一个基于图像的自动定量人类和啮齿动物分离胰腺胰岛的网络平台

摘要

该方案描述了利用深度学习辅助图像分析和视觉质量控制，标准化采样、染色、图像采集及基于网络的自动定量，针对孤立的人类和啮齿动物胰腺胰岛进行测量。

摘要

本出版物旨在提供一个书面和实时视频的逐步协议，用于标准化使用 IsletNet。IsletNet是一个基于网络的平台，用于自动量化图像中孤立胰腺胰岛，从采样和图像采集到上传、视觉验证及自动报告生成。该平台旨在标准化、自动化评估分离胰腺胰岛的二维显微图像，以支持临床和实验胰岛分离工作流程。基于深度学习的图像分割用于识别岛屿和外分泌组织，从中提取轮廓以便图像分析。计算算法随后量化了岛屿数量、体积和纯度。视觉质量控制工具支持专家验证自动图像分析，允许用户接受、手动校正或排除无效图像。临床胰岛分离模块支持纯度分数批次分析，生成自动PDF报告及可下载的图像和表格数据文件，用于记录和分析。简单比较模块将自动估计与本地提交的参考结果及相应样本图像进行比较，以评估本地标准化图像在自动化分析中的适用性。协议还提出了必要时使用本地生成的标准化图像进行重新训练的建议。来自啮齿动物和人类胰岛分离的代表性数据，包括具有挑战性的案例，显示了经过适当训练后自动分析表现的提升。

引言

将胰岛分离移植到糖尿病患者中，可以减少或消除外部胰岛素给药的需求^。1.从尸体或活体供体分离岛屿的过程受生物和程序异质性影响，反映在产量和质量上。总胰岛体积是剂量决定和临床移植适宜性决策的主要输入².岛屿大小直方图和岛屿指数数解释了大小相关效果的差异³.因此，除了总体积外，还关注单个胰岛，总体积目前作为β细胞含量的替代标志。孤立的人类岛屿密度低于啮齿动物岛，且通常与外分泌组织分离不佳。因此，除非染色，否则很难区分。采用了使用二硫酮的快速且简单的锌染色方法，通过锌富集胰岛素颗粒反射强烈红光^4。鉴于组织的不透明度，仅收集从表面反射的光，便于使用配备光源和相机的简单立体或倒置显微镜仪器。

曾多次尝试通过使用数字图像^分析工具5,6,7,8,9,10,11,12来减少实验室间差异，但这些方法存在若干局限性。在这些方法中，胰岛和外分泌组织的分割要么依赖人工阈值，易产生主观误差5,6,7,8,9,10;要么采用全自动分割方法^11,12。此外，本地软件安装通常要求在^{5、6、7、8、9}、^10、11中进行，且可能仅限于特定硬件^10、11，从而限制了整体可访问性和标准化。

本出版物的总体目标是通过基于网络的深度学习平台，在人工专家监督下，提供一个标准化的工作流程，用于自动量化图像中孤立的胰腺胰岛。 IsletNet 解决了岛屿图像分析的可用性和可靠性方面的限制。本文提出了摘取胰岛移植物、生成合适显微图像以及正确使用 IsletNet 工具的推荐指南。该协议引入了自动生成结果的人工监督概念，并为潜在和已建立的用户介绍了工作流程（见图1）。简单比较工具允许潜在用户直接将 IsletNet 结果与本地获取的参考方法进行比较（见图1A）。由于本地生成的标准化图像在不同中心之间可能存在较大差异， IsletNet 可能需要重新训练才能实现可靠的分析（见图1B）。为促进这一过程，提供了标准化染色和图像采集的建议。对于已有用户，临床胰岛隔离工具设计支持人类胰岛分离工作流程（见图1C）。可下载的报告以及 IsletNet 生成的额外表格和可视化内容见 表1，关键计算参数汇总于 表2。

图1：面向潜在和已使用平台的用户的工作流程。 （A） 使用简单比较模块的本地验证工作流程。（B）再训练需要一组代表局部标准化图像的图像。（C） 使用临床胰岛隔离模块进行常规使用工作流程。总结了图像上传、分析、视觉质量控制（vQC）和报告生成的关键工作流程步骤。秤杆不适用。 请点击此处查看该图的放大版本。

