蒽比色法用于量化大鼠肝和骨骼肌中的糖原

摘要

该方案描述了一种用葅比色法，用于在大鼠肝和骨骼肌中不同代谢状态下定量糖原。

摘要

糖原是肝和骨骼肌中重要的细胞内葡萄糖储备，在碳水化合物代谢中起着基础作用。肝糖原对于维持系统性血糖稳态至关重要，而骨骼肌糖原则支持体育活动和运动表现。因此，准确定量组织糖原对于糖原代谢被动态调控或病理性改变的研究至关重要。本文介绍了一种可靠且灵敏的葷酮比色法，用于量化大鼠肝脏和骨骼肌中的糖原含量。该方案由连续步骤组成，包括碱性消化、脱蛋白、糖原沉淀、酒精清洗以及使用蒽酮试剂的颜色显影。该方法的适用性在接受三种生理相关条件的老鼠中得到了验证： 随意 喂食、夜间禁食和短期再喂食。这些实验范式捕捉了与糖原储存、耗竭和再合成相关的关键代谢状态。对关键酶——糖原合酶和糖原磷酸化酶进行正交西方印迹分析，为观察到的代谢变化提供了机制支持。该方法在接受肾上腺素处理的动物中进一步验证，以模拟急性应激诱导的糖原分解。该方法整体提供宽广的动态范围和足够的灵敏度，能够在截然不同的生理状态下定量组织糖原。它为体内糖原代谢研究提供了可靠的工具，也可应用于体外细胞培养模型。

引言

糖原是一种高度分支的多糖，是哺乳动物骨骼肌和肝脏中的重要能量储备，在大脑、肾脏、心脏和^{脂肪组织等}其他器官中也有较小的贡献。在摄食过程中，多余的葡萄糖会发生聚合或新生脂肪生成，并以糖原或脂质的形式储存。然而，在禁食或剧烈活动期间，糖原会发生酶降解，确保持续且快速地供应葡萄糖以满足能量需求。这种糖原的缓冲能力对于维持生理快速再摄食周期中的血糖稳态^{至关重要。}

糖原合成由糖原合酶（GYS）催化，该酶存在于两种哺乳动物亚型：GYS1和GYS2中。GYS1主要在骨骼肌中表达，而GYS2是肝脏的同构体。GYS的催化活性在多个位点（包括Ser641）被磷酸化抑制，而在进食条件下去磷酸化时活性被刺激。糖原分解由糖原磷酸化酶催化。肝脏的异构型是PYGL，肌肉的异构体是PYGM。与GYS不同，其催化活性在空腹时Ser15磷酸化时被刺激，喂食后去磷酸化时被^抑制。

糖原代谢的正确调控是许多生物过程的基础，糖原代谢失调已被确认是许多疾病的致病因素。具体来说，肝素代谢异常与多种代谢疾病相关，包括糖原贮积病⁴、2型糖尿病⁵、代谢功能障碍相关脂肪性肝病^6,7以及低血糖反调节反应受损⁸。此外，脑糖原对长期记忆形成至关重要，⁹，而骨骼肌糖原是耐力能力的关键调节因子¹⁰。因此，组织糖原的准确定量对于糖原代谢被动态调控或病理改变的研究至关重要，从而能够研究疾病机制并评估糖原调节干预措施。

已有多种糖原定量方法被报道，包括蒽酮法^11,12、亚米洛克鲁西达酶法¹³、酚硫酸法¹⁴以及非侵入性核磁共振光谱法（MRS）^方法15，每种方法都有其优势和局限性。本文介绍了蒽比色法用于量化大鼠肝和骨骼肌中糖原的详细方案（见图1）。该方案包括碱性消化、脱蛋白、糖原沉淀、酒精清洗以及使用蒽酮试剂的染色等连续步骤。该方法简单、经济，且几乎不需要专业仪器。为证明其灵敏性和可重复性，我们计算了检测极限（LOD）、定量极限（LOQ）以及检测内和间变异系数（CV%），采用一系列糖原标准。为证明其适用性，在三种生理相关条件下评估肝和骨骼肌中的糖原水平：随意喂养、16小时夜间禁食和短期再喂食。此外，该方法还利用肾上腺素处理的动物模型，模拟了急性应激诱导的糖原分解。对参与糖原代谢的关键酶进行了正交西方印迹分析，以证实观察到的代谢变化。

图1：糖原定量工作流程概述。 肝脏和骨骼肌糖原定量实验流程的示意图。该程序包括组织采集、碱性消化、蛋白质沉淀、糖原分离以及基于蒽的比色检测。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

