本文介绍了一种评估小鼠脑膜淋巴管（MLVs）的实验方案，脑膜淋巴管在多种神经系统疾病中发挥重要作用。该方案旨在提供一种整合性方法，既能评估示踪剂引流功能，又能对背侧脑膜淋巴管网进行详细的形态学表征。
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摘要
摘要
硬脑膜淋巴管（MLVs）已被确认为中枢神经系统（CNS）稳态的关键调控者，其功能障碍与多种神经系统疾病相关。因此，对MLVs的形态和功能进行全面评估，对于理解其在CNS生理与疾病中的作用至关重要。本实验方案介绍了一种整合四种关键技术的小鼠MLVs评估方法：经小脑延髓池（i.c.m.）注射荧光示踪剂、活体颈深淋巴结（CLNs）成像、脑膜组织解剖以及整体组织染色。首先，将30 G针头通过聚乙烯（PE）管连接至注射器和输液泵。在小鼠麻醉后，通过钝性分离颈部肌肉暴露硬脑膜，并将注射针插入小脑延髓池（CM），以精确控制将示踪剂注入脑脊液（CSF）中。示踪剂向CLNs的引流过程可实现实时可视化，而后续的脑膜解剖与整体组织染色则可实现对背侧MLVs的详细形态学分析。整个操作流程可在3小时内完成，包括i.c.m.注射、组织灌流、颅骨分离及固定液中放置。本方案还可拓展用于颅内药物递送，或与分子分析相结合，因为脑膜解剖过程适用于新鲜未固定的组织，可用于RNA和蛋白质提取。
引言
硬脑膜窦内的MLV可将脑脊液成分和免疫细胞从中枢神经系统转运至颈部淋巴结1,2。MLV的发现挑战了中枢神经系统"免疫特权"的传统观念，近年来成为研究热点3。研究表明，MLV功能受损与多种疾病密切相关，包括阿尔茨海默病、年龄相关性认知功能下降、脑肿瘤以及中枢神经系统感染4,5,6,7。随着该领域研究的深入，对整合性、可重复且高度标准化的实验方法的需求日益增加。
目前大多数关于淋巴管研究的实验方案主要关注外周淋巴管8,9,10。在与脑膜淋巴管（MLVs）相关的研究中， 一项研究描述了一种简便的脑池（CM）插管操作，可直接进入脑脊液（CSF），且不损伤颅骨或脑实质11。结合成像技术，该方法可有效评估类淋巴系统功能及脑脊液动力学。然而，针对脑膜淋巴管功能与形态研究的详细实验方案尚未得到充分记录。
本方案将功能成像与形态学分析相结合，能够在同一动物个体中同步获取引流功能和结构形态数据，从而减少实验动物使用数量，并提高数据的可比性和一致性。总体而言，该方案可用于研究多种疾病模型中硬脑膜淋巴管（MLVs）的结构与功能变化，也可用于评估药理学或遗传学干预对MLVs的影响。本方案详细描述了操作步骤、关键注意事项及故障排除指导。此外，本方案所述的颅内脑膜（i.c.m.）注射技术可独立用于颅内药物递送，而脑膜解剖程序适用于新鲜组织，可用于后续RNA或蛋白质提取，具有较高的灵活性和可扩展性。
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方案
本方案中所述的小鼠操作均依照上海大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案（批准号：ECSHU 2023-099）进行。
1. 手术器械和缓冲液的准备
警告：操作具有中等毒性及致癌性的PFA时，须在化学通风橱内进行，并佩戴手套，以尽量降低潜在风险。所有涉及异戊醇的操作均须在远离点火源的化学通风橱内进行，同时佩戴手套和口罩，以减少暴露风险。
- 准备手术器械，例如直剪刀1把、弯头精细镊子2把、钝头镊子2把、显微剪刀1把，以及带光滑尖端（无齿）的直头显微镊子1把。
注意：实验前后均需用75%乙醇擦拭手术器械，并保持其干燥。 - 准备缓冲液。
- 1× PBS。
- 4% 多聚甲醛固定液（4% PFA）。
- 封闭液（含3%牛血清白蛋白（BSA）、0.5% Triton X-100和2%胎牛血清的1× PBS）。
- 抗体稀释缓冲液（含3% BSA和0.5% Triton X-100的1× PBS）。
- 抗荧光淬灭封片剂。
注意：配制好的试剂可在4 °C保存一个月。
- 配制2,2,2-三溴乙醇麻醉溶液（Avertin，1.25%，50 mL）
- 称取0.625 g三溴乙醇至2 mL离心管中，加入1.25 mL异戊醇，在37 °C摇床上充分溶解。
