实标签（GT）的生成及后续的体积估算。 为应对未来多中心研究中缺乏广泛专家共识的问题，已开发 IsletSwipe 应用程序20，以促进基于共识的图像标注。

与传统的显微镜下人工计数相比，IsletNet 提供了显著更高的通量、永久性的数字化记录以及标准化的定量输出，同时减少了操作者依赖的变异性。在边缘情况下的组织识别中，人工计数可能仍具有更高的可信度，但其受限于主观的尺寸估计、较低的可扩展性以及大量人员培训需求。IsletNet 作为一项基于网络的服务，通过集中化但匿名的分析方式，实现了实验室间的可比性。分析速度仍依赖于本地互联网带宽、图像文件大小和图像复杂度。较大的 TIFF 文件可能提高图像保真度，但与压缩的 JPEG 图像相比，需要更长的上传和下载时间。

总体而言，本文展示的结果表明，当局部图像采集保持可重复且与训练集一致时，可以实现可靠的自动化定量分析。建议用户在常规操作中引入vQC，并在局部成像条件发生显著变化时考虑重新训练模型。

披露

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

致谢

IsletNet 的公开版本由 Filip Matzner、Jan Belohlavek 和 Adam Blazek（Iterait a.s.，捷克共和国布拉格）开发并训练。实验版本由 Jakub Monhart、Petra Curdova 和 Jan Kubant（Mild Blue s.r.o.，捷克共和国布拉格）训练。

作者感谢以下个人和机构提供了用于IsletNet网络训练的显微图像：Andrew Friberg（瑞典乌普萨拉大学免疫学、遗传学与病理学系）；Hanne Scholz（挪威奥斯陆大学医院外科研究所）；Valéry Gmyr（法国里尔大学、法国国家健康与医学研究院糖尿病转化研究中心）；Josh Wilhelm（美国明尼苏达大学舒尔茨糖尿病研究所）；Domenico Bosco（瑞士日内瓦大学及日内瓦大学医院外科系）；Jason Doppenberg（荷兰莱顿大学医学中心内科学系）；Karolina Golab（美国芝加哥大学生物科学移植研究所）；Minna Honkanen-Scott（英国纽卡斯尔大学）；Hirotake Komatsu（美国希望之城）；Rebecca Spiers（英国牛津大学）；以及Zuzana Berkova、Jan Kriz和Peter Girman（捷克共和国布拉格临床与实验医学研究所[IKEM]）。

作者们还衷心感谢 Zuzana Berkova 和 Klara Zacharovová 在本研究中大鼠胰岛分离实验过程中提供的技术支持。

本工作由捷克共和国卫生部（资助编号 NU22-01-00141 / NW25-01-00221）、国家代谢与心血管疾病研究项目（EXCELES 计划，项目编号 LX22NPO5104，由欧盟——下一代欧盟资助）以及捷克共和国卫生部——研究机构概念性发展计划（"临床与实验医学研究所——IKEM，IN 00023001"）提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm 培养皿Sigma-AldrichP5481非无菌
200 µL 宽口移液器吸头Sigma-AldrichAXYT205WBCRS用于染色前胰岛悬浮液的分装
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD2650气相色谱级或细胞培养级
二苯硫腙（DTZ）Sigma-AldrichD5130粉末
乙醇，70%本地供应商N/A（v/v）溶于 H2O；用于 DTZ 配制
胎牛血清（FBS）Gibco10270106经热灭活，合格产品
Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）Sigma-AldrichH6648含或不含酚红（根据检测要求指定）
人血清白蛋白Grifols61953-0001-2高浓度溶液（200 g/L）
Infinity 1-3CLumenera3-1URCCMOS，300 万像素
Infinity CaptureLumeneraN/A标准图像采集软件
倒置显微镜 CKX41OlympusN/A1.25× 和 2× 物镜
LED 高功率光源（双臂）Photonics10068LED 光源；双可弯曲导管
光源 Highlight 2000Olympus5-HL2000卤素光源（14.5 V，90 W）；手动强度调节；双可弯曲导管
实验室基本用品多个供应商N/A移液器、离心管、针头、注射器、实验室计时器、标准个人防护装备
MicroCam 软件BresserN/A标准图像采集软件
MikroCam 3.0MBresser86000180CMOS，310 万像素相机
Millex-MP 滤器单元MilliporeSigmaSLMP025SS孔径 0.22 µm，PES 膜
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco10010023pH 7.4
Promicam Pro 3-5 CPPromicamE61MPR937CMOS，500 万像素，高动态范围相机
QuickPHOTOPromicraN/A标准图像采集软件
氢氧化钠（1 M NaOH）本地供应商N/A用于 DTZ 配制过程中的 pH 调节和溶解
显微镜测微尺ThorlabsR1L3S1P长度 10 mm；分度 50 µm，用于校准
体视显微镜 SZH10OlympusN/A1× 复消色差物镜