所有动物方案均由南京医科大学机构动物护理与使用委员会（IACUC;#1905019）批准。

1. 试剂的制备

1. 所有本研究中使用的试剂，请参阅 材料表 。
2. 在实验开始前准备好所有溶液。
3. 根据需要调整溶液体积。
4. 制备1 M 氢氧化钠（NaOH）溶液
   1. 重量是40克氢氧化钠颗粒。
   2. 将氧化钠颗粒加入800毫升蒸馏水中。
   3. 用玻璃棒搅拌溶液，直到容器底部没有未溶解颗粒。
   4. 将溶液转移到一个1升体积瓶中。
   5. 用蒸馏水将容量调到正好1升。
   6. 将溶液储存在密封瓶中，室温（RT;18°C–23°C）。
      注意：NaOH具有腐蚀性。请佩戴护目镜、手套和实验服。市售的氧化钠颗粒并非百分之百纯净，会吸水。避免颗粒长时间暴露在空气中。
5. 制备20%氯化锂（LiCl）库存溶液
   1. 秤重20克无水LiCl粉末。
   2. 将LiCl粉末加入80毫升蒸馏水中。
   3. 搅拌溶液直到容器底部没有未溶解颗粒。
   4. 将溶液转移到100毫升容量瓶中。
   5. 用蒸馏水将体积调至正好100毫升。
   6. 将溶液储存在密封瓶中，存放在RT的容器中。
      注意：LiCl会刺激皮肤、眼睛和呼吸道。请佩戴护目镜、手套和实验服。LiCl吸湿性很高。尽量减少空气接触，以防止水分被吸收。
6. 准备蒽酮反应溶液
   1. 将28毫升蒸馏水放入一个1升烧杯中。
   2. 向水中加入72毫升高纯度（98%）硫酸（H₂SO₄）。
   3. 让混合物冷却到RT。
   4. 在溶液中加入50毫克葒酮。
   5. 搅拌直到蟋腆溶解。
   6. 在溶液中加入3克硫脲。
   7. 搅拌直到硫尿糖溶解。
   8. 将溶液转移到一个用琥珀或锡箔包裹的玻璃瓶中。
   9. 将溶液存放在冰箱（2°C–8°C）中，最多保存一周。
      注意：硫酸具有高度腐蚀性，会导致严重的化学灼伤，并且与水反应剧烈。穿实验服、防化学手套和面罩。所有步骤均在认证化学排气罩内完成。稀释会产生强烈的热量。水里一定要加酸。
7. 制备含0.1%氯乙烯的95%乙醇
   1. 向玻璃瓶中加入95毫升绝对乙醇。
   2. 加入4.5毫升蒸馏水。
   3. 加入0.5毫升20%LiCl浓缩液。
   4. 充分搅拌。
8. 制备含0.1%氯化硅的80%甲醇
   1. 向玻璃瓶中加入80毫升绝对甲醇。
   2. 加入19.5毫升蒸馏水。
   3. 加入0.5毫升20%LiCl浓缩液。
   4. 充分搅拌。
9. 准备100%三氯醋酸（TCA）溶液
   1. 秤重100克TCA粉末。
   2. 将TCA粉末加入80毫升蒸馏水中。
   3. 搅拌直到溶解。
   4. 将溶液转移到100毫升容量瓶中。
   5. 用蒸馏水将体积调至正好100毫升。
   6. 将溶液储存在密封玻璃瓶中，存放在RT处。
10. 准备饱和苯甲酸溶液
    1. 在一个250毫升玻璃烧杯中加入0.5克苯甲酸晶体到100毫升蒸馏水中。
    2. 将混合物加热至90°C，使用连续磁性搅拌。
    3. 继续加热，直到容器底部没有未溶解颗粒。
    4. 让溶液冷却到RT上。
    5. 抽取无可见颗粒的透明上清液。
    6. 将溶液存放在密封玻璃瓶中，送往RT。
11. 准备葡萄糖标准
    1. 将50毫克葡萄糖粉溶解在50毫升饱和苯甲酸溶液中，制备1毫克/毫升的液质溶液。
    2. 通过以下方式，通过连续稀释与饱和苯甲酸，在1.5 mL微离心管中制备葡萄糖标准品（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5和1 mg/mL）。
       1. 向1号管加入500微升1 mg/mL的存液，制备1 mg/mL标准液。
       2. 向2号管加入250微升的液液和250微升饱和苯甲酸，制备0.5 mg/mL标准。
       3. 向管3加入200微升2液和300微升饱和苯甲酸，制备0.2 mg/mL标准。
       4. 向4号管加入250微升3号溶液和250微升饱和苯甲酸，制备0.1 mg/mL标准。
       5. 向管5加入250微升4号溶液和250微升饱和苯甲酸，制备0.05 mg/mL标准。
       6. 向第6管加入200微升5号溶液和300微升饱和苯甲酸，制备0.02 mg/mL标准品。
       7. 向管7加入250微升6号溶液和250微升饱和苯甲酸，制备0.01 mg/mL标准品。
       8. 将500微升饱和苯甲酸加入单独管子以制备空白液（0 mg/mL）。
    3. 每个管子和漩涡都封盖10秒，充分搅拌。