表1：平台生成的可下载结果文件。 临床胰岛隔离和简单比较工具生成的可下载输出文件列表，按文件格式和输出类别分组。该表格包含报告文件、分段图像输出、可视化文件以及用于岛屿计数、体积、纯度和直方图分析的电子表格导出。 请点击此处下载此表格。

表2：可下载报告和电子表格输出中包含的关键参数。 临床胰岛隔离和简单比较工具生成的可下载XLSX和CSV文件中包含详细元数据、用户自定义设置和定量分析参数列表。参数包括会话元数据、图像采集设置以及图像和单个岛屿的岛屿量化指标。 请点击此处下载此表格。

方案

动物手术已根据捷克共和国卫生部批准（批准号49/2023），遵循欧洲共同体理事会指令86/609/EEC。人类胰岛分离和使用程序已获得国家药物控制研究所批准（批准号sukls111286/2023）。使用简单比较和临床胰岛分离工具分析了大鼠和人类胰岛制备的标准化显微图像，以比较自动分析与人工计数。标准（简）换算表¹³ 用于手动和自动岛屿等效计算。

1. 人工监督

1. 初选结果初步视图（见图2）
   1. 等待自动生成的岛屿数量、体积和纯度数值，以及相应自动注释（如轮廓或分段）的图形可视化，出现在批次结果窗口中。
   2. 在左侧信息面板（图2A）中查看当前样本图像的总结结果。
   3. 右侧表格中可查看复制值（图2B）和批量平均值（图2C）。
   4. 请通过链接（图2F）浏览图片预览（图2D、E）。右键点击图片预览，按弹窗菜单下载一张图片。
   5. 可使用导航箭头（图2G）浏览样本图像，或直接从表格中选择。
   6. 点击当前图像预览（图2D）内打开检查窗口，评估自动生成轮廓的质量并验证结果。
2. 视觉质量控制
   1. 在图像中移动并放大（图3A），检查轮廓是否有潜在误差。
   2. 在轮廓（只有计数的小岛有）之间切换，显示原始图像和其他可视化视图。
      注意：可用的视图列在窗口右侧的图例中（图3B），可通过键盘快捷键或顶部导航栏中的链接访问（图3C; 表3）。
   3. 如果轮廓可接受，按下箭头键进入下一张图像（见表3）。
   4. 尽可能手动修正轮廓错误。如果未检测到、部分检测到或虚假岛仍然存在，则将图像归类为无效并排除分析。
      注意：排除的图片会在批处理结果窗口（图2J）及所有下载文件中标记。
3. 可纠正错误：未分离的相邻小岛
   1. 必要时手动分离相邻的小岛。
   2. 左键点击小岛外以启动分隔线（见图3D）。
   3. 添加中间左键以引导相邻岛屿之间的分隔线（图3E）。
   4. 右键点击岛屿外以完成分离线（图3F）。
   5. 提交 分离线以更新结果（见图3G）。
      注意：根据需要开关新增分隔线的可视化（图3H）。
4. 可纠正错误：虚假小岛
   1. 使用分离工具将一个虚假岛屿划分为多个小于岛屿大小阈值的物体。
   2. 通过设定预定最小岛粒大小阈值（通常为50微米）避免计数小岛碎片。如有需要，根据当地实验室的做法调整阈值。
   3. 右键点击线上的任意一点，然后从弹窗菜单中选择相应选项，移除一条或全部手动添加的分离线（见图3I）。
5. 无法纠正的错误：缺失、部分分段或虚假的岛
   1. 切换剖分视图以验证小岛是否被检测到。
   2. 从批次平均计算中排除包含未检测、部分检测或多个虚假岛的无效图像（见图3J）。
6. 不可纠正的错误：错误分类的对象
   1. 如果外分泌组织、背景伪影或气泡被错误归类为胰岛，应排除该图像进行评估（见图3J）。

图2。批量结果窗口。（A） 当前样本结果摘要。（B）重复样本图像的结果。（C） 仅从已接受图像中获得批量平均值。（D，E，F）带链接的图形结果预览。（G）导航箭头示例。（H，I，J）修改、接受和排除的图片。（K） IsletNet 顶部导航栏。（L，M） 批处理结果窗口的页眉和页脚。请点击此处查看该图的放大版本。

