在本研究中，通过比较24种检测结果 幽门螺杆菌 (H. pylori）利用抗原检测和数字PCR方法获得的培养细菌悬液，我们分析了它们之间的相关性，以探讨其在表征中的意义 H. pylori 参考材料和 体外 诊断评估。
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摘要
摘要
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H. pylori）的诊断在不同检测方法之间仍面临标准化难题。免疫层析法可检测H. pylori特异性抗原，但仅能提供定性结果，且易因非特异性结合或竞争性抑制而受到非靶标可溶性细菌蛋白的干扰。相比之下，数字PCR（dPCR）能够对基因组DNA拷贝数进行精确定量，可同时识别活菌与非活菌。本研究比较了免疫层析法所得终点滴度（以可检测到的最高两倍连续稀释倍数的倒数计算的半定量值）与dPCR测定的核酸拷贝数。将24份H. pylori菌液样本在布鲁氏菌琼脂培养基（添加5%去纤维羊血）中，于微需氧条件（85% N2、10% CO2、5% O2）下37 °C培养72小时后，平行进行抗原检测与dPCR测量。采用Pearson相关性分析与线性回归进行统计学评估。结果显示抗原滴度与基因组拷贝数之间存在显著正相关关系（r = 0.536，n = 24，P = 0.007）。然而，较低的决定系数（R2 = 0.287）表明其预测能力有限，抗原滴度仅能解释dPCR测量变异的29%，无法支持对单个样本的可靠预测。高dPCR值/低滴度结果的不一致可能源于非活菌碎片或游离基因组DNA。基于抗原与基于核酸的检测方法所测定的是生物学相关但不可互换的分析物。建议结合菌落形成单位、抗原滴度与基因组拷贝数进行多参数表征，以用于参考物质开发与诊断试剂的验证。本研究强调了制定H. pylori特异性共识指南以解决诊断差异的必要性。
引言
幽门螺杆菌（H. pylori） 是一种微需氧的革兰氏阴性杆菌，通常定植于人体胃肠道，尤其在胃窦部位。它是慢性胃炎、消化性溃疡和胃癌的主要致病原因。1,2. 传播 H. pylori 在人类中主要通过口-口或粪-口途径传播，全球普遍流行，不同地区的感染率有所差异。在发达国家，感染率约为50%，而在一些发展中国家，感染率可高达80%31994年，世界卫生组织（WHO）进行了分类 H. pylori 作为胃癌的1类致癌物4关键毒力因子如CagA（细胞毒素相关抗原A）和VacA（空泡毒素A）可引发慢性炎症和上皮损伤，这些致病机制是其被归类为1类致癌物的基础。2018年，归因于 H. pylori 感染人数达到81万，超过了由人乳头瘤病毒（HPV）、乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）引起的宫颈癌和肝癌病例总数5这一统计数据凸显了癌症风险的严重性 H. pylori，若不加以治疗，据部分研究显示，可能有约1%–3%的概率发展为胃癌。该病在全球范围内具有较高的流行率 H. pylori 感染使得定量的精确性——而不仅仅是检测——成为公共卫生的优先事项，因为准确的细菌载量评估能够指导治疗决策，并有助于避免不必要的或失败的根除治疗。因此，准确的检测与定量 H. pylori 对流行病学调查、治疗方案的选择以及疗效评估具有重要意义。
鉴于大量癌症负担归因于 H. pylori，准确检测和定量对于流行病学监测、治疗方案选择及疗效监测至关重要。目前的非侵入性检测方法包括粪便抗原检测（SAT）、尿素呼气试验以及分子检测。尽管数字PCR（dPCR）具有高精度和绝对定量能力，但与SAT相比，其临床应用受限于较高的成本、复杂的技术要求以及仪器设备需求。这种差异使得有必要对这两种方法之间的相关性进行研究，旨在以dPCR作为定量参考，推动SAT的标准化进程。
数字PCR（dPCR）是一种新兴的绝对定量技术，可直接检测目标基因的绝对拷贝数，无需依赖标准曲线。在H. pylori研究中，dPCR已被用于胃黏膜、唾液和粪便样本中的细菌定量6,7。
在研发、质量评估和监管过程中 体外 诊断试剂，参考物质的制备与校准对于确保结果的准确性、可比性和可追溯性至关重要。对于细菌 体外 诊断试剂（例如 H. pylori 抗原/抗体检测试剂），参考物质通常需要包含具有明确定义浓度或活性单位的菌株或临床样本。传统的细菌定量方法是菌落形成单位（CFU/mL），该方法直接反映具有增殖能力的活菌数量，常用于细菌标准物质的定值、试剂灵敏度评价以及方法学比较。8尽管菌落形成单位（CFU）仍被广泛使用，但在检测时间、材料消耗和人工成本方面存在明显局限性9.
随着更广泛的应用 体外 诊断技术, 分子方法如dPCR现在能够以更高的准确性和灵敏度对病原体进行定量。同时，免疫学方法如抗原滴定在临床实践中也日益得到应用。然而在实际操作中，大多数收集的临床分离株或制备的标准样品均为灭活样品或长期保存的样品，难以甚至无法进行活菌培养和CFU计数10在准备参考物质时，为满足生物安全要求并确保物质的长期稳定性，必须进行灭活处理。基于抗原或核酸检测的定量方法因此成为赋值的关键手段。8,11.
