蒽酮比色法测定大鼠肝脏和骨骼肌中的糖原含量

摘要

本方案描述了一种蒽酮比色法，用于定量不同代谢状态下大鼠肝脏和骨骼肌中的糖原含量。

摘要

糖原是肝脏和骨骼肌中主要的细胞内葡萄糖储备物质，在碳水化合物代谢中发挥着基础性作用。肝糖原对维持全身血糖稳态至关重要，而骨骼肌糖原则支持体力活动和运动表现。因此，在糖原代谢发生动态调节或病理性改变的研究中，准确测定组织糖原含量尤为关键。本文介绍一种可靠且灵敏的蒽酮比色法，用于定量大鼠肝脏和骨骼肌中的糖原含量。该方案包括一系列步骤：碱性消化、去蛋白、糖原沉淀、酒精洗涤，以及使用蒽酮试剂显色。本方法的应用性在经历三种生理相关状态的大鼠中得到验证： 随意摄取 进食、过夜禁食以及短期再喂养。这些实验范式可捕捉与糖原储存、耗竭及再合成相关的关键代谢状态。通过蛋白质印迹法对关键酶——糖原合酶和糖原磷酸化酶——进行正交分析，为所观察到的代谢变化提供机制支持。该方法的适用性进一步在经肾上腺素处理以模拟急性应激诱导糖原分解的动物中得到验证。总体而言，该方法具有较宽的动态范围和足够的灵敏度，可用于定量显著不同生理状态下组织中的糖原含量。该方法为体内糖原代谢研究提供了可靠的工具，亦可应用于体外细胞培养模型。

引言

糖原是一种高度分支的多糖，在哺乳动物的骨骼肌和肝脏中作为主要的能量储存物质，其次也存在于脑、肾、心脏和脂肪组织等其他器官中¹在摄食过程中，多余的葡萄糖会进行聚合 从头合成 脂质生成，并以糖原或脂质的形式储存。然而，在禁食或体力活动期间，糖原会经历酶促降解，以持续快速地提供葡萄糖，满足能量需求。这种糖原的缓冲能力对于维持生理状态下的禁食–再进食周期中的血糖稳态至关重要。².

糖原合成由糖原合成酶（glycogen synthase, GYS）催化，该酶在哺乳动物中存在两种同工型：GYS1 和 GYS2。GYS1 主要在骨骼肌中表达，而 GYS2 是肝脏同工型。在禁食条件下，GYS 在多个位点（包括 Ser641）发生磷酸化，导致其催化活性受到抑制；而在进食条件下，去磷酸化可激活其活性。糖原分解由糖原磷酸化酶催化，其肝脏同工型为 PYGL，肌肉同工型为 PYGM。与 GYS 不同，PYGL 和 PYGM 的催化活性在禁食期间因 Ser15 位点的磷酸化而被激活，在进食后去磷酸化则导致其活性被抑制³。

糖原代谢的正常调控对多种生物学过程至关重要，而糖原代谢失调已被确认为多种疾病的致病因素。具体而言，肝脏糖原代谢的异常与多种代谢性疾病相关，包括糖原贮积病

方案

所有动物实验方案均经南京医科大学 Institutional Animal Care and Use Committee（IACUC；#1905019）批准。

1. 试剂的准备

1. 本研究中使用的所有试剂请参见材料表。
2. 实验开始前准备好所有溶液。
3. 根据需要调整溶液的体积。
4. 配制 1 M 氢氧化钠（NaOH）溶液
   1. 称取 40 g NaOH 颗粒。
   2. 将 NaOH 颗粒加入 800 mL 蒸馏水中。
   3. 用玻璃棒搅拌溶液，直至容器底部无未溶解颗粒。
   4. 将溶液转移至 1 L 容量瓶中。
   5. 用蒸馏水定容至 1 L。
   6. 将溶液储存于密闭瓶中，室温（RT；18°C–23°C）保存。
      ​警告：NaOH 具有腐蚀性。需佩戴安全护目镜、手套和实验服。市售 NaOH 颗粒纯度并非 100%，且易吸水。应避免颗粒长时间暴露于空气中。
5. 配制 20% 氯化锂（LiCl）储备液
   1. 称取 20 g 无水 LiCl 粉末。
   2. 将 LiCl 粉末加入 80 mL 蒸馏水中。
   3. 搅拌溶液，直至容器底部无未溶解颗粒。
   ....