图3。用于视觉质量控制和手动轮廓修正的检查窗口。 （A） 图像缩放显示。（B）图例和导航提示。（C）检查窗口顶部导航栏。（D–G）为相邻小岛建造并提交人工隔离线。（H） 手动分隔线的显示或隐藏切换开关。（一）移除手动分离管线。（J） 切换以排除统计中的图像。该界面视图中未显示比例条。 请点击此处查看该图的放大版本。

表3：检查窗口中的视图模式、键盘快捷键和导航控制。 在 vQC 期间，图像可视化模式、键盘快捷键和导航功能的摘要，以及对分割结果的人工审核，均可在检查窗口中查看。该表格包含等高线叠加、切段显示、直方图可视化以及临床胰岛隔离和简单比较工具中使用的图像导航控件。 请点击此处下载此表格。

2. 导航平台

1. 观看版本与技术信息
   1. 请查看当前软件版本和顶部导航栏中显示的最新培训日期（图2K）。
   2. 打开“主页”部分以访问技术描述及相关参考信息。
2. 本地影像初步评估
   1. 根据步骤1.2.4和1.5.2中描述的误差标准，判断平台是否已经能正确分析本地生成的标准化图像，或者是否需要对本地标准化图像进行重新训练（图1A 和 1B）。

3. 简单比较与外部训练与局部图像

1. 简单比较
   注意：使用简单比较工具将自动分析结果与本地建立的参考方法进行比较，通常为标准手动计数¹³表，替代^{表7、11、18}或模型^5、6。上传本地生成的标准化图像，以及对应的参考值和参考方法类型。输出包括可下载的表格、图片和PDF报告（表1）。
   1. 从顶部导航栏打开 简单比较 仪表盘（图4A 和 4B）。
   2. 请查看提示部分以获取所需的图像属性（见图4C）。
   3. 下载form.xlsx模板（图4D）。
   4. 使用本地建立的参考方法，在多个样本中计数小岛。
   5. 获取与计数样品对应的标准化显微图像。
   6. 确保所有计数的小岛都完全包含在图像框架内。
   7. 使用英文小数点将具体图像文件名和相应参数值输入form.xlsx模板（图4E）。
   8. 通过拖放或使用上传按钮上传完成的电子表格及相应的图片文件（见图4F）。
   9. 选择用于岛体体积估计的换算表或模型（图4G）。
   10. 点击 提交批次 以生成并排对比。
   11. 等待分析结果出来。
   12. 打开检查窗口以进行轮廓的视觉验证。
   13. 如果轮廓不正确，分析中应排除图像（见图3J）。
       注意：简单比较工具中不支持手动轮廓编辑功能。
   14. 下载结果表格、图片和PDF报告（见表1）。
2. 本地标准化图像的 IsletNet 训练
   1. 请联系实验医学研究所（IKEM）info@isletnet.com 开发团队。
   2. 分享代表性图片，涵盖目前本地获得的各种图像质量。
   3. 与开发团队讨论图像质量要求。
      注意：关键的图像质量参数包括足够的对比度、图像帧内完整的岛屿，以及相邻岛屿间的重叠最小化。胰岛的颜色可以从红色到粉色或紫色不等，只要与外分泌组织的区别依然清晰。
   4. 创建一个训练图像集，涵盖预期的岛体纯度、放大倍率和颜色变化范围。

图4。简单的比较工具、仪表盘和工作流程。（A） 顶部导航栏。（B） 简单比较仪表盘。（C）上传提示和说明。（D， E） form.xlsx模板下载并上传参数可视化。（F） 拖放上传区域，用于图片和电子表格。（G） 选择岛屿大小与体积的转换。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 抽样

注意：小岛的沉积速度迅速且根据大小和形状不同，这会影响采样结果。

注意：所有岛屿操作操作均应在层流罩内进行，同时佩戴适当的个人防护装备。

1. 使用50 mL或250 mL的胰岛悬浮管。
2. 根据观察到的颗粒体积和纯度，使用当地标准操作程序确定所需的采样分数。
3. 在采样前，轻轻将管子倒转五次，彻底混合胰岛悬浮液。
4. 立即使用大口径移液器头抽取样本，以防止外分泌组织堵塞并减少胰岛损伤。