2. 动物治疗

1. 一般畜牧
   1. 在动物设施中饲养雄性Sprague–Dawley大鼠（230–270克），条件为特定无病原体条件（VAF/Plus健康状况，查尔斯河实验室），经认证无常见啮齿动物病原体，包括仙台病毒、肺支原体和大鼠细小病毒。
   2. 提供标准的饲养，并允许免费饮用水。
   3. 保持动物12小时的光暗循环（08：00点亮灯，20：00关灯）。
   4. 保持呼吸道温度在22°C–23°C。
   5. 保持相对湿度在30%–70%。
2. 夜间禁食
   1. 把老鼠转移到普通的笼子里。
   2. 移除食物，提供免费饮用水。
   3. 从16：30到第二天早上8：30禁食16小时。
3. 再喂养
   1. 给夜间禁食的大鼠提供常规的松狮粮（200克）。
   2. 允许动物自由进食2小时。
4. 肾上腺素挑战
   1. 准备盐酸肾上腺素溶液。
      1. 用校准的分析天平称重5毫克肾上腺素盐酸粉末。
      2. 将粉末转移到15毫升离心管中，加入10毫升生理盐水。
      3. 盖上管子，倒置10次，制成0.5 mg/mL的原汁溶液。
   2. 以1毫升/公斤体重（0.5毫克/公斤^{体重）体积}注射非空腹大鼠腹腔内盐酸肾上腺素溶液3。
      1. 保持动物头朝下，让腹部内容物向颅内移动。
      2. 将一根25号针以45°角插入腹部右下象限。
      3. 注射前抽吸确认无血或肠内容物。
   3. 对照动物腹腔内注射生理盐水，体积为1 mL/kg。
   4. 采集尾静脉血液样本。
      1. 抓住老鼠，露出尾巴。
      2. 将尾巴按压并加热10秒，以促进血液循环。
      3. 用无菌的25号针刺出尾端3厘米处的侧尾静脉。
      4. 用干净的纱布丢弃第一滴血，以避免组织液污染。
      5. 采集第二滴血以测量血糖。
   5. 每15分钟用血糖仪测量一次血糖，持续60分钟。
      1. 按照制造商的说明校准血糖仪。
      2. 每月使用对照溶液验证血糖仪的准确性。
      3. 试纸应存放在原容器中，以防止湿气暴露。
      4. 取出容器后立即使用试纸。
      5. 将试纸插入血糖仪，即可自动激活血糖仪。
      6. 让血液样本通过毛细作用进入试纸。
      7. 记录显示的血糖值。

3. 组织采集

1. 安乐死与准备
   1. 通过异氟醚过量安乐死动物。将动物放入感应舱，暴露于5%异氟醚、100%氧气、2升/分钟的剂量下，至少3分钟。
   2. 通过确认停止呼吸来确认死亡。
   3. 确认角膜反射和脚趾夹击反射的丧失。
      1. 用无菌棉尖的涂抹器轻轻触摸角膜，确认没有眨眼反应。
      2. 用钝钳用力挤压后爪趾间的蹼，确认没有运动反应。
   4. 将大鼠腹面朝上放在解剖盘上。
   5. 用喷瓶用75%乙醇润湿腹部皮肤。
      注意：尽量缩短安乐死与组织保存之间的时间，以减少死后缺血引起的糖原降解。
2. 肝脏夹层
   1. 在剑突后方约1厘米处皮肤上切一个小切口。
   2. 将切口向胸骨方向延伸。
   3. 将皮肤与下方肌肉分离。
   4. 进行双侧横切开术，切口约4厘米，位于剑突后方约1厘米处，并向左右肋下边缘外侧延伸，完全暴露腹腔。
   5. 确认肝脏。
   6. 切除右中叶（图2A）。
   7. 1分钟内称重组织。
   8. 将纸巾放入聚丙烯塑料容器中。
   9. 将组织迅速冷冻在干冰中。
3. 骨骼肌夹层
   1. 以腓肠肌为代表标本，因为它包含了快肌和慢肌纤维的混合体，反映了后肢的新陈代谢和收缩特性¹⁶。
   2. 把老鼠趴在肚子上。
   3. 沿后肢后侧从膕窝到跟骨结节处纵向皮肤切口。
   4. 把皮肤分开。
   5. 识别并反映股二头肌和半腱肌。
      1. 将股二头肌识别为覆盖大腿后半部分的大型侧向肌肉。
      2. 识别半腱肌为沿大腿后侧内侧延伸并插入膝盖附近的细长带状肌肉。
   6. 露出腓肠肌。
   7. 用细剪刀切断跟腱远端附着点。
   8. 分离比目鱼肌。
   9. 在股骨内侧和外侧上髁处松开腓肠肌的近端附着。
   10. 切除整个腓肠肌（见图2B）。
   11. 1分钟内称重组织。
   12. 将纸巾放入聚丙烯塑料容器中。
   13. 将组织迅速冷冻在干冰中。