- 将完全溶解的三溴乙醇-异戊醇溶液转移至50 mL锥形离心管中，加入1× PBS定容至50 mL，并充分混匀。
- 在生物安全柜中用0.22 µm滤器过滤该溶液。
- 配制卵清蛋白- Alexa Fluor 647 标记物溶液（OVA-647，2 mg/mL）：将2 mg OVA-647溶解于1 mL人工脑脊液（aCSF）中。
2. 注射针的组装及其与显微注射泵的连接
- 使用钝头镊子折断30 G针头并保留其尖端11（外径0.30 mm，内径0.15 mm，长度8 mm）。
- 使用一段30 cm长的PE-10导管（外径0.64 mm，内径0.28 mm）将折断的30 G针头与含有30 G针头的显微注射针连接（图1）。
- 将连接有导管和30 G针头的显微注射针安装到显微注射泵上。
3. 脑内注射与活体成像
警告：如果针头插入过深并穿透脑实质，注射物将进入脑组织而非脑脊液腔，这会降低实验结果的准确性，并可能导致小鼠死亡。在手术过程中，必须对小鼠进行持续的生理监测。应每15分钟通过夹趾反射评估一次麻醉深度，以确保动物无痛觉。应使用加热垫将体温维持在37 °C ± 0.5 °C，以防止低体温及其对生理功能的不良影响。此外，应每30分钟记录一次呼吸和心率，通过观察胸廓运动和触诊心尖搏动进行评估。在颅内注射过程中，如果针头插入过深导致出血，则表明注射失败，应终止实验并对动物实施安乐死。
- 称重小鼠，并通过腹腔注射给予200 mg/kg的Avertin以麻醉小鼠。
注意：可使用其他麻醉剂（如氯胺酮/赛拉嗪）。 - 涂抹眼膏以防止角膜干燥。
- 当足趾夹捏反射消失，且呼吸变得缓慢而稳定时，在颈区涂抹脱毛膏以去除淋巴结区域的毛发。
- 剃除背部颈部区域的毛发。
- 将小鼠置于立体定位仪框架内的加热垫上，头部与躯干呈120°角图2A).
- 依次使用聚维酮碘和75%乙醇清洁该区域。
- 在颈部皮肤上做一正中切口，并钝性分离肌肉层。
注意：使用两把钝头镊子分离肌层，以尽量减少出血。 - 用尖头镊子分离肌肉组织，直至露出覆盖小脑延髓池的半透明硬脑膜 (图2B, C).
注意：使用尖头弯镊牵拉肌肉，以持续暴露颈肌（CM）。 - 在体视显微镜下，使用钝头镊子夹持针头，以与硬脑膜平面呈45°角的方向插入，深度约为1–2 mm。将针头斜面与硬脑膜平行放置，使其完全位于硬脑膜下方。图 2D).
注意：使用针头施加轻柔力量以穿刺硬脑膜。成功穿刺的标志包括可触及的阻力突然减小，以及观察到针尖位于硬脑膜下方并有脑脊液流出。 - 使用吸水纸擦干任何渗漏的脑脊液。
- 将微量注射泵设置为以 1 µL/min 的速度给药。向 CM 中注射 5 µL OVA-647 溶液（2 mg/mL）。4 (图2E).
- 针头留置2分钟以防止回流。
- 在脑膜上滴加一滴生物胶。
- 缝合手术切口。
- 在仍处于麻醉状态下，执行 体内 对小鼠进行成像，以在不同时间点（30 分钟、60 分钟）监测染料在浅表淋巴结（CLNs）中的强度。采用以下成像参数：曝光时间：0.5 s；激发滤光片：640 nm；发射滤光片：680 nm。持续监测麻醉深度，并根据需要追加麻醉剂。
4. 分离小鼠颅骨的背侧
注意：在开始胸部解剖前，需确认趾夹反射消失且自主呼吸停止。
- 使用过量的戊巴比妥钠（Avertin，600 mg/kg）处死小鼠，并用20 mL 1× PBS或生理盐水进行心脏灌注。
- 将小鼠断头以分离头部。
- 沿颅骨中线做切口以打开头皮。
- 使用两把弯止血钳轻柔牵拉，从两侧分离头皮。随后将弯止血钳插入眶窝，小心剥离鼻部和口腔区域残留的头皮（图3A–C）。
注意：该方法可实现头皮的快速且完全分离。 - 去除下颌骨，同时保持颅骨完整（图3D）。
- 去除颅底骨组织，暴露脑腹侧结构（图3E）。
- 用钝头镊子小心取出脑组织，避免接触顶骨的硬脑膜（图3F）。
- 将背侧颅骨完全浸入5 mL 4%多聚甲醛（PFA）中，在4 °C固定24小时（图3G）。
暂停点：固定后的颅骨可在4 °C保存不超过一周。在进行脑膜解剖前，将样本从4 °C取出，使其恢复至室温。
5. 小鼠颅骨脑膜的解剖
- 用 5 mL 1×PBS 清洗固定后的颅骨，重复清洗三次（每次 10 分钟）。
- 将颅骨背侧朝下置于盛有1×PBS的10 cm培养皿中 (图4A).