结果

不同营养状态下肝脏和骨骼肌糖原水平

过夜禁食显著降低了血糖水平（均值 ± 均值标准误 [SEM]），从 7.9 ± 0.4 mM 降至 随意摄取喂食大鼠后，血糖水平降至5.4 ± 0.3 mM。重新喂食2小时后，血糖水平恢复至8.3 ± 0.1 mM。图3D）。与这些变化一致，肝脏糖原水平（均值 ± 标准误）在进食状态下为 45.05 ± 3.85 mg/g 组织，经夜间禁食后显著下降至 0.63 ± 0.13 mg/g 组织，再进食 2 小时后回升至 13.29 ± 0.73 mg/g 组织（图3E)。在腓肠肌骨骼肌中也观察到类似趋势。进食状态下糖原含量为 2.33 ± 0.38 mg/g 组织，禁食后下降至 1.08 ± 0.22 mg/g 组织，再喂养后上升至 3.05 ± 0.42 mg/g 组织（图3F）。用于糖原定量的代表性吸光度值及相应组织.......

讨论

本文介绍了一种改良的蒽酮比色法，用于定量动物组织中的糖原含量。该方法在传统的组织采集、碱性消化、糖原沉淀、酒精洗涤及基于蒽酮的显色反应等步骤基础上，增加了一个去蛋白步骤，以减少背景干扰（图1）。我们将该方法应用于不同生理条件下肝脏和腓肠肌中糖原含量变化的检测，验证了其检测糖原代谢中生理相关性变化的能力。通过对糖原合酶和糖原磷酸化酶等糖原代谢关键酶进行正交的蛋白质印迹分析，进一步支持了所观察到的糖原水平变化，证实了该方法的适用性。

采用本方法测得的组织糖原含量处于文献 previously 报道的范围内。在 随意摄取 在进食条件下，肝脏中的糖原水平通常为33–80 mg/g湿重，骨骼肌中为1–8 mg/g湿重；而在禁食条件下， respective值分别下降至0.6–3.3 mg/g和0.8–4.4 mg/g湿重^10,11,13

