标准化制备离体兔十二指肠平滑肌 体外 药理学评估收缩活性

摘要

在此，我们介绍一种标准化制备分离兔十二指肠平滑肌的实验方案 体外 药理学评估，利用水平恒温平滑肌实验系统实时记录收缩活动数据。

摘要

胃肠道平滑肌的协调性收缩活动是维持正常消化、吸收和转运功能的生理基础，其功能障碍与运动障碍密切相关。离体器官灌流技术可消除复杂的 体内 干扰因素——如神经、内分泌和血流动力学因素——作为药理学研究的经典模型。为此，本研究详细阐述了一种标准化制备兔离体十二指肠平滑肌的逐步操作方案。该操作流程重点介绍了溶液配制、兔的安乐死、快速无菌正中腹切口开腹取组织、平滑肌条悬挂以及张力换能器校准以实现实时张力记录等关键步骤。基于该技术平台，我们进一步通过评价藿香正气口服液（HXZQ-OL）对自发性收缩及乙酰胆碱/氯化钡诱导的强直性收缩的影响，验证了该方法的有效性。综上所述，该方案提供了一种稳定且高度可重复的方法学框架，具有广泛的应用性 体外 用于评估靶向胃肠道动力治疗药物的药理学筛选平台

引言

胃肠道平滑肌的协调性收缩活动是维持正常消化、吸收和转运功能的生理基础¹其功能障碍与多种常见临床疾病密切相关，包括肠易激综合征²功能性消化不良³以及术后胃肠道动力障碍⁴阐明调控平滑肌活动的分子与药理学机制，对于开发新型促动力或解痉疗法至关重要。在该研究领域中，离体器官灌流技术是一种经典模型。该方法通过消除复杂的体内因素干扰，具有重要的实践价值 体内 神经、内分泌和血流动力学等因素的干扰，从而能够直接且精确地评估药物或活性物质对平滑肌张力的影响^5,6.

建立稳定且可靠的实验方案 体外 组织制备与数据记录对于获得可重复的高质量结果至关重要。现有的 体外 肠道肌肉实验方法在多个方面仍需进一步优化和标准化：实验动物的标准化管理、组织取材过程中的精细手术技术、灌流系统的稳定环境控制，以及与标准化分析相结合的自动化数据采集。例如，灌流液的温度和pH值、组织取材过程中造成的机械损伤以及组织预负荷的设定，均可能显著影响组织活性并引入实验误差。这些因素会降低实验结果的可靠性，并阻碍不同研究之间的可比性^7,8.

因此，本研究旨在建立并详细阐述一种制备兔离体十二指肠平滑肌标本及进行实时张力记录的标准化操作流程。该方案系统描述了从实验动物伦理与福利、无菌开腹手术、精确肠段分离，到实现环境控制、标准化张力预负荷设置，以及利用集成式水平恒温灌流系统和多通道生理信号采集系统进行高保真数据采集的完整过程。基于这一标准化技术平台，我们进一步采用累积给药法，定量评估了符合《中国药典》（2025年版）⁹质量标准的藿香正气口服液（HXZQ-OL）对离体十二指肠平滑肌自发性收缩以及乙酰胆碱和氯化钡诱导的强直性收缩的影响。藿香正气口服液（HXZQ-OL）是经典中药方剂藿香正气散的口服剂型，在中国广泛用于治疗胃肠道功能紊乱，这为评价其对离体肠平滑肌的直接作用提供了合理依据。本研究不仅为阐明HXZQ-OL对胃肠道平滑肌的调节作用提供了直接的实验药理学证据，而且该实验方案本身也可作为胃肠道平滑肌药理筛选和体外组织研究的标准化、可重复的方法学模型。

方案

选用健康成年新西兰大白兔（雌雄不限，体重2.0–2.5 kg）进行本研究。所有动物实验操作均遵循实验室动物护理与使用指南，并经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号：[2026070]）。所有努力均旨在尽量减少动物痛苦并减少使用动物数量。工作流程图见图1。