这就引出了一个关于这两种不同定量方法之间相关性与等效性的实际问题：在使用抗原检测和数字PCR（dPCR）评估标准物质时，这两种方法的结果之间是否存在稳定且可量化的关联？初步实验利用一组有限的灭活H. pylori样本，发现免疫层析检测的信号强度与通过dPCR定量的DNA拷贝数之间存在一致的正相关关系。我们假设，在灭活细菌样本中，免疫层析法测定的H. pylori抗原滴度与dPCR定量的DNA拷贝数之间存在显著且稳定的正相关关系。如果这种相关性确实存在，则可将基于抗原的定性结果转换为定量的核酸当量，从而为试剂性能评价、标准建立、参考物质赋值以及在传统培养不可行时临床检测结果的解读提供重要依据。
目前，关于H. pylori抗原检测结果与核酸含量之间关系的研究尚不充分，缺乏系统性数据以支持相关评审、监管和标准化工作。为验证这一假设，本研究对24份H. pylori培养菌液进行了平行检测，系统分析了胶体金免疫层析法检测的抗原滴度与数字PCR绝对定量结果之间的相关性。基于研究结果，我们对H. pylori检测试剂的性能评价及标准物质赋值提出了参考意见。
方案
本研究中包含的所有幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）分离株最初均由郑州大学第五附属医院从人体胃黏膜活检及粪便标本中分离获得，该医院为我们提供了已完成全部处理的匿名细菌悬液，用于体外（in vitro）实验。所有原始操作程序（临床标本采集、细菌分离及初始冻存）均经郑州大学第五附属医院伦理委员会批准（伦理审批编号： KY2026080）。在标本采集前，已从所有参与者处获得知情同意，且所有操作均严格遵守《赫尔辛基宣言》及相关国家生物医学研究伦理指南。在样本移交前，供体医院已永久去除所有可识别的患者信息，本研究中报告的实验材料或结果均无法推断出任何个体患者的身份。
本研究无需额外的独立伦理审批或知情同意。所有实验仅涉及 体外 使用匿名细菌悬液进行的检测，不涉及原始人类样本、患者临床记录或私人个人信息。根据国家生物医学研究伦理法规，属于非干预性研究。 体外 使用完全匿名的微生物分离株进行的研究符合伦理豁免标准。郑州大学第五附属医院原有的伦理批准已涵盖这些匿名菌株的所有合法二次学术应用，该范围已由机构伦理委员会正式确认。
全部 H. pylori 体外 实验在具有有效生物安全认证的实验室中进行（生物安全二级，BSL-2，北京市东城区卫生健康委员会实验室生物安全备案〔2020〕第059号），遵循机构标准操作程序，并满足所有生物安全审查与授权要求。本研究的生物安全审批涵盖涉及热灭活的所有操作程序 H. pylori 材料，包括处理未完全灭活的材料（即经活菌PCR鉴定仍含有残留活性生物体的材料）。整个研究过程中严格遵守标准微生物操作规范、个人防护装备（PPE）要求以及废物去污程序。所有细菌样本在丢弃前均按照机构生物危害废物管理指南进行了适当灭活。所有试剂、设备及用于统计分析的软件详情均列于 材料列表
菌株与培养
注意：H. pylori 属危险群组2级人类病原体。所有活菌培养物的操作（接种、培养和菌液制备）均须在符合生物安全二级（BSL-2）标准的实验室内的认证生物安全柜中进行，并穿戴实验室外套、手套和眼部防护装备。
在 56 °C 下加热灭活 25 分钟可显著降低但不能完全消除活微生物（见第 1 节）；部分灭活的悬液仍须在 BSL-2 条件下继续操作。所有生物废弃物和受污染的耗材在丢弃前，必须按照机构生物安全规程进行高压灭菌（121 °C，≥30 分钟）或消毒处理。本文所述 BSL-2 操作已获同一生物安全备案文件批准（北京市东城区卫生健康委员会实验室生物安全备案 [2020] 第 059 号）。
的 幽门螺杆菌 本研究中使用的菌株为24种培养的细菌悬液，这些菌株最初由郑州大学第五附属医院从人体胃黏膜活检及粪便标本中分离获得，随后以细菌悬液形式转移至菌种保藏库 体外 中国药品生物制品检定院传染病诊断科 （中国北京国家口腔疾病临床医学研究中心，NIDC），本研究的所有实验工作均在该中心（中国北京）完成。将这些菌株接种于添加了5%去纤维羊血的布氏杆菌培养基平板上，并在微需氧条件（85% N₂）下培养。₂，10% CO₂，5% O₂₂) 在 37 °C 培养72小时。此培养时间对应于细菌的稳定生长期，此时各菌株的抗原表达相对稳定。随后收集细菌悬液。
使用数字水浴在 56 °C 下加热灭活 25 分钟。该处理旨在满足生物安全要求，并确保参考物质的长期稳定性。在 56 °C 下加热 25 分钟可显著降低细菌的存活能力，但并不能完全消除所有活体微生物，后续的活力 PCR 分析证实了这一点，结果显示在 24 种培养的细菌悬液中，平均残留存活率为 4.6%（范围为 0.00%–33.00%）（见结果部分第 6 节和讨论部分）。本研究的生物安全批准涵盖未完全灭活材料的操作（见伦理与生物安全声明）。加热灭活对抗原检测的潜在影响被认为极小，因为该热处理温度低于大多数 H. pylori 表面抗原的变性阈值；然而，它可能会影响某些热敏感蛋白抗原的完整性。对于 DNA 定量而言，加热灭活不会降解基因组 DNA，反而可能通过破坏细胞膜而提高提取效率。
抗原检测
将收集的24种细菌悬液用PBS稀释100倍，以制备抗原检测样本。初始100倍稀释可使抗原浓度处于商用试剂盒的线性检测范围内，最大限度减少基质干扰，从而确保检测结果的可靠性和准确性。该稀释方式还可节约样本用量。使用八种已注册的H. pylori抗原检测试剂盒（表1）对这些样本进行检测，包括胶体金法、乳胶法和免疫层析法。若结果为阳性，则对稀释样本进行系列倍比稀释（1:2、1:4、1:8等）并依次检测，直至结果转为阴性。记录仍呈阳性的最高稀释倍数，并定义为“抗原最终阳性稀释倍数”（例如，1:64）。系列倍比稀释液使用磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 M，pH 7.2–7.4）配制。加样后，每条试纸条在室温下孵育15–20分钟后判读结果；由经过培训的操作人员根据对照线进行肉眼判读，终点定义为仍可见检测线的最高稀释度。由于胶体金试纸条依赖肉眼判读，其临界值受操作者主观判断影响。