5. 优化小岛图像采集

1. 二硫酮制备
   注意：需要持续的二硫酮染色，以确保胰岛与外分泌组织之间有足够的对比度。下面介绍了两种常用的制备方法。
   注意：地硫酮疑似生殖毒素。二甲基亚砑（DMSO）有毒且具有皮肤穿透性。氢氧化钠具有高度腐蚀性，可能导致严重的化学烧伤。在佩戴适当的个人防护装备时处理所有化学品，避免皮肤接触，并按照机构的有害废物程序处理废弃物。
   1. DMSO¹³的复兴
      1. 重量是50毫克二硫环粉末。
      2. 将二硫酮溶解在5毫升DMSO中。
      3. 在37°C下孵育溶液，并每5分钟剧烈孵化1分钟，直到溶解完成。
      4. 将1毫升高汤溶液稀释，加入20毫升含2%胎牛血浆的汉克平衡盐溶液，制备工作溶液。
      5. 将溶液过滤至0.22微米注射器过滤器。
      6. 用铝箔包住管子，保护溶液免受光照。
         注意：请在大约12小时内使用工作溶液。
   2. 碱性酒精溶液中的悬浮液（参考文献8的替代方案）
      1. 重量是50毫克二硫环粉末。
         注意：如有需要，请提前准备分租。
      2. 向二硫酮中加入800微升70%乙醇。
      3. 加入400微升1 M 氢氧化钠溶液，彻底涡旋直到溶解完成。
      4. 用含0.2 mg/mL人白蛋白的磷酸缓冲生理盐水稀释溶液，最终体积为20 mL。
      5. 将溶液过滤至0.22微米注射器过滤器。
      6. 用铝箔包住管子，保护溶液免受光照。
         注意：请在大约12小时内使用工作溶液。
2. 岛屿染色
   1. 在35毫米天线中心加入25微升二硫酮工作溶液。
   2. 加入50微升悬浮于含白蛋白的汉克平衡盐溶液中的胰岛、全培养基或移植培养基。
      注意：实际样品体积在20-50微升之间，取决于纯度分馏沉淀，最终二硫酮浓度为0.85 mg/mL至1.37 mg/mL。
   3. 用第一档缓慢移液器三次吸液，轻柔混合溶液，避免气泡形成。
   4. 在20°C–25°C下孵育样品1–2分钟，同时在显微镜下观察染色情况，直到斑点呈现鲜红色。部分制剂可能含有染色不良的小岛， IsletNet 也对此进行了培训。
   5. 使用10毫升注射器快速注射4毫升磷酸盐缓冲盐水，补充0.2 mg/mL白蛋白，直接注入染色样本，同时避免气泡和溅射。
   6. 立即用力旋转盘子，以圆周运动混合溶液，将小岛移向中心，然后稳定下来。
      方案一：小心地在周围添加4毫升PBS/白蛋白，保持二硫酮中的胰岛不受干扰。然后，轻轻以圆周运动旋转，混合溶液，保持小岛在中心。等二硫酮在盘子里散开。
      选项二（适用于立体显微镜）：不稀释胰岛，而是用移液器尖端或针头将二硫酮-孤岛滴剂涂抹成薄层，以减少反射。
   7. 在显微镜下检查样品，并立即用移液器尖端轻轻旋转周围溶液，将移位的岛屿重新回到相机视场。
   8. 立即开始图像采集，以减少细胞毒性和胰岛体积变化。
3. 图像采集
   注意：使用配备低倍物镜和稳定光源的立体或倒置显微镜。将天线从额外的光源（如室内照明）中遮挡。
   1. 打开灯源，让卤素灯泡加热5分钟。
   2. 设定标准光强以避免眩光和曝光不足。具体范围取决于所用成像硬件。
      注意：最佳光强可能因放大倍率和样品纯度而变化。
   3. 选择目标物和缩放设置，使所有岛屿保持在相机视野内。
   4. 对一批内所有样品保持相同的放大倍率，最好是所有纯度批次。
   5. 如有必要，使用归一化的白色幻灯片校准白平衡。如果由于岛屿准备的特殊特性，图像质量仍不理想，请调整RGB值和/或伽马设置。
   6. 通过彩色直方图调整曝光时间，如有必要，调整照明强度或增益，避免过曝。
      注意：含有丰富外分泌组织的样本可能需要不同的相机或照明设置，因为非胰岛组织反射光。为确保可重复性，将这些参数保存为单独配置文件以备将来参考。
   7. 捕捉图片并保存为支持的格式，包括 JPG、PNG、TIFF 或 BMP。
      注意：文件名中包含日期、纯度分数、放大倍率或像素大小及稀释度，以便未来重新分析（例如iz260105_H1_obj1.25x_1000x.jpg）。
   8. 使用与样品成像相同的放大倍率和变焦设置，获取舞台级千米计的图像。