图2：肝和骨骼肌组织剥离程序。 （A） 暴露腹腔和肝组织采集的顺序步骤，包括皮肤切口、切口延伸、皮肤与下层肌肉分离以及横切开腹术。（B）分离腓肠肌的顺序步骤，包括纵切口、上覆肌肉反射、解剖结构识别及肌肉切除。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 糖原比色测定

1. 第1天：碱性消化
   1. 将0.4克组织加入50毫升离心管。允许容忍度为±0.1克，以确保快速处理并减少组织降解。
   2. 向管内加入10毫升1兆米氢氧化钠溶液。
   3. 用无菌刀片或剪刀将组织切碎，直到组织碎片约1–2毫米大小。
   4. 将管子放入95°C±5°C的水浴中。
   5. 潜伏30分钟。
   6. 在孵化期间，每10分钟以2500转/分钟的频率对样品进行10秒的涡旋。
   7. 把管子从水浴中取出来。
   8. 让样品冷却到复原。
2. 蛋白质测定用裂解液的制备
   1. 使用校准的P1000移液器将1毫升碱性裂解液转移到微离心管。
   2. 离心机在8000克×离心10分钟。
   3. 收集上清液。
   4. 将上清液保留用于BCA蛋白检测。
3. TCA介导的脱蛋白
   1. 将3毫升碱性裂解液转移到15毫升离心管上。
   2. 加入1毫升100%（w/v）TCA溶液。
   3. 加入6毫升蒸馏水，使总体积达到10毫升。
   4. 在2500转/分钟时涡旋混合气，持续10秒。
   5. 将管子放在冰上（0°C–4°C）。
   6. 培养1小时以沉淀蛋白质。
4. 脱蛋白上清液收集
   1. 将1毫升混合物转移到微离心管中。
   2. 离心机在8000克×离心机下10分钟，RT速度。
   3. 保留上清液。
5. 糖原沉淀
   1. 将0.4毫升上清液转移到新的微离心管。
   2. 加入0.8毫升含0.1%LiCl的95%乙醇。
   3. 彻底漩涡混合。
   4. 在RT下孵育16小时。
6. 第2天：糖原沉淀
   1. 在1000 × g下离心15分钟，以RT方式得到坚硬半透明的白色糖原沉淀（图3A 和 图3B）。
   2. 丢弃上清液。
7. 第一次糖原洗涤
   1. 向沉淀中加入1.5毫升含0.1%LiCl的80%甲醇。
   2. 以2500转/分钟的速度使样品涡旋10秒。
8. 洗涤后离心
   1. 离心机在1000克×离心机下用RT速度5分钟。
   2. 丢弃上清液。
9. 第二次糖原洗涤
   1. 重复洗涤步骤一次。
   2. 使用细尖P200移液器仔细吸取残留液体，确保糖原沉淀不受干扰。
10. 糖原溶解
    1. 向颗粒中加入0.8毫升蒸馏水。
    2. 在2500转/分钟时产生涡旋，直到达到无可见颗粒的透明均匀溶液。
11. 标准和样品的制备
    1. 准备1.5毫升微离心管，用于葡萄糖标准、空白样品和三份未知样品。
       注意：按照 表1向每个管子添加试剂。
    2. 在指定管子中加入每种葡萄糖标准50微升。
    3. 向空管加入50微升蒸馏水。
    4. 向每个未知样品管加入50微升糖原样本。
    5. 每根管加入200微升蒽酮反应溶液。
12. 菽的颜色显影与吸收度测量
    1. 彻底对所有管子进行漩涡处理。
    2. 将管子放入95°C±5°C的水浴中。
    3. 潜伏15分钟。
    4. 拆下管子，让它们冷却到RT管。
    5. 将每根管子的200微升液体转移到96孔板上。
    6. 使用微板读筒（端点模式，25°C）测量620纳米的吸收率，并自动校正路径长度至1厘米。
    7. 标准曲线的确定系数（R²）应为≥0.995，由线性回归确定，才被视为可接受。
    8. 任何单一标准或样本重复样本，其三倍测量中CV%为>20%应被视为不可靠并重新进行。