对于使用多种商用抗原检测试剂盒检测的每个样本，终点滴度定义为所有单个试剂盒滴度的中位数。由于本研究中的八种试剂盒采用不同的靶向抗原和检测原理设计，因此未使用Cohen's Kappa或变异系数（CV%）来量化试剂盒之间的一致性，因为这些指标假设存在一个共同的参考标准。因此，试剂盒之间观察到的变异性反映了真实的生物学和分析异质性，而非测量误差。中位数作为一种稳健的集中趋势度量，能够有效抵抗特定试剂盒的偏差。在24个样本中，各试剂盒间最高与最低滴度的样本内差异范围为2倍至16倍（中位数为4倍）：6个样本相差2倍，14个样本相差4倍，3个样本相差8倍，1个样本相差16倍。每个样本各试剂盒的最小值、中位数和最大滴度列于补充表1中。
数字 PCR 定量检测
收集的24种细菌悬液用PBS稀释500倍后，作为样本用于dPCR定量检测。这些稀释样本的绝对定量由四个dPCR实验室完成（表2）。dPCR检测使用各平台专有的引物和探针组，靶向保守的H. pylori基因组序列。本研究中使用的dPCR检测试剂盒为适用于多种病原体和多靶标的通用试剂盒。各平台独立设计并优化了特定的引物/探针序列及靶基因区域，这些属于其核心技术知识产权，未向最终用户公开。我们仅被告知，H. pylori的特异性检测靶标是一个经验证可用于特异性检测的保守基因组区域。24株Helicobacter pylori的23S rRNA基因序列已提交至NCBI GenBank，登录号为BioProject PRJNA1520048。这些序列用于菌株身份确认，并非dPCR定量检测的靶标。由于引物/探针设计、扩增化学体系以及基于泊松分布的分区计数方法均为各平台专有技术，因此这些步骤依赖于特定平台，若无制造商授权则无法重现；相比之下，前述的样本稀释、提取重复及数据汇总流程则不依赖平台，且已完全说明。目标基因在原始溶液中的绝对拷贝数（拷贝数/mL）根据泊松分布算法及稀释倍数计算得出，其中泊松分布算法由仪器配套的专有分析软件实现。具体的计算参数和源代码属于制造商专有信息，未向最终用户披露。
四个独立的数字PCR实验室（Sniper、江苏百奥信康科技有限公司、优思达生物技术有限公司和靶向生物）参与了本研究，各实验室均使用专有的核酸提取试剂盒和针对其仪器平台优化的数字PCR试剂，靶向幽门螺杆菌（H. pylori）基因组中的保守序列。每个平台均接收未经稀释的细菌悬液，并按照各自的操作流程进行样本制备：优思达直接使用未经稀释的悬液，而 Sniper、江苏百奥信康科技有限公司和靶向生物在提取前将其在磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释500倍。对于每个平台上的每个菌株，均从同一份500倍稀释的细菌悬液中独立进行两次核酸提取，每份提取物设三个技术重复，从而每个菌株在每个平台上获得六次测量结果（优思达平台有一个例外情况，其中一次提取仅获得两个有效重复）。若反应的阳性液滴数低于仪器的最低检测限，或无模板对照出现非特异性扩增，则该反应被判定为无效并予以排除；无效反应允许重复一次，若仍失败则整次提取结果被剔除。各平台的原始数据见补充表1。
数据整合采用两阶段流程：首先，对每种平台内的所有有效原始测量值（拷贝数/µL）取平均值，并利用各平台特定的转换公式换算为原始未稀释细菌悬液的浓度（拷贝数/mL）；其次，对每个菌株在四个平台上获得的浓度值取算术平均值，得到最终的单一拷贝数结果。该框架确保各平台对最终结果的贡献权重相等，不受各平台内重复测量变异的影响，同时减轻了单个仪器或试剂系统固有的系统性偏差。
每种培养的细菌悬液均在四种数字PCR平台上平行定量，并针对每种分离株计算跨平台的log₁₀转换后拷贝数的变异系数（CV），以评估实验室间变异性。相应结果在结果部分中报告。
统计学分析
的 H. pylori 抗原滴度定义为观察到阳性结果的最高样本稀释倍数的倒数（例如，1:64 的稀释度对应滴度为 64）。对于每个分离株，八种试剂盒特异性的抗原滴度通过其中位数进行汇总，四种平台特异性的 dPCR 浓度通过算术平均值进行汇总，以获得每个分离株在后续相关性分析中使用的单一代表性数值。该数据降维策略在方法学上是合理的，原因如下：（i）八种抗原试剂盒采用相似的免疫分析原理检测同一分析物，而中位数可提供对偶发异常值读数具有抗性的稳健估计；（ii）四种 dPCR 平台均对一段保守序列 H. pylori 基因组位点，且对数正态分布浓度估计值的算术平均数可提供无偏的中心趋势；(iii) 此种聚合方式与本研究的主要目标一致——评估在分离株水平上基于抗原滴度与基于DNA的定量方法之间的一致性，而非评价不同试剂盒或不同平台间的分析性能。抗原滴度与dPCR定量（拷贝数/mL）之间的相关性首先通过Pearson相关性分析进行评估。经对数转换后，两个变量均近似服从正态分布（偏度：log10 dPCR = −0.66；log2 抗原滴度 = −0.60；回归残差偏度 = −0.16），满足皮尔逊相关性的假设条件。对抗原滴度进行以2为底的对数转换（log2-transformed），以反映两倍系列稀释的线性化；而数字PCR（dPCR）结果则进行以10为底的对数转换（log10-transformed），这也符合细菌载量标准的报告格式。随后，为评估线性关联性，采用经log2转换后的抗原滴度与经log10转换后的dPCR结果进行皮尔逊相关性分析及线性回归分析。所有分析均以显著性水平（α) 为 0.05，以 P < 0.05 被视为具有统计学意义。所有统计分析均使用 SPSSPRO 在线统计分析平台进行。
结果
比较 H. pylori 抗原滴度与数字PCR绝对定量结果
在全部24份培养细菌悬液中，抗原滴度范围为8至256，中位数为32。表 1数字PCR定量结果范围为2.67 × 107 copies/mL 至 2.04 × 109 拷贝数/毫升，中位数为对数₁₀ = 8.61 (≈4.09 × 108 拷贝数/毫升)表 2原始数据显示两者关系呈现非线性特征，表明存在幂律或指数关联，这为后续对抗原滴度与数字PCR定量值同时进行对数转换提供了依据。
对数转换后抗原滴度与数字PCR定量结果之间存在线性关联。
为检验两种检测方法的结果之间是否存在显著相关性，我们对数据进行了对数转换，并执行了 Pearson 相关性分析，因为两个变量在对数转换后均近似呈正态分布。如图所示， 图 1转化后，抗原滴度（经log2转换）与数字PCR绝对定量结果（经log10转换）呈现显著的中度正线性相关（r = 0.536，n = 24， P = 0.007).