6. 临床胰岛分离工具

注意：关键工作流程步骤总结于 图1C中。当样品可用时，以纯度分级批次分析图像。

1. 设置像素大小
   注意：计算出的像素尺寸仅在采用与分析样品相同的放大倍率和变焦设置拍摄的级级微米图像时有效。
   1. 打开 临床孤岛 隔离仪表盘。
   2. 点击 上传级级显微仪 ，选择级级显微计图像。
   3. 在数字尺上画出红色测量线的两端点，跨越已知距离。
      注意：尽可能使用更远的校准距离以提高测量精度。
   4. 输入已知距离（微米）。
   5. 提交 计算出的像素大小。
      注意：平台会保留计算出的像素大小，直到手动修改。
2. 纯度分数图像批量上传
   注意：使用3–4个重复样本以确保批量均值和标准差值的可靠计算。批次内所有样品都使用相同的稀释度。
   1. 将代表相同纯度比例的复制样品的图像拖放到上传区域。
      注意：平台基于文件名识别防止重复使用相同图片。
   2. 必要时修改像素大小。
   3. 进入最小岛屿大小阈值。
   4. 输入样本稀释值（例如，1000）。
   5. 输入颗粒体积（毫升单位），是从原始烧瓶记录的。
   6. 接着输入操作员缩写。
      注意：操作员缩写出现在生成的报告中。
   7. 输入代表当前隔离过程的会话ID。
   8. 输入批次编号（例如，1个高纯度）。
      注意：平台根据批次编号按字母数字顺序排序分数。
   9. 点击 提交批次 以开始分析。
3. 审核并最终确定批次结果
   注意：如有需要，请点击头部关闭之前的批处理结果窗口（见图2L）。
   1. 请等待数值和图形结果出现在批量结果 窗口。
   2. 在批处理结果窗口中双击图片预览，打开检查窗口。
   3. 按照步骤1的描述，复习并在必要时修正轮廓。
   4. 如果轮廓合适，使用向下箭头键进入下一张图像。
   5. 添加另一批，或使用窗口底部的按钮进入会话摘要（见图2M）。
4. 批处理编辑
   注意：平台会在会话过程中存储图片文件名，以防止无意中重复使用同一图片。这包括被移除的图片。如有必要，请先重命名图片再重用。
   1. 点击 “编辑批次 ”以添加或删除图像、修正样品规格或重命名批次（见图2L）。
      注意：如果预计需要重用图像，请在修改批次前记录图像文件名。
   2. 点击 “移除批处理 ”以完全删除该批次（见图2L）。
5. 查看摘要并生成报告
   1. 点击 “显示摘要 ”以显示会话概览（图2M）。
      注意：如有需要，请返回之前的批次并进行编辑。
   2. 查看该次会话的总岛屿数量、体积和颗粒体积值，以及相应的平均批次值。
6. 下载报告。
   注：简短报告包含总胰岛计数、体积、纯度、颗粒值、直方图和纯度分数总结。完整报告还包括每张样本图像的图形信息，接受值以红色显示，排除值以黑色显示。