1. 溶液配制

注意：所有工作溶液，包括台氏液、乙酰胆碱（ACh）、氯化钡、阿托品和维拉帕米，均须在实验开始前新鲜配制。

1. 通过溶解 137 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、0.4 mM NaH₂PO₄、1.0 mM MgCl₂、12 mM NaH₂PO₄ 和 5.6 mM D-葡萄糖来配制 1 L 的台氏液。使用前用 95% O₂ / 5% CO₂ 混合气体饱和 15–30 分钟，并将 pH 调整至 7.3–7.4（参见 材料表）。
2. 配制 1 mM 乙酰胆碱（ACh）储备液。取 20 µL 加入 20 mL 台氏液中，充分混匀，得到 1 µM 的 ACh 溶液。
3. 配制 1 M 氯化钡（BaCl₂）储备液。取 20 µL 加入 20 mL 台氏液中，充分混匀，得到 1 mM 的 BaCl₂ 溶液。
   注意：BaCl₂ 具有高毒性且具刺激性。操作时应在通风橱内佩戴个人防护装备，并按照相关规定处理废液。
4. 配制 10 mM 硫酸阿托品储备液。取 20 µL 加入 20 mL 台氏液中，充分混匀，得到 10 µM 的硫酸阿托品溶液。
5. 配制 1 mM 盐酸维拉帕米储备液。取 2 µL 加入 20 mL 台氏液中，充分混匀，得到 0.1 µM 的盐酸维拉帕米溶液。
   注意：所配制溶液的浓度参考了既往研究^6,10,11，并通过我们的预实验进一步优化，以确保最佳实验条件。

2. 准备 体外 兔十二指肠平滑肌标本

1. 兔安乐死
   1. 将兔固定于兔用固定装置中 (图2A、B和 图3A)。通过耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠（120 mg/kg）实施安乐死(图2C 和 图3B)。
      ​注意：必须通过以下标准确认死亡：瞳孔散大、瞳孔对光反射消失、呼吸和心跳停止、足底反射丧失。
2. 手术部位的准备与消毒
   1. 将兔仰卧位固定于手术台上(图2D 和 图3C)。使用手术剪(图2E)或电动剃毛器，彻底去除腹部毛发，以暴露预定手术区域的皮肤(图3D)。
   2. 使用海绵钳(图2E)夹取浸有碘伏的棉球(图2F、G)。从计划切口的中心开始，由内向外以同心圆方式涂抹消毒液(图3E)。
      注意：消毒范围应超出切口边缘，以确保整个手术区域皮肤完全覆盖。消毒后，至少等待3分钟，使消毒剂在皮肤表面自然干燥。
   3. 在已消毒的腹部区域覆盖无菌洞巾(图2H)，以暴露手术野(图3F)。
3. 腹部切口的定位与切开
   1. 使用手术刀（刀片#23）(图2E)，沿腹中线从剑突下方至耻骨联合上方做一条8 cm的纵向切口。
   2. 逐层分离皮肤及皮下组织。沿白线逐层切开腹直肌前鞘、肌纤维及腹膜，进入腹腔(图3G)。
   3. 注意：操作过程中应避免损伤腹腔器官，同时确保止血，防止血液污染手术野及腹腔器官。
4. 十二指肠分离
   1. 沿切口打开腹腔(图3H)。使用浸有生理盐水的纱布轻轻将肝叶向头侧牵拉(图2I)，充分暴露胃和十二指肠(图3I)。
   2. 选择距离幽门2–3 cm处的十二指肠起始段（球部或上降部）作为组织取材部位。
   3. 注意：应尽可能避免直接牵拉或夹持目标肠段，以减少机械性损伤。可使用钝头镊子轻轻夹持邻近肠系膜，或使用生理盐水湿润的棉签轻柔操作并定位组织。
   4. 使用无菌眼科剪(图2E)，快速而准确地切除一段1–2 cm(图2J)的十二指肠管状组织(图3J、K)。
   5. 立即将切除的肠段转移至含有预冷（4 °C）Tyrode溶液的培养皿(图2K)中，该溶液持续通入混合气体（95% O₂ / 5% CO₂）。
5. 肠段修剪、清洗与临时保存
   1. 使用眼科镊(图2E)，轻轻分离附着在肠壁上的肠系膜及周围脂肪组织。
   2. 使用装有冷Tyrode溶液的注射器（配备钝头针头）(图2L)，将灌肠液轻柔注入肠腔内。缓慢冲洗肠腔内部2–3次，彻底清除内容物。
   3. 将清洗后的肠段置于新鲜的充氧冷Tyrode溶液中临时保存，直至后续实验使用。