抗原滴度与数字PCR拷贝数关系的定量建模
为量化两种检测方法之间的关系并评估相互预测的潜力，我们对对数转换后的数据应用了线性回归分析，以便未来利用该回归模型通过抗原滴度预测细菌载量。分析显示，对数2 （抗原效价）与对数10 (dPCR)，得出方程：log10(dPCR) = 0.1588 × 对数2（滴度）+ 7.7988 (R2 = 0.287）。回归系数（附标准误及95%置信区间）为：斜率 0.1588 ± 0.053（95% CI 0.048–0.270) 和截距 7.7988 ± 0.292（95% CI 7.193）–8.404）；残差标准误为 0.318 log10 单位，且总体回归显著（F(1,22) = 8.84, P = 0.007）。这表明，抗原滴度每翻倍一次，dPCR拷贝数仅增加1.441倍（100.1588）。然而，对于给定的抗原滴度，数字PCR结果的95%预测区间可跨越近两个数量级（例如，在滴度为1:32时，预测区间约为8.3 × 107 至 1.85 × 109拷贝/毫升）。这表明在实际应用中，仅凭抗原滴度无法准确预测单个样本的核酸拷贝数，但使用该模型可能为群体水平的比较提供一个数量级的粗略估计，尽管由于解释力中等（R2 = 0.287).
不同数字PCR平台间的定量变异性与相关性敏感性分析
实验室间变异性基于对数10-对浓度进行转换，以处理微生物定量数据的对数正态分布特性。四个平台所得对数转换数据的变异系数百分比为10 在24株分离株中，浓度范围从0.9%到8.3%（中位数1.8%，平均值2.5%）。一个异常值（Hp06，CV = 8.3%）显示出 >Sniper (5.93) 与 Sniper (0.2) 之间的 30 倍差异 × 108 拷贝/毫升）和TargetingOne（1.50 × 107 拷贝/毫升）；排除该分离株后，变异系数范围为 0.9% 至 6.4%。为确保该离群值不影响所观察到的抗原–dPCR相关性分析中，我们排除了Hp06样本进行敏感性分析，所得相关系数r = 0.479，R² = 0.229。2 = 0.230，且 P = 0.021 (n = 23) — 与包含全部24个分离株的初步分析结果相当 — 确认头条相关性不依赖于该分离株。这种离散反映了不同平台在提取效率、试剂灵敏度和仪器校准方面的系统性差异，而非随机测量误差，这支持通过跨平台平均来减少平台特异性偏差。
使用双方法阈值定义和分类结果
基于上述分析及探索性、数据集特定的标准，鉴于抗原滴度数据呈非正态分布，本研究将抗原检测的中位滴度设定为1:32，作为高抗原检测的阈值，并选取了实际的中位对数。₁₀(dPCR) = 8.61≈4.09 × 108 拷贝数/毫升）作为高核酸含量的阈值。这些阈值是基于培养分离株数据得出的探索性、数据集特异性截断值，并不代表经过验证的临床诊断标准。因此，若要将这些截断值应用于其他样本集或分析情境，必须基于相应数据重新推导，而非直接套用。
使用探索性阈值（抗原滴度 ≥ 1分32秒为高， ≤ 1:16 为低；dPCR 对数₁₀ ≥ 8.61（即高核酸载量）时，24份培养细菌悬液的四象限分类情况图 2表3) 如下：9 个样本（Hp03、Hp04、Hp11、Hp13、Hp18、Hp19、Hp21、Hp22、Hp25）属于高抗原–高核酸类别（37.5%）；3个样本（Hp09、Hp26、Hp27）被归类为低抗原–高核酸含量（12.5%）；8个样本（Hp01、Hp02、Hp05、Hp08、Hp10、Hp14、Hp15、Hp17）呈现高抗原水平–低核酸含量（33.3%）；以及4个样本（Hp06、Hp07、Hp12、Hp20）属于低抗原含量。–低核酸含量类别（16.7%）。由于24个分离株被分为六个滴度组，每组平均仅4个样本，正式的组间比较（例如Kruskal-Wallis检验）将缺乏足够的统计效力；因此，仅报告了各滴度组间数字PCR定量结果的描述性总结。
热灭活后残留活菌比例（活菌PCR）
为量化热灭活后的残留活菌，对所有24株分离菌均采用了活菌PCR检测试剂系统。简言之，将每份热灭活菌悬液（200 µL) 与膜不通透的 Viability PCR Reagent (10 µM 终浓度）于 37°C °在 75 分钟的反应中，设置一个平行省略试剂的对照。−虚拟现实）采用相同处理流程。随后，通过加入 Viability PCR 中和缓冲液（20 µL, 10×) 并于室温孵育15分钟。分别从+VR和-VR样品中提取基因组DNA。 −取等量VR样本，并对每份提取物进行dPCR检测；活菌比例按+VR与总VR的比值计算。 −VR 拷贝数 × 100%。中位存活率为4.6%（范围0.00%–33.00%；各分离株的完整结果见 补充表 2）。存活率百分比与抗原滴度之间未呈现显著相关性（r = 0.03， P = 0.90）或与数字聚合酶链式反应拷贝数（r = 0.37， P = 0.08).