结果

纯鼠小岛

在第一次实验中，通过四次独立成像拍摄，共拍摄了36张图像，代表12个样本，共计249个纯化大鼠岛。图像通过立体显微镜在三种标准化但不同的照明条件下生成，使用卤素和发光二极管（LED）光源配合不同的相机设置。 IsletNet 训练专家为三张代表性图像手动生成了地面真实（GT）分割。

当使用公开版本的简单比较工具分析图像时，没有任何自动生成的轮廓通过视觉质量控制（vQC，见图5F）。随后，平台使用代表性的局部图像进行了重新训练，所有由重新训练实验版本生成的轮廓均通过了vQC（见图5C）。

自动与人工胰岛体积估计的比值在重新训练后显示出三种成像条件的稳定表现，照明条件A、B和C的中位数分别为1.03、0.98和0.94（见图5A）。与原始训练模型相比，这些结果具有显著改进（见图5B）。

像素级与GT分割的对比显示，重新训练后自动与手动生成的轮廓高度高度一致（图5D），对应代表性图像中的等高线准确位置（图5C）。相比之下，原始训练模型显示假负像素比例增加（图5G）和轮廓错位（图5F），导致对应的岛大小直方图中岛群类别较小（图5E 对5H）。

图5。利用三种成像装置和大鼠岛准备评估平台再训练。 （A） 使用三种成像设置重新训练后， IsletNet 与手动胰岛等效（IEQ）估计值的比较。（b） 使用原始公共训练模型比较 IsletNet 与手动 IEQ 估计值。（C，F）在重新训练模型后和重新训练模型前，使用vQC工具进行代表性的轮廓放置。白色箭头表示轮廓位置正确，品红色箭头表示轮廓位置不正确。（D，G）分别是重新训练后和与原始训练模型的像素级对比。图例中标示了真阳性、假阳性、假阴性和真阴性区域。（E，H）重新训练后和原始训练模型后的代表性岛大小直方图，分别与人工计数进行比较。成像装置1 = LED照明;成像装置2 = 卤素照明;成像装置3 = LED暗场照明。比例杆=100微米。箱形图按图基惯例表示;胡须范围延伸到第一和第三四分位数1.5×四分位范围内的数据点。 请点击此处查看该图的放大版本。

临床人体胰岛制备

在第二个实验中，使用公开版本的平台分析了17张代表单一人类胰岛分离程序的图像，包含三对纯度分数对。其中一个样本丢失了。vQC后，所有代表中低纯度分数的图像均被排除，原因是检测到虚假胰岛（未显示数据）。随后，该平台被重新训练，使用具有代表性的本地图像。

经过重新训练，所有图像在添加三条手动分离线后均通过了vQC。批次与人工计数的比较显示，总岛屿计数和体积估计整体低估了≤5%。稀释在2000至4000倍之间的样品中，根据纯度分数不同，含有80至4个岛屿。单个纯度分数对最终制备的相对贡献如 图6A所示。高纯度组分1VC2主要贡献较小的岛，而中等纯度组分2SC1则较小。平台自动生成的整体岛屿大小直方图见 图6B。

图6。人类胰岛分离样本的定量与分析。 （A） 利用 IsletNet 和手工计数方法，在完整移植物的纯度分数中进行胰岛计数及胰岛当量体积估算。（B） 由 IsletNet 使用批次均值生成的最终岛屿大小直方图。（C） 对 IsletNet 及17张单独图像的人工计数和体积估算比较。（D） 样本3NC1的代表性图像细节，显示由重新训练的 IsletNet生成的原始图像和轮廓位置。（E） IsletNet 分割与手动计数专家与 IsletNet训练专家生成的地面真实数据（GT1与GT2）的像素级比较。图例中标示了真阳性、假阳性、假阴性和真阴性区域。（F）同一图像的代表性岛屿大小直方图，比较 了IsletNet 和人工结果。品红色箭头表示等高线和岛屿大小类别的变化。比例杆=100微米。箱形图按图基惯例表示;胡须范围延伸到第一和第三四分位数1.5×四分位范围内的数据点。 请点击此处查看该图的放大版本。

随后对所有单幅图像进行了自动和人工估计的比较（见图6C）。自动与人工估计的中位比为岛屿数量1.00，岛体积为0.93，观察到若干异常值。在一个代表性的低纯度样本（3NC1）中，平台识别出与人工计数相同的岛屿数量（五个），但估计岛体积减少了29%。这些数据点通过 图6C中的箭头标示。