图3：不同营养状态下的糖原分离与定量。 （A） 肝脏样本中沉淀糖原颗粒在喂养、空腹和复发条件下的代表性图像。（B）骨骼肌样本中在喂养、空腹和反复条件下沉淀的糖原颗粒代表性图像。（C）由葡萄糖标准生成的标准曲线，显示620纳米处吸收率与葡萄糖浓度之间的线性关系。（D）在喂食、空腹和转介条件下的血糖水平。（E）喂食、空腹和推荐条件下的肝素含量。（F）在喂养、空腹和推荐条件下骨骼肌糖原含量。数据以SEM平均±表示（每组n = 6个）。统计分析采用普通单向方差分析（ANOVA）进行，并通过Benjamini–Hochberg方法校正多重比较。**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns：无显著性。 请点击此处查看该图的放大版本。

试剂	0 mg/mL	0.01 mg/mL	0.02 mg/mL	0.05 mg/mL	0.1 mg/mL	0.2 mg/mL	0.5 mg/mL	1 mg/mL	空白	未知样本
葡萄糖标准溶液	50微升	50微升	50微升	50微升	50微升	50微升	50微升	50微升	–	–
蒸馏水（H₂O）	–	–	–	–	–	–	–	–	50微升	–
糖原样本	–	–	–	–	–	–	–	–	–	50微升
蒽反应溶液	200微升	200微升	200微升	200微升	200微升	200微升	200微升	200微升	200微升	200微升

表1：糖原比色分析的反应装置。 用于蒽酮比色测定的葡萄糖标准、空白和未知糖原样品的反应设置。在培养和吸收测量前，将定量的葡萄糖标准液、蒸馏水或糖原样品与蒽酶反应溶液结合。

5. 组织糖原含量的计算

注意：将测量到的糖原归一化为组织湿重或总蛋白质量。

1. 标准曲线与浓度确定
   1. 使用八根葡萄糖标准管的吸收读数。
   2. 在与葡萄糖浓度绘制前，先从吸收度读数中减去空白值。
   3. 在Excel中使用普通最小二乘回归拟合线性回归曲线（见图3C）。
   4. 通过使用步骤5.1.3中得到的回归方程，将空白减去吸收值插值到线性标准曲线上，计算每个未知糖原样品（C_未知）中的葡萄糖浓度。
2. 归一化为组织湿重
   1. 使用以下公式计算糖原含量：
      
   2. 将_未知C定义为步骤5.1.4中确定的未知糖原样品中的葡萄糖浓度（mg/mL）。
   3. 定义0.8为步骤4.10.1中溶解的糖原样品（mL）体积。
   4. 定义0.9为将葡萄糖值转换为糖原值的因子。
   5. 定义2.5为第4.5步中糖原沉淀过程中引入的稀释因子。
   6. 定义10为第4.3.3步中总10毫升混合物中分析的1毫升分量的稀释因子。
   7. 定义10/3为解释步骤4.1.2中总10毫升碱性消化中3毫升分量的稀释因子。
3. 归一化为总蛋白质质量
   1. 使用以下公式计算糖原含量：
      
   2. 将_未知C定义为步骤5.1.4中确定的未知糖原样品中的葡萄糖浓度（mg/mL）。
   3. 定义0.8为步骤4.10.1中溶解的糖原样品（mL）体积。
   4. 定义0.9为将葡萄糖值转换为糖原值的因子。
   5. 定义2.5为第4.5步中糖原沉淀过程中引入的稀释因子。
   6. 定义10为第4.3.3步中总10毫升混合物中分析的1毫升分量的稀释因子。
   7. 定义1/3为修正因子，考虑步骤4.3.1中碱性消化中使用的3毫升分量。
   8. 定义蛋白质浓度为通过BCA分析确定的碱性消化中总蛋白（mg/mL）的浓度，该浓度见步骤4.2.4。