数据可用性：
24株菌株的23S rRNA基因序列 Helicobacter pylori 菌株已保藏于NCBI GenBank，生物项目登录号为PRJNA1520048。这些序列仅用于菌株身份确认，并不代表数字PCR的定量靶标；如实验方案所述，定量靶标为制造商专有的保守基因组区域。
来自八种商业化胶体金免疫层析试剂盒的原始试剂盒特异性抗原滴度，以及来自四台数字 PCR 仪的平台特异性 dPCR 定量值，由于商业敏感性、制造商保密协议以及与 CE 标志/国家药品监督管理局批准相关的监管限制，无法存入公共存储库。 体外 诊断产品。
在必要时，可依据适用的保密及监管限制规定，以保密方式提供其他受限数据。
图 1相关性 Helicobacter pylori 抗原滴度与数字聚合酶链式反应（dPCR）定量分析。 散点图及回归线展示了24份细菌培养悬液（n = 24）中抗原滴度与DNA拷贝数之间的关系。抗原滴度通过胶体金免疫层析法结合目视判读确定。对每个样本进行系列稀释检测，滴度以产生阳性结果的最高稀释倍数表示（在x轴上以log10呈现）。2-转换后的无量纲数值）。DNA拷贝数通过dPCR进行定量，并以对数形式呈现在y轴上。10-转换后的浓度（对数）10 拷贝数/毫升）。每个圆点代表一个独立的细菌悬液样本。蓝色实线表示线性回归拟合线。回归线周围的阴影带表示拟合平均响应的95%置信区间。垂直和水平虚线表示探索性分类阈值（log₂ 效价 = 5，即 1:32；对数₁₀ dPCR = 8.61，即 4.09 × 108 图2和表3中使用的拷贝数/毫升。相关性采用皮尔逊相关系数进行评估，结果为 r = 0.536。 P = 0.007, R2 = 0.287，这表明两种方法之间存在统计学上显著的正相关关系。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2分析性分类框架 H. pylori 将抗原检测结果与数字聚合酶链反应定量相结合进行测试。 本图展示了基于免疫层析抗原滴度与数字PCR定量结果一致性对24份培养细菌悬液（n = 24）进行的四象限分类。采用探索性、数据集特定的阈值（抗原滴度 ≥ 1:32 为高值， ≤ 1:16 为低值；dPCR 对数₁₀ ≥ 8.61 作为高核酸载量），样本被分类为：高抗原–高核酸（n = 9，37.5%），高抗原–低核酸 (n = 8, 33.3%)，低抗原–高核酸（n = 3，12.5%）与低抗原–低核酸含量（n = 4，16.7%）。这些阈值是基于培养分离株数据得出的探索性截断值，不代表经过验证的临床诊断标准。该分类框架展示了免疫学与分子检测方法之间的一致性与差异性。存在差异的类别可能反映了诸如抗原稳定性、细菌活性或DNA拷贝数变异等因素。本框架旨在用于分析比较，不构成临床诊断或治疗建议。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 编号。 | 检测试剂 | 制造商 |
| 1 | 幽门螺杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法） | Bioneovan Co., Ltd |
| 2 | 胃幽门螺杆菌（HP）抗原检测试剂盒（胶体金法） | 上海凯创生物技术有限公司 |
| 3 | 幽门螺杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法） | 江苏摩尔生物科学有限公司 |
| 4 | 幽门螺杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法） | 杭州吉因生物检测 & Biocontrol Ltd |
| 5 | 幽门螺杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法） | 江苏科沃生物技术有限公司 |
| 6 | 幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法） | ABON Biopharm (Hangzhou) Co. Ltd |
| 7 | 幽门螺杆菌抗原检测试剂（免疫层析法） | 广州万孚生物技术股份有限公司 |
| 8 | 幽门螺杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法） | 北京科睿技术有限公司 |
表1： 幽门螺杆菌 抗原检测试剂及其制造商。 该表格列举了八种可用于检测的市售免疫层析法。 H. pylori 本研究评估了抗原。针对每种产品，均记录了制造商提供的产品编号、检测试剂的商品名称以及制造商信息。'这些试剂盒的名称已列出。选择这些试剂盒是基于其在临床诊断和即时检测中的广泛应用。所有信息均从制造商处获取。' 产品说明书与官方网站（访问于2026年3月）。这些试剂的纳入不代表对其的认可；它们代表了现有检测方法的多样性。
| 编号。 | 仪器型号 | 数字 PCR 平台 |
| 1 | DQ24 | 狙击手 |
| 2 | Bio Rad QX200 微滴数字 PCR | 江苏百康芯生物科技有限公司 |
| 3 | DQ24 Pro | 优思达生物技术（杭州）有限公司 |
| 4 | TD-1 数字 PCR 系统 | TargetingOne |
表2：数字PCR（dPCR）平台与仪器型号列表。 本表格列举了四种配备数字PCR系统的实验平台，以及用于测试的相应仪器型号。选择这些平台是基于其技术多样性，并代表了当前数字PCR技术的应用现状。所有信息均由各平台提供。纳入这些平台并不代表对其认可；它们仅代表现有数字PCR系统的涵盖范围。
| 类型 | 病例数 | 比例 | 样本编号 |