图 6D展示了该代表性图像中部分被外分泌组织困住的最大岛屿，包括原始图像和自动生成的轮廓叠加图。图 6E展示了两位专家独立生成的GT分割与像素级对比。相应的岛粒大小直方图显示，人工与自动分割之间的大小分布发生变化（见图6F）。

自动化分析的运行性能

简单比较工具和临床孤岛隔离工具的运行性能在标准互联网条件下进行了评估，平均下载和上传速度分别为50 Mbps和30 Mbps。分析了五批各12张图像，使用大小从0.5MB的JPEG文件到20MB的TIFF文件。完整ZIP结果包的下载时长进行了测量。

分析可视化时间和下载时长随着图像尺寸的增加逐渐增加（表4）。临床胰岛分离工具相比简单比较工具在等效图像集上需要更长的处理时间。这些结果展示了图像分辨率、文件格式和分析吞吐量在常规操作中的实际关系。

表4：临床胰岛分离和简单比较工具的分析可视化时间和下载时长。 比较使用不同文件大小和格式的图像批处理结果可视化和文件下载所需的处理时间。测量使用包含12张图像的批次进行，报告为从批量提交到结果可视化或下载完成的经过时间。 请点击此处下载此表格。

讨论

这里展示的协议描述了面向潜在和成熟用户的 IsletNet 实际工作流程，重点强调平台的两个关键特性：专家级 vQC 和神经网络再训练。代表性结果表明，准确的自动量化不仅依赖于图像分割性能，还取决于用户在接受结果前对轮廓位置和图像适宜性进行批判性评估的能力。另外使用了两个高级工具——像素对像素比较和我的分割，用于生成选定的验证结果;然而，这些工具主要用于神经网络训练支持，因此未包含在协议工作流程中。

IsletNet 被开发为一个协作且广泛可访问的标准化岛屿图像分析参考工具，跨实验室进行。神经网络通过对原始二维显微图像^14、15、16的人工注释GT切片进行训练和验证。生成了两种用于二硫酮染色制剂的独立模型，以及一个用于未染色大鼠岛的研究模型，并可根据申请访问。平台版本和培训日期会显示在用户界面中。IsletNet 自动对岛屿和外分泌组织进行分段，随后利用用户自定义的像素大小和最小岛屿大小阈值计算岛屿数量、体积和纯度。岛屿大小的阈值选择取决于图像质量和分析的目的（与手工计数与小岛研究的并排比较），而非物种。鉴于传统显微镜的分辨率，有意义的最小胰岛尺寸为50微米（7,8,9,12），但对于使用适当仪器¹⁰获得的图像，最大可减少至10微米。岛体积估计使用标准基于球面的转换表¹³以及替代换算表^7、18、19，包括拟合椭圆近似^5、6和基于等高线的Spinacle and Sphiracle模型¹⁷进行生成。所得数值以岛屿当量和纳米升为单位报告，纯度则根据组织面积或估计的组织体积计算。该协议的一个关键步骤是获取适合自动分割的标准化显微图像。IsletNet 通过配备多种互补金属氧化物半导体相机和照明系统的立体显微镜和倒置显微镜拍摄图像进行训练。低倍率物镜（1–2×）的优点在于它们允许完整样品保持在视场内，同时保持像素大小，以可靠地探测小岛。稳定的照明、稳定的白平衡以及避免图像过曝是可靠轮廓生成的关键。代表性结果表明，使用代表性局部图像进行重新训练，可以显著提升不同成像条件下的分割性能。作为实用指导，当有经验的观察者能清楚区分岛屿和外分泌组织边界时，图像通常适合用于IsletNet训练。包含聚集或高度重叠的岛屿的图像应尽量避免。

