用于研究小鼠转移性卵巢癌及治疗反应的临床相关可移植肿瘤模型

摘要

本文介绍了一种建立腹腔内和包膜内肿瘤模型的逐步实验方案，用于研究卵巢癌的进展、转移及治疗反应。此外，我们还描述了如何在这些模型中利用基于荧光素酶的非侵入性活体成像技术，在小鼠体内监测肿瘤的进展。

摘要

转移性卵巢癌是一种致死性极高的妇科恶性肿瘤，目前缺乏有效的治疗手段。开发可用于临床转化的卵巢癌治疗策略，依赖于对驱动卵巢癌转移因素的深入理解。尽管大多数实体瘤主要通过血行转移，但卵巢癌细胞主要经腹膜腔途径扩散。该过程包括癌细胞从原发肿瘤脱落并释放到腹膜腔内，随后获得抵抗失巢凋亡的能力，并形成多细胞聚集体。这些细胞聚集体继而附着并侵入腹膜的间皮层，形成转移病灶。临床上相关的体内模型对于研究细胞因子和肿瘤微环境如何影响转移过程中的各个步骤，以及评估新型治疗策略至关重要。目前广泛用于研究卵巢癌转移及治疗反应的两种可移植性小鼠肿瘤模型是腹膜内模型和囊内模型。本文中，我们详细描述了建立这两种模型的逐步操作方法，并阐述其优势与局限性。此外，我们还介绍了如何利用生物发光成像技术，通过这些模型无创地监测肿瘤的进展过程。

引言

尽管在了解驱动卵巢癌进展的因素方面已取得显著进展，但卵巢癌在美国仍然是第二大致命的妇科恶性肿瘤¹。由于缺乏明显的症状以及可靠的早期诊断标志物，超过70%的卵巢癌患者在确诊时已处于晚期转移性疾病阶段^2,3。目前的治疗方法对转移性卵巢癌疗效有限，因此，晚期疾病患者的5年生存率仍低于30%⁴。治疗失败的一个主要原因是化疗耐药性的出现⁵。因此，迫切需要识别驱动卵巢癌转移和化疗耐药的因素。填补这一知识空白对于开发更有效的治疗策略以应对该疾病至关重要。为实现这些目标，我们需要能够准确模拟卵巢癌进展关键步骤的体内模型。

尽管卵巢癌细胞系和三维体外模型极大地促进了我们对影响转移和治疗反应因素的理解，但这些模型存在若干局限性^6,7,8。例如，这些模型未考虑肿瘤微环境中存在的多种非癌细胞，也无法再现肿瘤微环境中发生的复杂相互作用^6,7,8。此外，利用体外模型研究系统性因素及其对肿瘤进展和药物反应的影响极具挑战性^6,7,8。这些体外模型的局限性凸显了建立能够准确模拟卵巢癌转移各个步骤的体内模型的必要性，包括与微环境中其他细胞类型及因子的复杂相互作用。

基因工程小鼠模型（GEMMs）提供了一种体内平台，可在具有完整免疫系统的自然微环境中使肿瘤自发产生⁹。然而，GEMMs 的构建和维持耗时长、技术难度高且成本昂贵¹⁰。大多数卵巢癌 GEMMs 还具有较长的肿瘤发生潜伏期，这使得即使在模型构建完成后，其实验操作依然耗时且成本高昂¹⁰。可移植模型（如异种移植和同种移植模型）在生物学相关性与实验操作便利性之间提供了良好平衡，且其构建成本通常远低于 GEMMs¹¹。此外，相较于 GEMMs，这些模型具有更短的潜伏期，且肿瘤细胞可在体外方便地进行遗传修饰，使其成为研究不同遗传因素如何影响肿瘤进展的便捷而适用的工具¹⁰。由于上述优势，可移植肿瘤模型已成为卵巢癌基础与转化研究中的重要工具。