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微量离心管	LABGIC	BS-15-M	用于样品处理和反应体系构建
15 mL 微量离心管	LABGIC	BS-150-M-S	用于裂解液操作和沉淀步骤
20X TBST	Solarbio Life Sciences	T1082	Western blot 膜洗涤用缓冲液
37 oC 培养箱	上海精宏仪器	HWS-150	BCA 检测板孵育
50 mL 离心管	LABGIC	CT-112-50A	用于组织消化和提取
96 孔板	LABGIC	BS-MP-96W-CL	基于孔板的吸光度测定
分析天平	常州星云	FA2204N	称量化学粉末
蒽酮	上海阿拉丁生化科技	A108571	糖原比色检测用试剂
抗 GYS1 抗体	Proteintech	10566-1-AP	检测糖原合成酶 1
抗 GYS2 抗体	Proteintech	22371-1-AP	检测糖原合成酶 2
抗磷酸化 GYS1/2 (Ser641) 抗体	Cell Signaling Technology	47043S	检测磷酸化的 GYS
抗磷酸化 PYGL (Ser15) 抗体	Abcam	ab227043	检测磷酸化的糖原磷酸化酶
抗 PYGL 抗体	Proteintech	15851-1-AP	检测肝型糖原磷酸化酶
抗 PYGM 抗体	Novus Biologicals	NBP2-16689	检测肌型糖原磷酸化酶
BCA 检测试剂盒	碧云天	P0012	蛋白定量
苯甲酸	上海阿拉丁生化科技	B116255	制备标准品用饱和溶液
钝头镊子	上海金钟	J42010	脚趾夹捏；组织解剖
BSA 第五组分	碧云天	ST023	Western blot 封闭剂
化学发光成像仪	天能	Tanon 5200 Multi	Western blot 信号检测
化学发光底物（ECL）	碧云天	P0018S	Western blot 信号显色
蒸馏水	碧云天	ST872	试剂配制用溶剂
盐酸肾上腺素	Sigma-Aldrich	E4642	体内诱导糖原分解
乙醇	Macklin	E809065	糖原沉淀和洗涤
精细手术剪刀	上海金钟	JA2601	组织解剖
Fresco 17 离心机	赛默飞世尔科技	75002402	样品离心
血糖仪	i-SENS	CareSens N	血糖测量
血糖仪	i-SENS	CareSens N	测量尾静脉血糖水平
血糖试纸	i-SENS	CareSens N Strips	测量尾静脉血糖水平
葡萄糖	Macklin	G6172	标准曲线制备
糖原储备液	碧云天	D0812	制备一系列糖原标准品
山羊抗兔 IgG 二抗	赛默飞世尔科技	31462	检测一抗
手持式匀浆器	GreenPrima	PB100	组织匀浆
印度墨水	Sigma-Aldrich	198285	总蛋白染色用于归一化
异氟烷	RWD 生命科学	R510-22-10	动物安乐死
实验室加热金属块	常州国旺	GWJ300-1	检测过程中的样品加热
氯化锂	Macklin	767397	增强糖原沉淀
甲醇	上海阿拉丁生化科技	M116115	糖原洗涤步骤
酶标仪	BioTek	ELx800	测量 620 nm 处的吸光度
硝酸纤维素膜	Millipore	HATF04700	蛋白转印膜
旋转摇床	DLAB 科学有限公司	SK-O180-S	化学发光底物孵育
P1000 移液器	赛默飞世尔科技	4641100N	溶液转移
P200 移液器	赛默飞世尔科技	4641080N	残留液体移除
磷酸酶抑制剂（PhosSTOP）	罗氏	4906845001	维持蛋白磷酸化状态
塑料容器（用于组织储存）	赛默飞世尔科技	6A0008	收获组织的储存
蛋白酶抑制剂混合液	MCE	HY-K0011	防止蛋白降解
RIPA 裂解缓冲液	碧云天	P0013B	蛋白提取
SDS-PAGE 凝胶试剂盒	碧云天	P0012A	蛋白分离
SDS-PAGE 上样缓冲液（6X）	碧云天	P0015F	与蛋白样品混合后上样至 SDS-PAGE 凝胶孔中
SDS-PAGE 电泳缓冲液（5X）	碧云天	P0014D	SDS-PAGE 电泳
小动物麻醉机	RWD 生命科学	R500	动物安乐死
氢氧化钠	Macklin	S817977	组织消化和糖原提取
SD 大鼠	查尔斯河实验室	Crl: CD(SD)	实验动物模型
喷雾瓶	碧云天	TB6310	喷洒 75% 乙醇润湿和消毒动物毛发
标准维持饲料	江苏协通	XTI01ZJ-009	啮齿类动物维持饮食
手术剪刀	上海金钟	J22010	组织解剖
带 25 号针头的无菌注射器	碧云天	FS801	腹腔注射和尾静脉穿刺
硫脲	上海阿拉丁生化科技	T112512	稳定蒽酮试剂
转膜缓冲液（10X）	Solarbio Life Sciences	D1060	蛋白转印至膜上
三氯乙酸	上海源叶生物科技	W11293	蛋白沉淀
容量瓶（100 mL, 1 L）	上海阿拉丁生化科技	V2853	精确体积溶液的配制
涡旋振荡器	DLAB 科学有限公司	8031102000	样品混匀
水浴锅	精宏	DK-S26	反应样品加热