该协议还强调了自动化图像分析的若干局限性和故障排除问题。虽然 IsletNet 相比完全手动计数显著提升了吞吐量、客观性和可重复性，但该方法对图像质量仍然敏感。等高线位置错误（虚假岛检测及未能分离相邻岛）偶尔可能发生，影响下游量化。在接受自动结果之前，例行的 vQC 仍然是必要的。立即应用于 IsletNet 有利，因为不合适的图像可以通过调整成像参数重新获取。在检查窗口内，除缺失小岛或多处假岛外，自动等高线可手动修正。此外，自动分离算法基于等高线几何和岛屿大小分布统计，因此可能与个别专家的初步解释不同，但仍保持分析上的可接受性。

IsletNet的可靠性主要取决于局部图像质量与训练数据集之间的一致性，而非仅仅取决于物种。尽管当前训练集包含不同纯度的人类岛屿和高纯度大鼠岛，但只要图像特征与训练数据一致，平台可能会扩展到其他物种。例如，经过培养纯化的猪岛可能类似于训练数据集中嵌入的人类岛。相比之下，广泛培养且二硫酮染色较弱的岛屿在训练中未被代表，可能需要额外训练。因此，简单比较工具支持新用户或新成像配置的重要验证步骤。这里呈现的结果强调了不同专家对嵌入岛屿的解释如何影响GT生成和下游体积估计。为解决未来多中心研究缺乏广泛专家共识的问题，开发了 IsletSwipe 应用²⁰，以促进基于共识的图像注释。

与传统显微镜下手工计数相比， IsletNet 提供了显著更高的吞吐量、永久的数字文档和标准化的定量输出，同时减少了操作员依赖的变异性。人工计数在边缘病例中仍可能提高组织识别的信心，但受限于主观大小估计、较低的可扩展性以及广泛的人员培训要求。作为一项基于网络的服务， IsletNet 通过集中但匿名的分析实现了实验室间的可比性。分析速度仍取决于本地互联网带宽、图像文件大小和图像复杂度。较大的TIFF文件可能提升图像真实度，但上传和下载时间比压缩后的JPEG图片更长。

总体而言，这里呈现的结果表明，当局部图像采集保持可重复性且与训练集一致时，可靠的自动量化是可以实现的。鼓励用户将vQC纳入日常训练，并在局部影像条件出现重大变化时考虑重新训练。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm Petri dishes	Sigma-Aldrich	P5481	非无菌
200 µL 宽口移液器吸头	Sigma-Aldrich	AXYT205WBCRS	用于染色前的胰岛悬液分配
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650	GC级或细胞培养级
二硫肼（DTZ）	Sigma-Aldrich	D5130	粉末
乙醇，70%	本地供应商	N/A	(v/v) 在H2O中；用于DTZ制备
胎牛血清（FBS）	Gibco	10270106	热作用失活，合格
Hank's平衡盐溶液（HBSS）	Sigma-Aldrich	H6648	有或没有酚酞红（根据分析指定）
人白蛋白	Grifols	61953-0001-2	高浓度溶液（200 g/L）
Infinity 1-3C	Lumenera	3-1URC	CMOS，3 MP
Infinity Capture	Lumenera	N/A	标准图像采集软件
倒置显微镜 CKX41	Olympus	N/A	1.25x和2x目镜
LED-高功率-光点（2臂）	Photonics	10068	LED光源；双鹅颈导光管
Light source Highlight 2000	Olympus	5-HL2000	卤素光源（14.5 V，90 W）；手动强度控制；双鹅颈导光管
实验室必需品	各种	N/A	移液器、管子、针头、注射器、实验室定时器、标准个人防护设备
MicroCam 软件	Bresser	N/A	标准图像采集软件
MikroCam 3.0M	Bresser	86000180	CMOS，3.1 MP 相机
Millex-MP 过滤器单元	MilliporeSigma	SLMP025SS	0.22 µm 孔径，PES 膜
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	Gibco	10010023	pH 7.4
Promicam Pro 3-5 CP	Promicam	E61MPR937	CMOS，5 MP，高动态范围相机
QuickPHOTO	Promicra	N/A	标准图像采集软件
氢氧化钠（1 M NaOH）	本地供应商	N/A	用于 DTZ 制备期间的 pH 调整和溶解
台盘测微尺	Thorlabs	R1L3S1P	10 mm 长度；50 µm 分度用于校准
立体显微镜 SZH10	Olympus	N/A	1x 近衍射限目镜