6. 催化糖原代谢的关键酶的西方墨迹

1. 一般考虑
   1. 请参阅之前描述的标准西墨迹程序^17,18。
2. 蛋白质提取
   1. 重量为75毫克速冻组织。允许耐受性为±25毫克，以确保快速处理并减少组织解冻。
   2. 加入1毫升冰冷RIPA溶解液（50 mM 三盐酸，pH 7.4;150 mM NaCl;1% Triton X-100;0.5% 脱氧胆酸钠;0.1% SDS;及1 mM EDTA），并补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
   3. 使用手持转子-定子均质器对组织进行均质。
3. 裂解液制备
   1. 将均质菌在冰上孵育30分钟。
   2. 在孵育期间以2500转/分钟的速度涡旋样品，每10分钟进行10秒。
   3. 在10,000 × g下使用固定角度转子在4°C下离心5分钟。
4. 蛋白质定量
   1. 收集上清液作为总蛋白质裂解液。
   2. 进行BCA检测以确定蛋白质浓度。
   3. 在RIPA溶解液中稀释后，制备0、0.025、0.125、0.25、0.5、0.75和1 mg/mL的BSA标准。
   4. 在96孔微板中，将每个标准样品或未知样品各20微升装入单个孔中。
   5. 每孔加入200微升BCA工作试剂（由50份试剂A与1份试剂B混合制备）。
   6. 将反应板在37°C下孵育30分钟。
   7. 冷却至RT（18°C–23°C）后，使用微板读器（端点模式，25°C）测量562 nm处的吸收率，并自动校正路径长度至1厘米。
5. SDS-页面
   1. 将15微克蛋白质与SDS-PAG加载缓冲液混合。
   2. 将样品加热到95°C，加热5分钟。
   3. 把样品冰冷。
   4. 将样本装入10%SDS-PAGE凝胶中。
   5. 通过电泳在运行缓冲液中分离蛋白（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS）。
   6. 将凝胶以恒定的100伏运行，直到溴酚蓝色染料前端到达凝胶底部。
6. 蛋白质转移与阻断
   1. 将蛋白质转移到硝化纤维素膜或PVDF膜上。
   2. 对于硝化纤维素膜，将膜置于转移缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，20%甲醇，pH 8.3）中平衡10分钟。
   3. 对于PVDF膜，先将膜浸入100%甲醇中活化30秒，然后在转移缓冲液中平衡10分钟。
   4. 将转印夹层按以下顺序组装：海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸、海绵。
   5. 在4°C下，以恒流200毫安进行蛋白质转移，持续90分钟。
   6. 制备3%（含水/反量）BSA，TBST（20 mM Tris-HCl，pH 7.4;150 mM NaCl;0.1% Tween-20）。
   7. 在RT时用持续摇晃的方式阻断膜1小时。
      注意：检测磷酸化蛋白时，请使用BSA代替脱脂牛奶。
7. 初级抗体培养
   1. 在阻断缓冲液中以1：1,000稀释率制备初级抗体溶液。
   2. 将膜与原抗一起在4°C下培养一夜，并持续摇晃。
8. 洗涤
   1. 用TBST清洗膜。
   2. 重复洗三次，每次10分钟。
9. 二级抗体培养
   1. 在阻断缓冲液中以1：10,000稀释制备HRP结合的二级抗体。
   2. 将细胞膜在RT下潜伏1小时，同时持续摇晃。
10. 洗涤
    1. 用TBST清洗膜。
    2. 重复洗三次，每次10分钟。
11. 化学发光探测
    1. 通过混合等量的鲁米醇/增强剂和稳定过氧化物溶液，制备化学发光基底。
    2. 将底物以0.1 mL/cm、^膜面积2 的体积施加，并在轨道振台上RT（100 rpm）中孵育2分钟。
    3. 使用化学发光成像仪捕捉信号。
    4. 测试曝光时间范围为10到300秒，并为每次墨迹选择线性检测范围内的曝光。
    5. 通过使用仪器内置软件确认没有像素饱和，验证信号线性性。
12. 图像分析
    1. 使用ImageJ软件（NIH版本1.51）分析能带强度。
    2. 将图像转换为8位灰度，并应用半径为50像素的滚动球背景减法。
    3. 用相同尺寸的矩形感兴趣区域定义每个带，并从相邻空白区减去局部背景，得到原始积分密度值。
13. 全蛋白染色
    1. 将膜浸入0.1%印度墨水溶液中，浸于TBST下，RT下孵育1小时，持续摇晃。
    2. 用TBST清洗膜三次，每次10分钟。
    3. 量化多个染色带作为负荷控制，以规范免疫印迹信号。
       注意：使用全蛋白染色代替家养基因（HKGs），因为HKG的表达在不同实验条件下可能有所变化¹⁹。