在本报告中，我们描述了建立两种广泛用于研究转移性卵巢癌的可移植小鼠肿瘤模型的实验方案：（1）腹腔内模型和（2）原位或囊内模型。这两种模型均可构建为异种移植或同种移植模型。在腹腔内模型中，将癌细胞注射至小鼠的腹腔内。将卵巢癌细胞引入腹腔腔隙可模拟卵巢癌转移过程中的一个阶段，即转移性卵巢癌细胞从原发肿瘤脱落并进入腹腔。类似于人类的转移过程，这些移植的卵巢癌细胞需要适应恶劣的腹腔微环境，附着并侵入覆盖腹腔的间皮层，并在腹腔内器官和组织（如大网膜、肠系膜、肝脏和膈肌）上形成转移病灶。根据用于构建腹腔内模型的癌细胞系不同，转移性肿瘤可能伴随腹水产生，这与人类晚期疾病中的表现相似。因此，腹腔内模型已被广泛用于研究驱动卵巢癌转移及其进展至晚期疾病的相关因素¹²。这些模型也有助于评估针对转移性卵巢癌的新治疗策略的有效性¹²。在囊内或原位模型中，癌细胞被植入包绕小鼠卵巢的膜状结构——卵巢囊中。该模型可模拟卵巢肿瘤发生和转移的早期阶段。在此阶段，癌细胞仍局限于输卵管和卵巢。癌细胞从这些部位脱落进入腹腔，最终转移至其他器官。因此，囊内模型适用于研究卵巢肿瘤发生的早期阶段以及随后通过腹腔进行跨体腔转移的相关事件¹²。

因此，尽管腹腔内注射模型和卵巢囊内注射模型均为研究卵巢癌转移及治疗反应的优良工具，但二者所模拟的转移过程的具体阶段有所不同。由于卵巢囊内模型能够模拟卵巢癌从转移过程的早期到晚期的进展，但该过程存在潜伏期，因此通常用于研究卵巢癌转移的早期事件。而对于聚焦于卵巢癌转移晚期阶段的研究，腹腔内注射模型则更为合适。此外，与腹腔内注射模型相比，卵巢囊内注射模型在技术上建立起来也更具挑战性¹²。建立卵巢囊内模型需要进入配备显微外科设备的手术室，以便将癌细胞精确地注射至卵巢囊内。此外，与腹腔内模型相比，卵巢囊内模型中癌细胞形成肿瘤的能力（即“成瘤率”或“移植成功率”）通常也较低。而且，由于在原位或腹腔内注射后难以直接观察肿瘤，通常需采用非侵入性的生物发光成像技术来监测肿瘤进展。因此，无论是腹腔内模型还是卵巢囊内模型，均需要配备能够实现肿瘤非侵入性成像的额外设备¹²。最终，实验目标、资源可及性以及技术能力将决定每项研究中所采用的模型类型。

本报告详细描述了使用人卵巢癌细胞系建立腹腔内和包膜内小鼠异种移植模型的逐步实验方案。这些模型可通过将细胞移植到免疫缺陷小鼠品系（如NSG（NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ）或Foxn1裸鼠（B6.Cg-Foxn1 nu/J））中来建立。该方法也可经调整用于构建同种移植（同源性）模型。在建立同种移植模型时，将小鼠卵巢癌细胞植入具有相同遗传背景的免疫健全小鼠体内。由于同种移植模型使用免疫健全小鼠，因此可用于研究不同因素如何调控卵巢肿瘤微环境、免疫系统在卵巢癌进展中的作用以及免疫治疗的效果。除了介绍腹腔内和包膜内异种移植小鼠模型的建立方法外，本报告还描述了如何利用生物发光成像技术对这些模型中的肿瘤进展进行无创监测。

方案

本方案中描述的所有动物实验程序均已获得马里兰大学巴尔的摩县分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（主要研究者 - Achuth Padmanabhan；方案编号 - 1947）。 本方案所用材料与设备的完整清单及其目录编号见材料表。