- 使用尖头镊子的尖端夹住或按压鼓泡，将其从颅骨上移除（图4B).
注意：去除鼓泡是避免在分离颅骨时因粘连导致脑膜撕裂的关键步骤。 - 用剪刀沿颅骨腹侧表面仔细修剪约2毫米，以使其平滑（图4C).
- 使用精细镊子，仔细清除脑膜窦汇合处（COS）区域残留的白色组织 (图4D).
注意：残留组织去除不完全是非特异性染色在免疫标记中的主要原因。 - 使用精细的微型镊子轻轻抬起脑膜一侧边缘，使其脱离颅骨边缘，然后抬起对侧边缘（图4E，F).
- 抓住脑膜的碗状边缘，从COS区域将脑膜从颅骨上剥离图4G).
- 用剪刀移除上颌骨（图4H).
- 再次抓住脑膜的碗状边缘，牵拉以分离额骨区域的脑膜与颅骨图 4I).
- 将完整的脑膜放入含有1 mL 1×PBS的24孔板中，准备进行染色。
注意：如果在解剖过程中脑膜破裂，尤其是在上矢状窦与横窦交界处，样本可能不适用于进一步分析。如果观察到较高的非特异性背景染色，可在多聚甲醛固定后增加一步淬灭步骤（例如，用 0.1 M 甘氨酸溶液孵育 40 分钟）12以进一步降低背景信号。
6. 封闭、一抗和二抗染色
- 使用1 mL移液器吸取1x PBS，使脑膜贴附于孔板底部。
- 在24孔板中加入200 µL封闭液，室温下对完整脑膜进行封闭处理1小时。
注意：使用镊子轻轻将脑膜在封闭液中完全铺展开，以确保均匀暴露。 - 使用移液器移除封闭液。
- 加入200 µL稀释后的抗LYVE-1（淋巴管特异性标志物13）抗体（1:200稀释，终浓度为1 µg/mL），4 °C孵育过夜。
- 使用移液器移除抗体溶液。
- 用1x PBS洗涤三次，每次10分钟。
- 在1x PBS中加入DAPI（终浓度1 µg/mL）和Alexa Fluor 488驴抗大鼠IgG（终浓度2 µg/mL），室温避光孵育1小时。
注意：抗体孵育过程中需避光。 - 使用移液器移除抗体溶液。
- 用1x PBS洗涤三次，每次10分钟。
7. 封片与成像
- 用移液器将 100 µL 的 1x PBS 滴加到载玻片中央。
- 使整体脑膜组织在液滴中漂浮并展开（图 5A）。
- 吸除 1x PBS，使组织平整贴附于载玻片上（图 5B）。
- 在整体脑膜组织上滴加 20 µL 封片介质。
- 将盖玻片覆盖在组织上（图 5C）。
- 将载玻片在室温下空气干燥，并于 4 °C 保存。
暂停点：载玻片可在 4 °C 保存长达一个月。使用前从 4 °C 取出，使其恢复至室温，并用吸水纸去除载玻片表面的冷凝水。 - 使用 20x 物镜采集 MLV 图像。将通道设置为 FL Green，发射波长为 518 nm，曝光时间为 100 ms。
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结果
尾静脉注射OVA-647后， 体内 小动物成像显示出在颈部区域双侧分布的明显椭圆形荧光信号（图6A）。在成功的注射中，示踪剂注射后在CLNs中清晰可见，荧光强度约在60 min时达到峰值（图6B）。此外，在分离的浅表和深部颈淋巴结中也观察到了荧光信号（图6C）。通过半定量分析荧光信号强度，可评估OVA-647在颈部淋巴结中的积聚情况。相比之下，由于针头位置偏差（例如穿透脑实质而未进入脑膜下腔）导致的注射失败，则在颈部区域无法检测到荧光信号图6D此类样本应排除在进一步分析之外。
MLV在解剖学上分为COS、横窦（TS）和上矢状窦（SSS）区域。LYVE-1的免疫荧光染色清晰地显示了这些淋巴管的形态（图7A–D）。使用Fiji软件对硬脑膜全...