7. 方法的敏感性和可重复性

1. 糖原标准的制备
   1. 在1 M NaOH中制备20 mg/mL的糖原浓缩液。
   2. 在15 mL离心管中，用1 M NaOH逐步稀释，制备一系列糖原标准物（0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.2、0.5和1 mg/mL），如下所述。
      1. 通过将500微升糖原存液与9.5毫升1 M NaOH混合，制备管1（1 mg/mL）。
      2. 将250微升糖原浓缩液与9.75毫升1 M NaOH混合，制备管2（0.5 mg/mL）。
      3. 将100微升的糖原浓缩液与9.9毫升1 M NaOH混合，制备管3（0.2 mg/mL）。
      4. 通过将50微升糖原存液与9.95毫升1M氢钠溶液混合，制备第4管（0.1 mg/mL）。
      5. 通过将25微升糖原浓缩液与9.975毫升1 M NaOH混合，制备第5管（0.05 mg/mL）。
      6. 将10微升糖原浓缩液与9.99毫升1M氢钠混合，制备第6管（0.02 mg/mL）。
      7. 通过将100微升管1溶液与9.9毫升1米氢钠溶混合，制备管7号管（0.01 mg/mL）。
      8. 将50微升管1溶液与9.95毫升1米NaOH混合，制备管8（0.005 mg/mL）。
      9. 将10毫升1百万氧化钠加入15毫升离心管中制备空白液（0 mg/mL）。
   3. 将每个管子和涡旋封在2500转/分钟，保持10秒混合。
2. 蒽比色测定法
   1. 提取糖原，并按照步骤4.1.4–4.12.6进行蒽酮比色分析。
   2. 在620纳米处记录了吸收读数（A₆₂₀）。
3. 糖原浓度的计算
   1. 生成血糖标准曲线，并按照步骤5.1计算每个标准样本（C_标准）中的葡萄糖浓度。
   2. 用以下公式计算每个标准管中的糖原浓度：
      
   3. 定义C_标准 为每个标准样品中确定的葡萄糖浓度（mg/mL）。
   4. 定义0.8为糖原样品的体积（mL）。
   5. 定义0.9为将葡萄糖价值转换为糖原值的因子。
   6. 将2.5定义为稀释因子。
   7. 定义10为第4.3.3步中总10毫升混合物中分析的1毫升分量的稀释因子。
   8. 定义1/3为修正因子，考虑步骤4.3.1中碱性消化中使用的3毫升分量。
   9. 在同一天内重复完整程序三次，总共四次。
   10. 在四天内重复四次，总共16次。
4. LOD和LOQ的计算
   1. 将Y轴上的16个吸收读数与x轴每个糖原标准浓度对比。
   2. 计算线性回归曲线和R^²。^R2 为≥0.995的线性回归被认为是可接受的。
   3. 使用以下公式计算LOD和LOQ：
      
      
   4. 定义σ为响应的标准误（y截距）。
   5. 定义S为线性回归曲线的斜率。
5. 分析内和间检测 CV% 的计算
   1. 对于每个糖原标准，使用以下公式计算第1天四次运行中计算值的检测内CV%：
      
   2. 定义s₁ 为第一天四次运行值的标准差。
   3. 定义 为第一天四次跑动的平均值。
   4. 重复计算第2天、第3天和第4天，以获得CV₂、CV₃和_{CV 4}。
   5. 使用以下公式计算最终测定内CV%：
      
   6. 使用以下公式计算测定间CV%：
      
   7. 定义 s_inter 为 CV₁、CV₂、CV₃ 和 CV₄ 的标准差。
   8. 定义 为CV₁、_{CV 2}、_{CV 3}和_{CV 4}的平均值。

结果

不同营养状态下的肝和骨骼肌糖原水平

夜间禁食显著降低了自 愿喂食大鼠的血糖水平（平均误差±平均值[SEM]标准误差）从7.9 ±0.4毫毫米降至5.4 ± 0.3毫米。重新喂食2小时后，血糖水平恢复至8.3 ± 0.1毫毫米（见图3D）。与这些变化一致，肝糖原水平（SEM平均±值）在喂养条件下±3.85 mg/g组织为45.05，夜间禁食后显著下降至0.63±0.13 mg/g组织，2小时再喂食后±0.73 mg/g组织的肝糖原水平为13.29（见图3E）。腓肠肌骨骼肌也观察到类似趋势。喂食时0.38 mg/g组织中糖原含量为2.33±空腹后0.22 mg/g组织±下降至1.08，再喂食后±0.42 mg/g组织中糖原含量为3.05（见图3F）。 表2提供了用于糖原定量的代表性吸光度值及对应组织重量。数据以SEM平均±表...