1. 准备用于小鼠移植的卵巢癌细胞系

注意：对于本方案中描述的所有体内模型，应准备卵巢癌细胞以移植到小鼠体内。除非另有说明，卵巢癌细胞应在室温下的层流组织培养罩中按以下方法进行准备：

1. 按照文献推荐的标准培养基，在37 ^oC、5% CO₂条件下，使用水套式CO₂培养箱培养卵巢癌细胞。若需进行肿瘤的非侵入性活体成像，移植前须对卵巢癌细胞进行基因改造，使其稳定表达荧光素酶。
2. 当细胞融合度达到约80%–85%时，在无菌条件下收获细胞，具体步骤如下：
   1. 从组织培养板中吸除培养基。
   2. 用无钙镁的无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞两次。PBS中若含有钙和镁会干扰胰蛋白酶活性，并促进细胞黏附。洗涤后吸除组织培养板中的PBS。
   3. 向组织培养板中加入0.05%胰蛋白酶-EDTA。所用胰蛋白酶的体积取决于组织培养板的大小及所用细胞系。对于在100 mm培养板上生长的大多数细胞系，使用1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA；对于黏附性较强的卵巢癌细胞系（如OVCA420），建议使用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。
   4. 将加有胰蛋白酶的培养板放回37 ^oC水套式CO₂培养箱中，孵育1–5分钟。确切的孵育时间取决于细胞系。某些细胞系（如TYK-Nu和HEYA8）脱落较快（1–2分钟），而其他细胞系（如OVCA420）则需要较长时间（4–5分钟）。
   5. 细胞脱落后，加入含胎牛血清（FBS）的培养基以终止胰蛋白酶作用。每1 mL胰蛋白酶溶液加入6 mL含FBS的培养基。轻轻吹打数次，使细胞从培养板上完全脱离，并形成单细胞悬液。
      注：在明场倒置显微镜下观察，脱落的细胞呈圆形（而非扁平或伸长状），并在培养基中自由漂浮，不再贴附于培养板底部。
   6. 将细胞收集至锥形管中，在室温下以400 × g离心5分钟。
   7. 弃去含胰蛋白酶的上清液，将细胞沉淀重悬于新鲜的含FBS细胞培养基中。
3. 使用台盼蓝等细胞活力染料结合血细胞计数板对细胞进行计数。也可使用自动细胞计数仪进行细胞计数。
4. 将细胞重悬于一定体积的无菌1× PBS（pH 7.4）中，以达到所需单位体积的细胞浓度。常用人卵巢癌细胞系推荐注射细胞数量见表1¹³。
   注：小鼠可安全注射的最大体积取决于模型类型。腹腔注射模型推荐最大体积为500 µL（见第2.1节）；包膜内注射模型推荐最大体积为5 µL（见第2.2节）。
5. 细胞悬液在注射前应置于冰上保存。细胞制备后应尽快注射，最好在30–45分钟内完成。