| 高抗原 - 高核酸 | 9 | 37.5% | Hp03、Hp04、Hp11、Hp13、Hp18、Hp19、Hp21、Hp22、Hp25 |
| 低抗原 - 高核酸 | 3 | 12.5% | Hp09, Hp26, Hp27 |
| 低抗原 - 低核酸 | 4 | 16.7% | Hp06、Hp07、Hp12、Hp20 |
| 高抗原 - 低核酸 | 8 | 33.3% | Hp01、Hp02、Hp05、Hp08、Hp10、Hp14、Hp15、Hp17 |
表3：本研究中抗原检测与核酸检测结果的分类与比例 本表根据抗原滴度（通过免疫层析法测定，以产生阳性结果的最高稀释倍数表示）与绝对定量数字聚合酶链反应（dPCR）结果（以 log 表示）之间的一致性，对 24 份培养细菌悬液进行了分类。₁₀ 拷贝数/毫升）。采用1:32（高滴度）作为抗原滴度截断值。 ≥ 1:32，低浓度 ≤ 1:16)，且数字PCR定量检测下限为4.09 × 108 拷贝数/毫升（对数）₁₀ = 8.61）作为探索性、数据集特定的阈值，分离株被分为四个亚组：高抗原-高核酸、低抗原–高核酸，高抗原–低核酸，以及低抗原-低核酸。在24份样本中，有9份被归类为高抗原。–高核酸含量（37.5%；Hp03、Hp04、Hp11、Hp13、Hp18、Hp19、Hp21、Hp22、Hp25），3 例为低抗原–高核酸含量（12.5%；Hp09、Hp26、Hp27），8 例为高抗原–低核酸含量（33.3%；Hp01、Hp02、Hp05、Hp08、Hp10、Hp14、Hp15、Hp17），以及4个为低抗原含量。–低核酸含量（16.7%；Hp06、Hp07、Hp12、Hp20）。对于每个类别，表格展示了病例数（n）、相对于总样本量的比例（%）以及各类别内的样本编号。此分类说明了免疫学检测方法与分子检测方法之间的一致性与不一致性；存在差异的类别可能反映了诸如抗原稳定性、细菌活性或DNA拷贝数变异等因素，为分析检测结果的解读提供了参考。
补充表1：24份样本的抗原检测与数字PCR定量汇总数据集 Helicobacter pylori 分离株。 工作表 1 （抗原检测）：八种商用胶体金免疫层析试剂盒针对各分离株的每盒终点滴度，以及每份样本的最低、中位和最高滴度与样本内倍数范围。 工作表 2 （数字PCR定量检测）：各分离株的平台特异性dPCR浓度（拷贝数/毫升），附平台间汇总统计量（中位数、最小值、最大值及对数转换值的变异系数百分比）。₁₀-转化后的浓度）。 第三页 （相关性分析与回归分析）：菌株水平对数₂-转化抗原滴度与对数₁₀-转化后的数字PCR浓度、皮尔逊相关系数与线性回归结果（r、R²）2回归方程）、排除异常值 Hp06 的敏感性分析，以及详细的回归统计量（标准误、95%置信区间、残差标准误、F统计量及 P-p值）。出于商业保密考虑，试剂盒特定与平台特定标识符已作匿名化处理；该数据集包含复现图1所需的所有数值。–表2与表3。请点击此处下载此文件。
补充表2：24个样本的活力PCR结果 Helicobacter pylori 分离株。 单菌株数字PCR存活试剂拷贝数–处理组 (+VR) 与试剂省略组−热灭活（56°C）后的病毒裂解物（VR）分装液 °在 25 分钟条件下，计算得出的存活率（%）及等效值 Δ各分离株的 Cq 值。所有分离株的中位存活率为 4.6%（范围 0.00%–33.00%).请点击此处下载此文件。
讨论
在本研究的24株培养的H. pylori分离株中，免疫层析抗原滴度与dPCR基因组拷贝数呈中等但显著的正相关（r = 0.536，P = 0.007）；然而，抗原滴度仅能解释dPCR拷贝数变异的29%（R2 = 0.287），因此这两项指标相关但不可互换。本研究的主要局限在于样本量较小（n = 24），这限制了统计效能，也解释了下文所用分类阈值具有探索性性质的原因。
本研究对 H. pylori 培养物中的抗原滴度以及数字PCR（dPCR）检测的核酸拷贝数进行了定量分析，结果显示两种检测方法的结果之间存在中等但显著的相关性（r = 0.536，P = 0.007）。尽管在群体水平上观察到两种方法之间存在显著相关性，但在临床实践中，个体水平上的检测结果差异却十分常见。其原因在于不同的检测靶标反映了病原体不同的生物学特性。具体而言，抗原检测识别的是可能在细菌被清除后仍持续存在的蛋白质，而核酸检测则针对即使在活菌被清除后仍可能以低水平持续存在的DNA。这种不一致性在多种感染性疾病中已有充分报道。 例如，在艰难梭菌感染的临床诊断中，部分携带者毒素基因检测呈阳性，但毒素蛋白抗原检测为阴性，可能导致误诊为感染者，从而引发过度治疗和耐药性的产生。因此，美国感染病学会（IDSA）12在指南中明确区分了艰难梭菌“毒素检测”与“毒素基因检测”的临床意义，指出仅依靠核酸检测不足以确诊感染，推荐采用能够直接检测活性毒素蛋白的方法。此外，在社区获得性肺炎经抗生素治疗后，患者痰液中的细菌DNA载量迅速下降，而尿液抗原在康复后仍可呈阳性，并持续数周至数月13。在 H. pylori 感染的诊疗过程中也观察到类似现象。2022年，梅奥诊所实验室评估了223例抗生素治疗后的随访患者，发现PCR在检测粪便样本中低水平残留DNA方面相对敏感。部分患者尽管临床已康复且抗原检测为阴性，但在数周内仍持续呈现PCR阳性结果14。上述所有现象进一步证实了不同检测靶标在生物学上的差异性。
