用于研究小鼠转移性卵巢癌及治疗反应的临床相关可移植肿瘤模型

摘要

本文介绍了一种建立腹腔内和包膜内肿瘤模型的逐步实验方案，用于研究卵巢癌的进展、转移及治疗反应。此外，我们还描述了如何在这些模型中利用基于荧光素酶的非侵入性活体成像技术，在小鼠体内监测肿瘤的进展。

摘要

转移性卵巢癌是一种致死性极高的妇科恶性肿瘤，目前缺乏有效的治疗手段。开发可用于临床转化的卵巢癌治疗策略，依赖于对驱动卵巢癌转移因素的深入理解。尽管大多数实体瘤主要通过血行转移，但卵巢癌细胞主要经腹膜腔途径扩散。该过程包括癌细胞从原发肿瘤脱落并释放到腹膜腔内，随后获得抵抗失巢凋亡的能力，并形成多细胞聚集体。这些细胞聚集体继而附着并侵入腹膜的间皮层，形成转移病灶。临床上相关的体内模型对于研究细胞因子和肿瘤微环境如何影响转移过程中的各个步骤，以及评估新型治疗策略至关重要。目前广泛用于研究卵巢癌转移及治疗反应的两种可移植性小鼠肿瘤模型是腹膜内模型和囊内模型。本文中，我们详细描述了建立这两种模型的逐步操作方法，并阐述其优势与局限性。此外，我们还介绍了如何利用生物发光成像技术，通过这些模型无创地监测肿瘤的进展过程。

引言

尽管在了解驱动卵巢癌进展的因素方面已取得显著进展，但卵巢癌在美国仍然是第二大致命的妇科恶性肿瘤¹。由于缺乏明显的症状以及可靠的早期诊断标志物，超过70%的卵巢癌患者在确诊时已处于晚期转移性疾病阶段^2,3。目前的治疗方法对转移性卵巢癌疗效有限，因此，晚期疾病患者的5年生存率仍低于30%⁴。治疗失败的一个主要原因是化疗耐药性的出现⁵。因此，迫切需要识别驱动卵巢癌转移和化疗耐药的因素。填补这一知识空白对于开发更有效的治疗策略以应对该疾病至关重要。为实现这些目标，我们需要能够准确模拟卵巢癌进展关键步骤的体内模型。

尽管卵巢癌细胞系和三维体外模型极大地促进了我们对影响转移和治疗反应因素的理解，但这些模型存在若干局限性^6,7,8。例如，这些模型未考虑肿瘤微环境中存在的多种非癌细胞，也无法再现肿瘤微环境中发生的复杂相互作用^6,7

方案

本方案中描述的所有动物实验程序均已获得马里兰大学巴尔的摩县分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（主要研究者 - Achuth Padmanabhan；方案编号 - 1947）。 本方案所用材料与设备的完整清单及其目录编号见材料表。

1. 准备用于小鼠移植的卵巢癌细胞系

注意：对于本方案中描述的所有体内模型，应准备卵巢癌细胞以移植到小鼠体内。除非另有说明，卵巢癌细胞应在室温下的层流组织培养罩中按以下方法进行准备：

1. 按照文献推荐的标准培养基，在37 ^oC、5% CO₂条件下，使用水套式CO₂培养箱培养卵巢癌细胞。若需进行肿瘤的非侵入性活体成像，移植前须对卵巢癌细胞进行基因改造，使其稳定表达荧光素酶。
2. 当细胞融合度达到约80%–85%时，在无菌条件下收获细胞，具体步骤如下：
   1. 从组织培养板中吸除培养基。
   2. 用无钙镁的无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞两次。PBS中若含有钙和镁会干扰胰蛋白酶活性，并促进细胞黏附。洗涤后吸除组织培养板中的PBS。
   3. 向组织培养板中加入0.05%胰蛋白酶-EDTA。所用胰蛋白酶的体积取决于组织培养板的大小及所用细胞系。对于在100 m....

结果

图 4 展示了使用萤光素酶标记的 OVCAR8 细胞在免疫缺陷的 Foxn1 裸鼠中建立的腹腔内卵巢癌模型的代表性数据。图 4 中这些细胞稳定的萤光素酶表达，使得可通过 IVIS 成像仪进行非侵入性生物发光成像，从而对肿瘤进展进行纵向监测，具体方法如第 III 节所述。向 Foxn1 裸鼠腹腔内注射 500 万 OVCAR8-萤光素酶细胞后，腹腔内成功形成转移性肿瘤，成瘤率为 100%（图 4）。肿瘤进展迅速，导致肿瘤负荷显著增加并出现腹水（图 4A、B）。活体成像显示，向 Foxn1 裸鼠腹腔内接种 500 万 OVCAR8-萤光素酶细胞后 29 天内即出现高肿瘤负荷（图 4C）。为了探究腹腔内注射不同数量的卵巢癌细胞对小鼠肿瘤进展动力学和生存期的影响，我们比较了腹腔内注射 500 万与 100 万 OVCAR8-萤光素酶细胞的小鼠随时间推移的肿瘤负荷变化。与注射 .......

讨论

模拟肿瘤细胞、微环境与系统性因素之间复杂相互作用的能力，使得小鼠模型成为研究卵巢癌进展的宝贵资源¹²。除了加深我们对驱动卵巢癌进展和转移因素的理解之外，体内小鼠模型在转移性卵巢癌的小分子药物和治疗策略的临床前评估中也发挥着重要作用^12,15。鉴于这些优势，目前已开发出多种用于研究转移性卵巢癌的体内小鼠模型^12,15。了解每种模型的优势与局限性，对于确定何种模型适用于特定研究问题至关重要。

尽管基因工程小鼠模型（GEMMs）极大地促进了我们对驱动卵巢癌进展因素的理解，但其构建过程复杂且成本较高¹⁰。此外，这些模型中肿瘤发展存在潜伏期，导致实验耗时且资源消耗大¹⁰。由于这些原因，可移植性肿瘤模型在研究驱动卵巢癌进.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 注射器无菌滤器，33 mm	Fisher Scientific	09-720-004
1 ml TB 注射器	BD	309659
21G，1 英寸针头	BD	305167
30G，½ 英寸针头	BD	305106
5 英寸弯头精细镊子	Fisher Scientific	1631
6-0 可吸收单丝缝线	MaxonTM	6532-11
酒精棉片（70% 异丙醇）	Dukal Corp	80003156
聚维酮碘（1% 碘溶液）	Purdue Products	367618150085
卡洛芬注射液，50 mg/ml	Levafen	RXLEVA50-20INJ
离心机	Eppendorf	5702
D-荧光素	Syd Labs	MB000102-R70170
精细尖头珠宝镊（解剖用）	Fisher Scientific	08-953E
眼膏	Medvet	11897
精细剪刀	Fisher Scientific	8940
加热垫	Sunbeam	731-500
精细尖头解剖镊	Fisher Scientific	S08096
胰岛素注射器 3/10 ml	BD	328438
异氟烷	Fluriso	Fluriso250
IVIS 成像系统	Perkin Elmer	IVISLMIII
梅奥-黑格直型持针器	Fisher Scientific	08-966
无钙镁的无菌 1× PBS	Corning	21-040-CV
无菌棉签	Mckeesson	24-106-1S
无菌纱布	Kendall	3033
无菌垫/毛巾/手术单，无孔	Henry-Schein	100-9687
三重抗生素软膏	Globe	4006-4SL
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Gibco	25200-056