2. 在小鼠中建立可移植性卵巢癌模型

1. 建立卵巢癌的腹腔内模型
   注意：在此过程中，将稳定表达荧光素酶的卵巢癌细胞注射到成年雌性小鼠的腹腔内。使用稳定表达荧光素酶的细胞，可利用活体成像系统（IVIS）对肿瘤进展进行纵向、无创的监测。
   1. 按照第1节所述方法准备细胞。使用1000 µL移液器轻轻重悬细胞，并确保细胞保持单细胞悬液状态。
      注意：若未充分解离细胞团块，会导致针头堵塞。
   2. 用1 mL注射器吸取500 µL细胞悬液，并安装21G × 1英寸针头。确保注射器内无气泡。
      注意：成年雌性小鼠（25–30 g）腹腔注射的最大容积为500 µL。因此，应将细胞重悬于适当体积中，使所需数量的细胞包含在不超过500 µL的体积内。常用人源卵巢癌细胞系推荐注射细胞数见表1¹³。
      注意：若小鼠体重在20–25 g之间，建议注射较小体积（小于400 µL）。
   3. 将动物从小鼠笼中取出，放置于粗糙或带网面的表面上以固定。
   4. 用非惯用手轻轻捏住小鼠颈部基部的松弛皮肤以固定小鼠，如图1A所示。
   5. 轻轻提起小鼠并将其翻转，使腹部朝上。用手指固定小鼠尾巴，如图1B所示。
   6. 在腹部中线处假想一条横线。为确定注射部位，在右下象限的中线与两个乳头之间假想一个三角形。确保注射部位位于该假想三角形的中心。参见图1B。
   7. 将小鼠头部略微倾斜朝向地面，使其低于后肢端。以该姿势固定小鼠有助于腹腔内容物向头侧移动，从而降低注射过程中刺穿内脏器官的风险。
   8. 使用无菌酒精棉片清洁注射区域。
   9. 用惯用手以45°或更低角度将针头插入注射部位，推进深度不超过0.5英寸，且不超过针头长度的一半。确保针头保持稳定，因腹腔内移动可能造成内脏损伤。
   10. 以缓慢而稳定的速度将细胞注入小鼠腹腔内。
   11. 以与插入相同的角度将针头拔出。立即在注射部位覆盖无菌纱布，防止液体渗漏。
   12. 将针头和注射器丢弃至适当的锐器容器中。
   13. 在将小鼠放回笼子前，使用首选方法进行耳标标记。耳标标记可便于后续识别已注射的小鼠。
2. 建立卵巢癌的卵巢囊内模型
   注意：在卵巢囊内模型中，将稳定表达荧光素酶的卵巢癌细胞直接注射到成年雌性小鼠的卵巢囊内。囊（bursa）是包裹小鼠卵巢的膜性结构。卵巢癌细胞中稳定的荧光素酶表达可允许通过IVIS对肿瘤进展进行无创的纵向监测。
   1. 第1天——准备卵巢囊内移植手术所需的器械和小鼠
      1. 对所需手术器械进行高压灭菌。所需器械清单如下（图2A）：
         精细剪刀、5英寸弯头精细镊子、Mayo-Heger持针器、解剖珠宝工用精细镊子、精细尖端解剖镊
      2. 通过皮下注射给予小鼠术前镇痛药卡洛芬（carprofen，15 mg/kg），每24小时一次。
         注意：从术前1天开始，每24小时皮下注射一次卡洛芬镇痛药，持续至术后第3天。
   2. 第2天——在小鼠体内进行卵巢癌细胞的卵巢囊内移植
      1. 按照第I节所述方法准备用于注射的卵巢癌细胞。小鼠卵巢囊内可安全注射的最大体积为5 µL。因此，建议细胞浓度为10⁴ 个细胞/µL，以便移植5 × 10⁴ 个细胞。
         注意：常用人源卵巢癌细胞系推荐注射细胞数见表1¹³。
      2. 将细胞置于冰上直至使用。细胞收获后应尽快注射，最好在30–45分钟内完成。
      3. 将小鼠置于异氟烷麻醉舱中，异氟烷流速为4%，氧气流速为3.5 L/min，以诱导麻醉。通过检测小鼠是否不动以及脚趾夹捏反射是否消失来确认麻醉效果。
      4. 将麻醉后的小鼠转移至置于37 °C恒温加热垫上的无菌手术巾上。迅速连接鼻罩，以1.5%异氟烷和98.5%氧气维持麻醉。通过确认脚趾夹捏反射消失来确保小鼠处于麻醉状态。