参考文献

  1. Shapiro AMJ, et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. N Engl J Med. 2006;355:1318-30.
  2. Hering BJ, et al. Single-donor, marginal-dose islet transplantation in patients with type 1 diabetes. JAMA. 2005;293:830-5.
  3. Lehmann R, et al. Superiority of small islets in human islet transplantation. Diabetes. 2007;56:594-603.
  4. Latif ZA et al. A simple method of staining fresh and cultured islets. Transplantation. 1988 Apr;45(4):827-30. PMID: 2451869.
  5. Girman P, et al. Digital imaging as a possible approach in evaluation of islet yield. Cell Transplant. 2003;12:129-33.
  6. Niclauss N, et al. Computer-assisted digital image analysis to quantify the mass and purity of isolated human islets before transplantation. Transplantation. 2008;86:1603-9.
  7. Kissler HJ, et al. Validation of methodologies for quantifying isolated human islets: an islet cell resources study. Clin Transplant. 2010;24:236-42.
  8. Friberg AS, et al. Quantification of the islet product: presentation of a standardized current good manufacturing practices compliant system with minimal variability. Transplantation. 2011;91:677-83.
  9. Wang LJ, et al. Application of digital image analysis to determine pancreatic islet mass and purity in clinical islet isolation and transplantation. Cell Transplant. 2015;24:1195-204.
  10. Gmyr V, et al. Automated digital image analysis of islet cell mass using Nikon’s inverted Eclipse Ti microscope and software to improve engraftment may help to advance the therapeutic efficacy and accessibility of islet transplantation across centers. Cell Transplant. 2015;24:1-9.
  11. Buchwald P, et al. Fully automated islet cell counter (ICC) for the assessment of islet mass, purity, and size distribution by digital image analysis. Cell Transplant. 2016;25:1747-61.
  12. Habart D, et al. Automated analysis of microscopic images of isolated pancreatic islets. Cell Transplant. 2016;25:2145-56.
  13. Ricordi C, et al. Islet isolation assessment in man and large animals. Acta Diabetol Lat. 1990;27:185-95.
  14. Ronneberger O, et al. U-Net: convolutional networks for biomedical image segmentation. In: Navab N, et al., editors. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention – MICCAI 2015. Cham: Springer International Publishing; 2015. p. 234-41.
  15. Sudre CH, et al. Generalised Dice overlap as a deep learning loss function for highly unbalanced segmentations. Lect Notes Comput Sci. 2017;10553:240-8.
  16. Kingma DP, Ba J. Adam: a method for stochastic optimization. arXiv [Preprint]. 2017. Available from: https://doi.org/10.48550/arXiv.1412.6980
  17. Habart D, et al. IsletNet supports accurate volume estimation of isolated pancreatic islets. In: 14th EPITA Symposium Abstract Book; 2025 Jan 26–28; Innsbruck-Igls, Austria. Abstract OP11.
  18. Ricordi C. Quantitative and qualitative standards for islet isolation assessment in humans and large mammals. Pancreas. 1991;6:242-4.
  19. Buchwald P, et al. Quantitative assessment of islet cell products: estimating the accuracy of the existing protocol and accounting for islet size distribution. Cell Transplant. 2009;18:1223-35.
  20. Habart D, et al. IsletSwipe, a mobile platform for expert opinion exchange on islet graft images. Islets. 2023;15:2189873.

重印与许可

标签

233 233 IsletNet
视频即将推出
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。