在本研究中，确定了抗原滴度之间的定量相关性与等效性 H. pylori 通过免疫层析法检测以及dPCR定量值为表征提供了实用指导 H. pylori 参考材料及用于评估 体外 诊断试剂。1）推动产品性能评价模型的升级：目前，产品临床试验评价的 H. pylori 抗原检测试剂采用与临床的盲法同步比较 "金标准" 如组织学检查、培养或尿素呼气试验15本研究建议监管机构应在审评过程中要求企业在其申报材料中提供其检测结果与核酸定量方法之间的相关性数据，并明确界定其产品的性能指标 "结果范围不一致"，以便更真实地反映产品在复杂临床场景中的检出能力，并更全面地界定试剂的检出限。2）为细菌参考物质的赋值提供了新方法：质量控制与校准用参考物质可从单一 "CFU" 到 "多维特征值"8 包括抗原滴度和核酸拷贝数。本研究建立的回归模型可对这两个数值之间的数量级关系进行粗略估计，为参考物质的使用和实验室间比对提供定量依据。
我们建议制造商不仅应提供检测限（LOD）的分析单位（例如 CFU/mL 或抗原滴度），还应提供通过数字 PCR（dPCR）测定的基因组拷贝数等效值，以便在不同实验室和平台之间进行结果比较和对齐。这种双单位报告方式符合 ISO 175118 的计量溯源性要求以及 CLSI EP17-A216 的检测能力评估框架。
出现“抗原低–核酸高”样本的可能原因如下：1）菌株的遗传变异：若抗原表位中的氨基酸发生替换，或在转运与分泌过程中分泌蛋白受阻，则可能导致抗原检测出现“逃逸”现象17。2）dPCR设计用于靶向并扩增保守基因序列，但本研究中dPCR所针对的具体基因在制造商文档中未予披露。然而，商用抗原检测试剂盒可能靶向不同的H. pylori抗原（例如VacA、尿素酶、鞭毛蛋白或全细胞抗原），若dPCR的靶基因与某一试剂盒所识别的抗原不匹配，则可能在散点图的四个象限中表现为定量上的不一致——即高dPCR/低抗原、低dPCR/高抗原、高-高一致或低-低一致，而不仅仅是简单的阳性/阴性二元差异18。3）检测方法的局限性：抗原检测技术受限于抗原浓度极低或极高时的情况，前者因与抗体结合亲和力不足导致信号减弱，后者则因信号过饱和，且该方法还受样本基质的影响。4）检测限性能的不对称性：dPCR的检测下限（LOD）可达10–100拷贝/mL，而胶体金免疫层析法对尿素酶的检测限约为104–105 CFU/mL。当细菌数量处于临界水平时，易出现“抗原低–核酸高”的现象。5）感染状态对临床结果的影响显著，尤其是在区分细菌性感染与病毒性感染方面。在感染过程中，基因拷贝数与抗原表达水平之间并不呈现恒定的对应关系。治疗成功后，核酸水平可能迅速下降，而抗原的清除则可能延迟一段时间19。
本研究中使用的细菌悬液来源于胃黏膜活检标本和粪便样本，代表了具有不同干扰特征的两种不同基质环境。胃黏膜活检来源的分离菌基本不含粪便相关的PCR抑制物，但在标本处理过程中可能受到残留胃蛋白酶的影响。相比之下，粪便标本含有PCR抑制物（例如胆盐、复杂多糖、血红蛋白降解产物），这些物质可能降低扩增效率，导致数字PCR定量结果偏低；此外还含有肠道蛋白酶，即使细菌DNA保持完整，也可能降解靶标抗原。这些基质特异性效应独立于上述靶区域错配机制，表明在解读不同临床标本间的定量差异时，应根据标本类型选择相应的样本制备方案和方法学验证策略。
为了实验性地量化热灭活后活菌与非活菌的比例，对全部24株培养分离菌株使用活力PCR试剂系统进行了活力PCR检测。该试剂的作用机制类似于叠氮单丙啶（propidium monoazide, PMA）：它可选择性地穿透细胞膜受损的细胞，并共价修饰其基因组DNA，从而阻断后续的扩增反应。活菌百分比通过以下公式计算：活菌% = （经活力试剂（VR）处理后的DNA拷贝数/µL）/（未经VR处理的DNA拷贝数/µL）× 100。在所有菌株中，热灭活后的中位活菌比例为4.6%（范围：0.00%–33.0%），证实我们采用的56 °C、25分钟热处理能显著降低细菌活力，但未能完全消除活菌。这些活力数据有力支持了我们的判断：高数字PCR信号与低抗原滴度不一致的结果，主要来源于残留的游离DNA以及非活细菌颗粒内的DNA，而非完整的活H. pylori。全部24株菌株的活力定量结果汇总于补充表2中。
本研究中，四象限分类法（基于探索性、数据集特异性阈值）显示，8个样本表现为高抗原-低核酸，4个样本属于低抗原-低核酸，另有9个为高抗原-高核酸和3个低抗原-高核酸的一致性类别。高抗原-低核酸样本的存在（n = 8）表明，即使在纯培养物中，抗原表达与核酸含量也并非始终一致。全部24株分离株均在静止生长期收获（培养72小时；参见方案第1节）。在静止期，DNA复制基本停止，而结构和代谢抗原仍持续存在甚至继续积累；这种生长阶段的解耦为高抗原-低核酸类别数量较多（n = 8）而低抗原-高核酸类别数量较少（n = 3）的现象提供了合理的生物学解释，尽管该机制本身不能排除其他因素，例如不同菌株间抗原表达的差异或热灭活过程中发生的部分裂解。低抗原-高核酸样本的存在（n = 3）证实，低抗原滴度并不必然对应低核酸载量，表明在特定情况下，核酸检测可作为抗原检测的有效补充。这些阈值为探索性和数据集特异性，不代表经过验证的临床诊断标准。
本研究受限于样本量较小（n = 24），导致统计效能不足，无法支持稳健的亚组分析。样本被分为六个滴度组，每组平均仅有4个样本，因此正式的组间比较缺乏足够的统计效能来检测有意义的差异。因此，未采用Kruskal-Wallis检验，以避免呈现统计效能不足的推论性统计结果。此外，所有样本均为培养分离株，未涵盖临床样本（如胃黏膜、粪便或唾液）中存在的更复杂的基质效应。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
本手稿的撰写、编辑、统计分析、代码开发和图表准备均未使用任何人工智能工具。
作者贡献：