      5. 在整个手术过程中，每15分钟检查一次脚趾夹捏反射，以确保小鼠持续处于麻醉状态。监测小鼠呼吸频率，确保其缓慢而平稳。若呼吸频率发生变化，应调整异氟烷剂量：若出现呼吸困难或喘息，应降低剂量；若呼吸频率加快，则轻微增加异氟烷剂量。
         注意：避免让小鼠麻醉时间超过40分钟。为此，手术过程中应高效且迅速操作。
      6. 将小鼠侧卧放置，使需进行卵巢囊内移植的一侧朝上，如图2B所示。
      7. 在小鼠双眼涂抹眼膏，防止角膜干燥。
      8. 若小鼠有毛发，剃除朝上一侧下半身的毛发。妥善清洁剃毛区域，并将小鼠置于新的无菌垫上。若使用Foxn1裸鼠（B6.Cg-Foxn1 nu/J）品系，则跳过此步骤。
      9. 使用无菌手术巾覆盖小鼠，仅暴露其下半身。
      10. 手术开始前用肥皂彻底洗手，并戴上一副新的无菌外科手套。戴上手套后避免接触任何非无菌区域或物品。
      11. 使用无菌棉签蘸取聚维酮碘液，从内向外顺时针方向对术区进行消毒。随后使用无菌酒精棉片以相同方式清洁同一区域。重复此过程两次。
          注意：手术过程中不得接触非无菌物品或区域。若手套接触非无菌表面，应立即更换。强烈建议在进行卵巢囊内注射时有另一人协助，此人可在手术期间处理非无菌物品。
      12. 等待1分钟，使酒精完全干燥。
      13. 根据图2B所示，定位小鼠后肢上方约1.5 cm、距肋骨约5 mm处。用弯头镊子提起该处皮肤，然后用精细剪刀做一长约5 mm的垂直切口。
          注意：在切开前，需通过确认脚趾夹捏反射消失来确保小鼠已完全麻醉。
      14. 用精细镊子夹住一侧皮肤，并在同一位置切开皮下组织。
      15. 此时，皮下组织下方的腹膜层将变得可见。使用精细弯头锯齿镊夹住腹膜层，并用精细剪刀做一长约2.5 mm的切口。
      16. 用锯齿镊夹住腹膜切口的一侧，用精细镊子定位卵巢脂肪垫。卵巢位于脂肪垫下方。
      17. 轻轻将卵巢连同部分脂肪垫经切口拉出。
      18. 使用解剖镊夹住脂肪垫，使卵巢朝上并保持固定。
          注意：切勿用镊子夹持卵巢。应始终使用锯齿镊夹持脂肪垫，因其组织较滑。
      19. 请助手准备好含有细胞悬液的注射器。建议使用0.3 mL胰岛素注射器。
      20. 将针头斜面朝上，从输卵管与卵巢交界处轻轻插入卵巢囊内。确保整个斜面完全进入囊内后再推动针栓。
          注意：注意不要在穿刺点对侧刺穿卵巢囊。
      21. 轻轻推动针栓，将注射器内容物注入卵巢囊内。迅速拔出针头。
      22. 卵巢周围囊的肿胀表明细胞接种成功。
      23. 等待5秒后，轻轻将卵巢复位至腹腔内。
      24. 使用6-0可吸收单股缝线，采用一至两针间断缝合法关闭腹膜。
      25. 使用6-0可吸收单股缝线，采用连续缝合法关闭皮肤切口。确保切口处无出血。
      26. 缝合后在切口处涂抹三重抗生素软膏（杆菌肽、新霉素和多粘菌素B）。
      27. 皮下注射卡洛芬（15 mg/kg）以缓解小鼠术后疼痛。
      28. 使用首选方法对小鼠进行耳标标记。耳标标记可便于后续识别已注射的小鼠。
      29. 将小鼠转移至新笼中。将笼子一半置于加热垫上至少60分钟。确保在此期间麻醉作用已完全消退，小鼠清醒且活跃。
          注意：小鼠在麻醉下易发生低体温，因此提供外部热源以调节体温至关重要。
      30. 术后4–5小时检查小鼠，观察切口处是否有出血或其他不适迹象。
      31. 术后连续3天，每天皮下注射卡洛芬15 mg/kg。
      32. 若接种的细胞经基因工程改造可稳定表达荧光素酶，则可从注射后第1天起，按第3节所述方法使用IVIS检测肿瘤负荷。