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讨论
本方案通过整合颅内注射（i.c.m.注射），提供了一种全面评估MLVs功能与形态的方法， 体内 脑膜淋巴结成像、脑膜解剖及整体染色。相较于传统方法，该整合策略的一个关键优势在于能够在同一动物体内同时评估淋巴引流功能与血管形态，从而避免使用不同实验组动物，减少实验变异，并提高数据的可比性。此外，与需要切片的传统免疫染色方法相比，整体染色可保留淋巴网络的三维结构，从而更准确地量化血管面积、直径及分支模式。
该方案的成功依赖于多个关键步骤。其中一个关键步骤 是准确的颅内注射（i.c.m.），这对于将示踪剂正确递送至脑脊液（CSF）至关重要。脑膜在脑实质表面形成一层薄而透明至略带白色的膜状组织15。除了淋巴管外，脑膜还密布血管，这使得颅内注射操作复杂化，并增加出血风险。因此，应沿小脑延髓池（CM）中线以45°角插入针头，深度为1–2 mm，并使针尖斜面与脑膜平面平行。另一个关键步骤 是仔细解剖脑膜，这对保持淋巴管结构的完整性至关重要。脑膜组织较为脆弱，在解剖过程中容易撕裂，尤其是在小脑延髓池（COS）区域...
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本工作获得了国家重点研发计划&D 计划（2023YFC2306500）， 中国国家自然科学基金（82502108）和中国博士后科学基金（2024M760542）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人工脑脊液（ACSF） | Tocris | Cat# 3525 | |
| Alexa Fluor 488 驴抗大鼠 IgG（1:1000 稀释） | Invitrogen | Cat# A-21208 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | Cat# P0126 | |
| 钝头镊子 | RWD Life Science | Cat# F12011-10 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Beyotime | Cat# ST023 | |
| 盖玻片 | CITOTEST | Cat# 80312-3161 | |
| 弯头尖头镊子 | RWD Life Science | Cat# F11003-11 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat# D9542 | |
| 脱毛膏 | Veet | N/A | |
| 10 cm 培养皿 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 150464 | |
| 一次性静脉输液针 | Zhejiang Kindly Medical Devices | N/A | |
| 75% 乙醇 | Sinopharm Chemical Reagent | Cat# 80176961 | |
| 胎牛血清 | Excell | Cat# FSD500 | |
| 0.22 µm 滤膜 | Merck Millipore | Cat# SLGPR33RB | |
| 载玻片 | CITOTEST | Cat# 80340-3610 | |
| 异戊醇 | Sinopharm Chemical Reagent | Cat# 10003218 | |
| IVIS Spectrum | PerkinElmer | N/A | |
| 显微镊 | Shinva Medical Instrument | Cat# ZD372RB | |
| 显微剪刀 | Shinva Medical Instrument | Cat# ZO13056R | |
| 显微注射针（25 µL） | Shanghai Gaoge Industry & Trade | N/A | |
| 显微注射泵 | Voyage Power | Cat# QHZS-001A | |
| 小鼠：C57BL/6 野生型，8 周龄，雄性 | Cavens | N/A | |
| 30G 针头 | Zhejiang Kindly Medical Devices | N/A | |
| 生理盐水 | Beyotime | Cat# ST341 | |
| 卵清蛋白 Alexa Fluor™ 647 标记物 | Thermo Fisher Scientific | Cat# O34784 | |
| 4% 多聚甲醛固定液 | Beyotime | Cat# P0099 | |
| PE-10 导管 | 上海求精生化试剂仪器有限公司 | N/A | |
| 磷酸盐缓冲液（1× PBS） | Beyotime | Cat# ST447 | |
| 大鼠抗 LYVE-1 抗体（1:200 稀释） | Santa Cruz | Cat# sc-65647 | |
| 体视显微镜 | Jonec | Cat# JSZ6 | |
| 立体定位仪 | RWD Life Science | Cat# 68030 | |
| 直剪刀 | RWD Life Science | Cat# S12007-10 | |
| 1 mL 注射器 | Zhejiang Kindly Medical Devices | N/A | |
| 组织粘合剂 I | 3M Vetbond | Cat# 1469SB | |
| 三溴乙醇 | Sigma-Aldrich | Cat# T48402 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T8787 | |
| VS120 高通量荧光成像系统 | Olympus | N/A |
参考文献
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