所有作者均确认了各自对本工作的贡献。具体作者角色如下所列。所有作者均已阅读并批准最终提交的手稿，并对研究数据的准确性和完整性承担全部责任。Wenwen Sun：调查研究、数据管理、形式分析、方法学、撰写初稿、经费获取；Xiaona Han：调查研究、方法学；Jin Zhang：调查研究、方法学；Xinxin Duan：调查研究、方法学；Tingting Li：概念设计、监督指导；Manyu Li：概念设计、监督指导、撰写——审阅与修改；Haiwei Zhou：概念设计、监督指导、撰写——审阅与修改。
致谢
本研究由国家药品监督管理局药品研究所青年发展研究基金会 （NIDC）资助（项目编号：2025C5）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2X dPCR探针主混合液 Plus (Rox) | 狙击手 | RT021096A | 数字PCR定量检测试剂 |
| 细菌基因组DNA提取试剂盒 | 天根生化科技（北京）有限公司 | Y2213/DP302-02 | 细菌核酸提取 |
| Bio-Rad QX200 微滴数字PCR系统 | 江苏必达福科技有限公司 | QX200 | 数字PCR定量检测 |
| 数字PCR集成仪 | 狙击手 | DQ24 | 数字PCR定量检测 |
| 数字PCR集成仪 | 杭州优思达生物技术有限公司 | DQ24 | 数字PCR定量检测 |
| 数字水浴锅 | Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | DK-8D | 细菌悬液的热灭活处理 56 °C |
| 上游引物 | 上海桑谷生物医药有限公司 | / | 数字PCR核酸扩增 |
| 幽门螺杆菌胃抗原检测试剂盒（胶体金法） | 上海Chemtron生物科技有限公司 | B202301020 | 幽门螺杆菌抗原检测 |
| 幽门螺杆菌琼脂培养基（固体） | 青岛海博生物技术有限公司 | HB8647 | 幽门螺杆菌培养基 |
| 幽门螺杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法） | Bioneovan Co., Ltd. | 202403001 | 幽门螺杆菌抗原检测 |
| 幽门螺杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法） | 江苏默乐生物科学有限公司 | 20240310 | 幽门螺杆菌抗原检测 |
| 幽门螺杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法） | 杭州 Genesis 生物检测 & Biocontrol Ltd. | GG230601021 | 幽门螺杆菌抗原检测 |
| 幽门螺杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法） | 江苏科威生物科技有限公司 | 28223 | 幽门螺杆菌抗原检测 |
| 幽门螺杆菌抗原检测试剂盒（胶体金法） | 北京核心技术有限公司 | 2415810 | 幽门螺杆菌抗原检测 |
| 幽门螺杆菌抗原检测试剂（免疫层析法） | 广州万孚生物技术有限公司 | W028402001 | 幽门螺杆菌抗原检测 |
| 幽门螺杆菌抗原检测试剂（乳胶法） | ABON Biopharm (杭州)有限公司 | 0000805308 | 幽门螺杆菌抗原检测 |
| Heracell 三气培养箱 | 赛默飞世尔科技 | N/A | 微需氧培养；气体组成：5% O2、10% CO2、85% N2 |
| 微型离心管（1.5 mL / 2 mL） | Axygen Scientific Inc. | MCT-150-C / MCT-200-C | 样本稀释与核酸提取 |
| 核酸提取或纯化试剂 | 江苏必达福科技有限公司 | SDK60105 | 细菌核酸提取 |
| 核酸提取试剂 | TargetingOne | 病原体 TNA-B1 (11019) | 细菌核酸提取 |
| PBS，1×（pH 7.2–7.4，0.01 M，细胞培养用） | Solarbio 科学 & 科技有限公司 | P1020 | 样品稀释 |
| 培养皿（90 mm） | Beekman Biotech | N/A | 用于细菌分离与传代培养的无菌培养皿 |
| 移液器吸头（10 μL / 200 μL / 1000 μL） | Axygen Scientific Inc. | T-300 / T-200-Y / T-1000-B | 用于样品稀释和试剂分装的无菌过滤吸头 |
| 探针 | Sangon Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. | / | 数字PCR核酸扩增 |
| 反向引物 | 上海桑谷生物医药有限公司 | / | 数字PCR核酸扩增 |
| SPSSPRO 在线统计分析平台 | SPSSPRO | 基于网络的（https://www.spsspro.com/；访问于2026年8月） | 统计分析：Pearson 相关性，线性回归 |
| 无菌脱纤维绵羊血 | Solarbio 科学 & 有限公司 | TX0030-100 mL | 幽门螺杆菌培养平板补充剂 |
| TD-1 数字PCR系统 | TargetingOne | TD-1 | 数字PCR定量检测 |
| 活力 PCR 试剂系统 | Promega | A8881 | 热灭活幽门螺杆菌的活力PCR评估 |
| 涡旋混合器 | Scientific Industries Inc. | SI-0256 | 细菌悬液的均质化 |
参考文献
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