3. 使用活体成像系统（IVIS）对小鼠肿瘤进行非侵入性成像

在本报告所述的可移植性肿瘤模型的多项研究中，一个重要目标是获取肿瘤进展的纵向数据。虽然皮下肿瘤的体积可以通过游标卡尺进行估算，但该方法不适用于腹腔内和囊内模型所形成的肿瘤。为克服这一挑战并确定腹腔内肿瘤负荷，大多数实验室采用基于荧光素酶的非侵入性生物发光成像技术。为此，移植的癌细胞经过基因工程改造，能够稳定表达荧光素酶，当给予底物D-荧光素（D-luciferin）后即可产生生物发光信号。该信号可通过活体成像系统（IVIS）进行非侵入性检测，并通过定量分析用于追踪肿瘤负荷，揭示转移情况以及药物治疗效果。下文将描述在小鼠中利用基于荧光素酶的非侵入性生物发光成像技术（IVIS）追踪肿瘤负荷的实验方案。

1. D-luciferin 底物的制备
   1. 在无菌条件下，用 1× PBS（pH 7.4）配制 15 mg/mL 的 D-luciferin 溶液。
   2. 使用 0.22 µm 滤器对溶液进行过滤除菌。
   3. 用铝箔包裹溶液，避光保存直至使用。
2. 启动 IVIS 成像仪以进行图像采集
   1. 在连接 IVIS 成像仪的计算机上打开“Living Image”软件并登录。
   2. 需要初始化成像仪以进行图像采集，操作步骤如下：
      1. 登录后，IVIS 控制面板窗口将打开，如图 3A所示。
      2. 点击窗口右下角的"初始化"按钮（图 3A）。系统初始化需要几分钟时间。
         注意：初始化开始时，窗口底部的温度条会变为红色，表示成像相机正在冷却至目标温度 -90 °C（图 3B）。
      3. 当成像相机达到目标温度（-90 °C）时，温度条将变为绿色，系统状态将显示“就绪”（图 3C）。此时成像仪已准备好对小鼠进行成像。
         注意：曝光时间、binning 和 f/stop 可根据用户需求进行调整。
3. 为 IVIS 成像准备小鼠
   ​在对小鼠成像前，必须经腹腔注射 D-luciferin。
   1. 将小鼠从笼中取出，放置在粗糙或金属网状表面上。按照第 2.1 节所述方法，轻轻抓住小鼠颈背部皮肤以适当固定。
   2. 拿起小鼠并将其翻转，使其腹面朝上。
      注意：若小鼠被正确固定，拿起时其四肢会自然向外伸展，如图 1B所示。操作过程中可用手指夹住其尾巴，以提供额外的固定。
   3. 使用无菌酒精棉片清洁注射部位，操作参照第 2.1 节腹腔注射方案。
   4. 使用 1 mL TB 注射器和 30G、½ 英寸针头，从储备液中抽取适当体积的 D-luciferin，经腹腔注射，使最终剂量达到 150 mg/kg D-luciferin。
      注意：腹腔注射操作请参考第 2.1 节中的腹腔注射方案。若使用 C57BL/6 小鼠（用于同系异体移植模型）， 强烈建议 在使用 IVIS 进行生物发光成像前去除毛发。黑色毛发和色素沉着的皮肤会显著衰减光信号，降低信号强度。
   5. 将小鼠轻柔地放回笼中。确切的等待时间和曝光时间需通过实验确定，可按以下方法进行：
      1. 在注射 D-luciferin 后立即麻醉小鼠，并按照第 3.4 节所述方法，每 2 分钟成像一次，持续 20 分钟。
         注意：首次进行该实验时，建议确定荧光素酶信号在给予 D-luciferin 后随时间的变化情况。这有助于确定后续实验中成像的最佳时间点。生物发光信号可能受多种因素影响，包括细胞系、小鼠异种移植模型、荧光素酶表达水平等。
      2. 在每个时间点分别进行 5、10 和 15 秒的曝光。
      3. 利用这些数据绘制标准曲线。根据曲线选择信号达到平台期且强度最高的等待时间和曝光时间。
