标准化制备离体兔十二指肠平滑肌 体外 药理学评估收缩活性

摘要

在此，我们介绍一种标准化制备分离兔十二指肠平滑肌的实验方案 体外 药理学评估，利用水平恒温平滑肌实验系统实时记录收缩活动数据。

摘要

胃肠道平滑肌的协调性收缩活动是维持正常消化、吸收和转运功能的生理基础，其功能障碍与运动障碍密切相关。离体器官灌流技术可消除复杂的 体内 干扰因素——如神经、内分泌和血流动力学因素——作为药理学研究的经典模型。为此，本研究详细阐述了一种标准化制备兔离体十二指肠平滑肌的逐步操作方案。该操作流程重点介绍了溶液配制、兔的安乐死、快速无菌正中腹切口开腹取组织、平滑肌条悬挂以及张力换能器校准以实现实时张力记录等关键步骤。基于该技术平台，我们进一步通过评价藿香正气口服液（HXZQ-OL）对自发性收缩及乙酰胆碱/氯化钡诱导的强直性收缩的影响，验证了该方法的有效性。综上所述，该方案提供了一种稳定且高度可重复的方法学框架，具有广泛的应用性 体外 用于评估靶向胃肠道动力治疗药物的药理学筛选平台

引言

胃肠道平滑肌的协调性收缩活动是维持正常消化、吸收和转运功能的生理基础¹其功能障碍与多种常见临床疾病密切相关，包括肠易激综合征²功能性消化不良³以及术后胃肠道动力障碍⁴阐明调控平滑肌活动的分子与药理学机制，对于开发新型促动力或解痉疗法至关重要。在该研究领域中，离体器官灌流技术是一种经典模型。该方法通过消除复杂的体内因素干扰，具有重要的实践价值 体内 神经、内分泌和血流动力学等因素的干扰，从而能够直接且精确地评估药物或活性物质对平滑肌张力的影响^5,6.

建立稳定且可靠的实验方案 体外 组织制备与数据记录对于获得可重复的高质量结果至关重要。现有的 体外 肠道肌肉实验方法在多个方面仍需进一步优化和标准化：实验动物的标准化管理、组织取材过程中的精细手术技术、灌流系统的稳定环境控制，以及与标准化分析相结合的自动化数据采集。例如，灌流液的温度和pH值、组织取材过程中造成的机械损伤以及组织预负荷的设定，均可能显著影响组织活性并引入实验误差。这些因素会降低实验结果的可靠性，并阻碍不同研究之间的可比性^7....

方案

选用健康成年新西兰大白兔（雌雄不限，体重2.0–2.5 kg）进行本研究。所有动物实验操作均遵循实验室动物护理与使用指南，并经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号：[2026070]）。所有努力均旨在尽量减少动物痛苦并减少使用动物数量。工作流程图见图1。

1. 溶液配制

注意：所有工作溶液，包括台氏液、乙酰胆碱（ACh）、氯化钡、阿托品和维拉帕米，均须在实验开始前新鲜配制。

1. 通过溶解 137 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、0.4 mM NaH₂PO₄、1.0 mM MgCl₂、12 mM NaH₂PO₄ 和 5.6 mM D-葡萄糖来配制 1 L 的台氏液。使用前用 95% O₂ / 5% CO₂ 混合气体饱和 15–30 分钟，并将 pH 调整至 7.3–7.4（参见 材料表）。
2. 配制 1 mM 乙酰胆碱（ACh）储备液。取 20 µL 加入 20 mL 台氏液中，充分混匀，得到 1 µM 的 ACh 溶液。
3. 配制 1 M 氯化钡（BaCl₂）储备液。取 20 µL 加入 20 mL 台氏液中，充分混匀，得到 1 mM 的 BaCl₂ 溶液。
   注意：BaCl₂ 具有....

结果

本实验方案描述了分离兔十二指肠肌条的标准化制备方法，以及利用离体器官灌流系统实时记录其动态张力和频率变化的过程。按照该方案，通过累积给药方式将HXZQ-OL依次加入盛有20 mL Tyrode's溶液的浴槽中，使其终体积浓度分别达到10、20、30、40和50 µL/mL。参照《中国药典》（2025年版）标准，这些浓度分别相当于生药切片浓度为6.6、13.2、19.8、26.4和33.0 mg/mL。在测试的最高HXZQ-OL浓度（33.0 mg/mL）下，Tyrode's溶液的pH值（7.37 ± 0.08）和渗透压（297 ± 4 mOsm/L）与对照组Tyrode's溶液（pH 7.38 ± 0.05；渗透压295 ± 3 mOsm/L；n = 3次独立制备；P > 0.05，Student's t-检验）相比无显著差异。这些结果表明，收缩张力的浓度依赖性降低并非由非特异性的pH或渗透压变化所致（图5A–C）。每次给药后，需待肠肌收缩反应达到稳定平台期，再加入下一浓度药物。为进一步验证HXZQ-OL对预收缩肠肌的舒.......

讨论

离体器官灌注与张力记录技术是研究平滑肌生理学与药理学的经典方法。这些技术所得结果对于阐明胃肠道运动障碍、血管疾病及子宫功能障碍的病理生理机制具有重要意义^12,13,14,15. 采用标准化的兔 离体 十二指肠模型显示，HXZQ-OL可诱导肠平滑肌呈浓度依赖性舒张。由于HXZQ-OL减轻了乙酰胆碱和氯化钡诱导的收缩反应，该结果与抑制胆碱能和钙依赖性收缩反应一致。^16,17,18然而，该器官浴槽实验方案并不能直接鉴定分子靶点（如M3受体或L型钙通道）；需要采用针对特定受体或通道的检测方法来验证这些作用机制。

本实验所采用的标准操作.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5-10 µL 移液器	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
10 µL 移液器吸头	LABSELECT	T-001-10
10 mL 容量瓶	四川蜀牛玻璃仪器有限公司	B-043804
100 mL 容量瓶	四川蜀牛玻璃仪器有限公司	B-043807
100-1000 µL 移液器	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
1250 µL 移液器吸头	LABSELECT	T-001-1250
20 mL 容量瓶	四川蜀牛玻璃仪器有限公司	B-010105
200 µL 移液器吸头	LABSELECT	T-001-200
50 mL 锥形离心管	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL 移液器	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
氯化乙酰胆碱	Supelco	PHR1546
一体化实验室计算机	联想	R5-3500U
硫酸阿托品	Macklin	A822893
氯化钡	Sigma-Aldrich	342920
氯化钙	Sigma-Aldrich	499609
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767
冰点渗透压仪	上海精密仪器有限公司	BS100
水平恒温平滑肌实验系统	成都仪器厂	DSQG-1
藿香正气口服液	太极集团有限公司	Z50020409
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
多通道生理信号记录与处理系统	成都仪器厂	RM6240XC
新西兰大白兔	邳州东方养殖有限公司（许可证号：SCXK[苏]2022-0004）	雌雄不限（体重 2.0–2.5 kg）
pH 计	上海雷磁	PHS-25
氯化钾	Sigma-Aldrich	P5405
聚维酮碘	H&H 医疗有限公司	3180132
精密天平（0.1 mg）	Sartorius	BCE64i
生理盐水溶液	H&H 医疗有限公司	100014438029
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6014
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888
磷酸二氢钠	Supelco	1063700250
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	P3761
盐酸维拉帕米	Macklin	V820460
涡旋混合器	麒麟-贝尔	XW-80A