讨论

本文介绍了一种改良的蒽酮比色法，用于在动物组织中定量糖原。除了传统的组织采集、碱性消化、糖原沉淀、酒精清洗和基于蒽的色显色等连续步骤外，我们还加入了去蛋白步骤以减少背景干扰（见图1）。随后，我们应用该方法评估肝脏和腓肠肌在不同生理条件下糖原含量的变化，证明其能够检测糖原代谢中生理相关的变化。对参与糖原代谢的关键酶（包括糖原合成酶和糖原磷酸化酶）进行的正交西方印迹分析进一步支持了观察到的糖原水平变化，并确认了该方法的适用性。

使用该方法测量的组织糖原含量属于文献中先前报道的范围。在随意进食条件下，肝脏的糖原水平通常在湿重33–80 mg/g和骨骼肌湿重1–8 mg/g之间;而在禁食条件下，这些值分别降至0.6–3.3 mg/g和0.8–4.4 mg/g，分别为10,11,13,14,20,21,22

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微离心管	LABGIC	BS-15-M	用于样品处理和反应设置
15 mL 微离心管	LABGIC	BS-150-M-S	用于裂解物处理和沉淀步骤
20X TBST	Solarbio 生命科学	T1082	蛋白质印迹膜洗涤缓冲液
37 oC 孵化器	上海精宏仪器	HWS-150	BCA 检测板孵化
50 mL 离心管	LABGIC	CT-112-50A	用于组织消化和提取
96孔板	LABGIC	BS-MP-96W-CL	基于板的吸光度测量
分析天平	常州兴云	FA2204N	称量化学粉末
蒽酮	上海阿拉丁生物科技	A108571	糖原比色检测试剂
抗 GYS1 抗体	Proteintech	10566-1-AP	糖原合成酶 1 的检测
抗 GYS2 抗体	Proteintech	22371-1-AP	糖原合成酶 2 的检测
抗磷酸化 GYS1/2 (Ser641) 抗体	Cell Signaling Technology	47043S	磷酸化 GYS 的检测
抗磷酸化 PYGL (Ser15) 抗体	Abcam	ab227043	磷酸化糖原磷酸化酶的检测
抗 PYGL 抗体	Proteintech	15851-1-AP	肝脏糖原磷酸化酶的检测
抗 PYGM 抗体	Novus Biologicals	NBP2-16689	肌肉糖原磷酸化酶的检测
BCA 检测试剂盒	Beyotime	P0012	蛋白质定量
苯甲酸	上海阿拉丁生物科技	B116255	制备标准物质的饱和溶液
钝头镊子	上海金众	J42010	夹爪; 组织解剖
BSA Fraction V	Beyotime	ST023	蛋白质印迹中的阻断剂
化学发光成像仪	Tanon	Tanon 5200 Multi	蛋白质印迹信号检测
化学发光底物 (ECL)	Beyotime	P0018S	蛋白质印迹信号开发
蒸馏水	Beyotime	ST872	试剂制备的溶剂
盐酸肾上腺素	Sigma-Aldrich	E4642	体内糖原分解的诱导
乙醇	Macklin	E809065	糖原沉淀和洗涤
精细手术剪刀	上海金众	JA2601	组织解剖
Fresco 17 离心机	Thermo Fisher Scientific	75002402	样品离心
血糖仪	i-SENS	CareSens N	血糖测量
血糖仪	i-SENS	CareSens N	测量尾静脉血糖水平
血糖仪试纸	i-SENS	CareSens N Strips	测量尾静脉血糖水平
葡萄糖	Macklin	G6172	标准曲线的制备
糖原储备	Beyotime	D0812	准备一系列糖原标准物
山羊抗兔 IgG 二抗	Thermo Fisher Scientific	31462	初级抗体的检测
手持式均质器	GreenPrima	PB100	组织均质
印度墨水	Sigma-Aldrich	198285	用于蛋白质总量染色以进行标准化
异氟醚	RWD 生命科学	R510-22-10	动物安乐死
实验室加热块	常州国旺	GWJ300-1	实验过程中样品加热
氯化锂	Macklin	767397	增强糖原沉淀
甲醇	上海阿拉丁生物科技	M116115	糖原洗涤步骤
微板读数仪	BioTek	ELx800	测量 620 nm 处的吸光度
硝酸纤维素膜	Millipore	HATF04700	蛋白质转移膜
轨道摇床	DLAB SCIENTIFIC CO.,LTD	SK-O180-S	化学发光底物孵化
P1000 移液器	Thermo Fisher Scientific	4641100N	转移溶液
P200 移液器	Thermo Fisher Scientific	4641080N	残余液体的移除
磷酸酶抑制剂 (PhosSTOP)	Roche	4906845001	蛋白质磷酸化的保护
塑料容器 (用于组织储存)	Thermo Fisher Scientific	6A0008	储存采集的组织
蛋白酶抑制剂鸡尾酒	MCE	HY-K0011	防止蛋白质降解
RIPA 裂解缓冲液	Beyotime	P0013B	蛋白质提取
SDS-PAGE 凝胶试剂盒	Beyotime	P0012A	蛋白质分离
SDS-PAGE 上样缓冲液 (6X)	Beyotime	P0015F	与蛋白质样品混合后加载到 SDS-PAGE 凝胶井中
SDS-PAGE 运行缓冲液 (5x)	Beyotime