         注意：通常该时间为 5–10 分钟，但可能因模型不同而有所变化。
4. 使用 IVIS 对小鼠肿瘤进行无创成像
   1. 等待期结束后，将小鼠放入异氟烷麻醉室，设置异氟烷浓度为 4%，氧气流速为 3.5 L/min。
   2. 通过检查足趾夹捏反射是否消失，确认小鼠已充分麻醉。
   3. 将小鼠放置在 IVIS 成像仪内部的成像台上，并将其鼻部插入鼻罩中，以在成像期间维持麻醉状态。确保小鼠位于相机对焦标记线范围内，并关闭成像仪门。
      注意：成像仪内部的台面上有五个位置，每个位置均配有独立的麻醉鼻罩，可同时对五只小鼠进行成像。根据待成像小鼠的数量，在控制面板中将相机视野从“D”（广角）调整为“A”（窄焦）。只要在整个成像过程中保持小鼠鼻部位于鼻罩内，可将其放置在台面任意位置。建议先依次对小鼠背侧成像，再对其腹侧成像。
   4. 调整曝光时间，然后点击控制面板上的“Acquire”按钮（图 3C）。
      注意：确保控制面板中“发光”、“照片”和“叠加”选项均处于“开启”状态。
      图像采集完成后，屏幕上将显示带有荧光素酶信号的小鼠图像。
   5. 打开成像仪，翻转小鼠使其腹面朝上，关闭成像仪门后点击“Acquire”按钮。
      注意：确保小鼠鼻部始终位于鼻罩内，以维持成像期间的麻醉状态。
   6. 完成背侧和腹侧图像采集后，打开成像仪门，将小鼠放回笼中。
   7. 等待 5–10 分钟，确保小鼠恢复意识。
5. 分析 IVIS 图像以确定小鼠肿瘤负荷
   1. 图像颜色标尺的调整
      1. 点击“文件”，然后选择“另存为”，将原始图像保存至相应文件夹。
         注意：成像仪会根据信号强度自动调整颜色标尺。建议在整个实验过程中保持所有图像的颜色标尺一致。也可通过该软件打开原始图像后对颜色标尺进行后期调整。
      2. 如需手动调整，屏幕右上角将弹出工具调色板窗口（图 3D），进入“Image adjust”选项，选择“manual”模式。输入所需的颜色标尺最小值和最大值，然后点击“Enter”（图 3E）。
         注意：调整先前采集图像的颜色标尺时，应先通过“文件”→“打开”命令，从相应文件夹中打开已保存的原始 infoclick.txt 图像文件。
         3.5.1.3. 将调整后的图像另存至相应文件夹，与原始图像分开保存。
   2. 小鼠肿瘤负荷的分析
      注意：为定量测量肿瘤负荷，可测量整个实验周期内各时间点小鼠的信号强度。可将这些数值导入 Excel 或 GraphPad Prism 软件进行统计分析，并绘制肿瘤进展的折线图。
      1. 从相应文件夹中打开已保存的原始 infoclick.txt 文件。
      2. 进入屏幕右上角弹出的工具调色板窗口中的 ROI（感兴趣区域）部分（图 3F）。
      3. 使用“draw”功能，手动或自动在每只小鼠图像上绘制 ROI 区域，形状可根据需要选择。若手动绘制，应确保所有待比较小鼠在所有图像中的 ROI 区域大小保持一致。
         ​注意：对于腹腔接种模型，对小鼠腹面图像中整个胸腹部进行手动 ROI 选择效果最佳；对于囊内接种模型，对背侧图像中存在信号的区域进行手动 ROI 选择效果最佳。
         注意：自动 ROI 选择仅会选取图像中信号强度较高的区域。
      4. 点击“Measure ROI”（图 3F），将弹出一个新窗口，显示每个选定 ROI 的总信号值和平均信号值。
      5. 将该数据文件保存至相应文件夹以便后续调用。使用该数据在 MS Excel 或 GraphPad Prism 中绘制图表。

结果

使用表达荧光素酶的OVCAR8细胞在免疫缺陷型Foxn1裸鼠中建立的腹腔内卵巢癌模型的代表性数据如图所示 图4在这些细胞中稳定表达的荧光素酶使得能够通过IVIS成像仪进行非侵入性生物发光成像，从而对肿瘤进展进行长期监测，具体方法如第三节所述。将500万OVCAR8-荧光素酶细胞经腹腔注射至Foxn1裸鼠体内后，可在腹腔内形成转移性肿瘤，成瘤率达100%图4）。肿瘤进展迅速，导致肿瘤负荷显著增加并出现腹水（图 4A，B体内成像显示，在将500万OVCAR8-荧光素酶细胞经腹腔接种至Foxn1裸鼠后29天内，出现高肿瘤负荷（图4C）。为了探究腹腔内注射的卵巢癌细胞数量差异对小鼠肿瘤进展动力学和生存期的影响，我们比较了腹腔注射500万个OVCAR8-荧光素酶细胞的小鼠与腹腔注射100万个OVCAR8-荧光素酶细胞的小鼠在不同时间点的肿瘤负荷。与注射500万个OVCAR8-荧...

讨论

模拟肿瘤细胞、微环境与系统性因素之间复杂相互作用的能力，使得小鼠模型成为研究卵巢癌进展的宝贵资源¹²。除了加深我们对驱动卵巢癌进展和转移因素的理解之外，体内小鼠模型在转移性卵巢癌的小分子药物和治疗策略的临床前评估中也发挥着重要作用^12,15。鉴于这些优势，目前已开发出多种用于研究转移性卵巢癌的体内小鼠模型^12,15。了解每种模型的优势与局限性，对于确定何种模型适用于特定研究问题至关重要。

尽管基因工程小鼠模型（GEMMs）极大地促进了我们对驱动卵巢癌进展因素的理解，但其构建过程复杂且成本较高¹⁰。此外，这些模型中肿瘤发展存在潜伏期，导致实验耗时且资源消耗大¹⁰。由于这些原因，可移植性肿瘤模型在研究驱动卵巢癌进...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 注射器无菌滤器，33 mm	Fisher Scientific	09-720-004
1 ml TB 注射器	BD	309659
21G，1 英寸针头	BD	305167
30G，½ 英寸针头	BD	305106
5 英寸弯头精细镊子	Fisher Scientific	1631
6-0 可吸收单丝缝线	MaxonTM	6532-11
酒精棉片（70% 异丙醇）	Dukal Corp	80003156
聚维酮碘（1% 碘溶液）	Purdue Products	367618150085
卡洛芬注射液，50 mg/ml	Levafen	RXLEVA50-20INJ
离心机	Eppendorf	5702
D-荧光素	Syd Labs	MB000102-R70170
精细尖头珠宝镊（解剖用）	Fisher Scientific	08-953E
眼膏	Medvet	11897
精细剪刀	Fisher Scientific	8940
加热垫	Sunbeam	731-500
精细尖头解剖镊	Fisher Scientific	S08096
胰岛素注射器 3/10 ml	BD	328438
异氟烷	Fluriso	Fluriso250
IVIS 成像系统	Perkin Elmer	IVISLMIII
梅奥-黑格直型持针器	Fisher Scientific	08-966
无钙镁的无菌 1× PBS	Corning	21-040-CV
无菌棉签	Mckeesson	24-106-1S
无菌纱布	Kendall	3033
无菌垫/毛巾/手术单，无孔	Henry-Schein	100-9687
三重抗生素软膏	Globe	4006-4SL
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco	25200-056