3. 水平恒温平滑肌实验系统启动与溶液灌注

1. 将台氏液加入 DSQG-1 水平恒温平滑肌实验系统的预热皿中(图 4B；参见材料表)。
2. 打开系统电源，触摸操作面板将浴槽温度设置为 37 °C，并开始预热(图 4C)。
3. 按下灌流按钮，系统将自动向浴槽中注入 20 mL 台氏液。
4. 按下排水按钮，将液体完全排入废液收集容器中。
5. 按下冲洗按钮，系统将自动完成先排空内容物再重新注液的过程。
6. 按下停止按钮，立即终止所有正在进行的灌流、排水和冲洗过程。
7. 按下充气按钮，系统将持续向浴槽中通入混合气体（95% O₂ / 5% CO₂）。将气体流速调节至5档，以确保后续实验中组织的充分氧合。
   注意：5档表示气体流速为 100 mL/min。过高的气体流速可能导致溶液湍流加剧，影响张力记录的稳定性。

4. 多通道生理记录与处理系统连接及软件操作

1. 将水平恒温平滑肌实验系统换能器的数据线连接到多通道生理信号采集处理系统的通道1上（图4D）。
2. 打开多通道生理信号采集处理系统的外接电源，启动计算机。双击桌面上的RM6240XC多通道生理信号采集处理系统图标以启动实验软件系统（参见材料表）。
3. 在菜单栏中选择实验 | 消化 | 肠道平滑肌生理特性，以加载相应的实验模块。
4. 设置以下参数：通道模式为张力，采样频率为400 Hz，灵敏度为1.5 g，时间常数为DC，滤波频率为30 Hz。
5. 点击软件界面右上角的开始按钮，开始实时信号采集与显示。点击记录按钮，可同时在示波器上显示信号，并将采集到的信号实时保存至硬盘。
6. 在菜单栏中选择实验 | 快速调零，将张力信号调整至基线水平。
   注意：如果信号偏离基线超过一个纵坐标单位，需使用螺丝刀手动调节张力换能器的零点。
7. 在菜单栏中选择实验 | 实时数据显示方式 | 浮动窗。在弹出的对话框中选择常规实时测量-快速t，以在浮动窗口中显示肠肌的实时张力数据。

5. 十二指肠肌条的悬浮与张力预负荷设定

1. 根据十二指肠肌条的长度，旋转水平螺钉旋钮调节组织钩的前后间距，确保其与肌条长度相匹配。
2. 保持肠段处于自然的圆柱形构型，并使视线与肠腔的圆形横截面开口对齐。
3. 使用眼科镊子轻轻牵拉肠管开口，以维持其通畅性。
4. 将组织钩的尖端轻轻插入肠腔内。
5. 在距肠缘2–3 mm处，用组织钩尖端从内向外穿刺上侧单层肠壁。
   注意：组织钩必须穿透肌层以确保牢固固定，避免仅浅层附着于浆膜层，从而防止在施加预负荷时钩子对肠壁造成机械性切割或撕裂。
6. 肠壁另一侧的操作与第一侧相同。确定平行对应的穿刺点后，仅在此处穿透单层肠壁 (图 3L)。
7. 再次旋转水平螺钉旋钮，调节钩子间距，确保十二指肠肌条保持自然松弛状态。
8. 通过调节一维微调装置逐步施加张力，直至十二指肠肌条的平均张力稳定在0.8 ± 0.1 g (图 4A)。
   注意：目视检查肠段全长，确保其保持平直且呈圆柱形，无扭曲、旋转或螺旋状皱褶。若不符合要求，应立即降低张力，并重新调整一端的固定点。
9. 实验开始前，将十二指肠肌条在灌流 chamber 中平衡60分钟。在此平衡期间，每15–20分钟更换一次新鲜的Tyrode's溶液，直至其自发收缩节律趋于稳定。
   注意：只有当分离的肠段连续至少15分钟表现出稳定的自发收缩活动时，才认为60分钟的平衡期完成。稳定性的客观标准定量定义如下：(1) 基线静息张力漂移 < ±5%；(2) 连续5分钟区间内平均收缩幅度的变异 < ±10%；(3) 收缩频率波动 < ±1 次/分钟。
10. 记录十二指肠肌条的自发收缩活动曲线，作为后续实验的基线参考数据。

6. 实验数据采集

1. 对于正在进行的实验，在菜单栏中选择 工具 | 分屏视图，以对采集到的波形数据进行实时统计分析。
2. 对于已存储的数据文件，点击工具栏中的 打开 按钮，选择扩展名为 .lsd 的已保存数据文件，加载历史实验记录。
3. 点击工具栏中的 测量 图标，选择 区域 模式。将鼠标光标移至波形区域，按住鼠标左键选择任意两个点，系统将显示一个数据面板，展示该区段内的平均张力值。
4. 点击工具栏中的 测量 图标，选择 周期 模式。使用鼠标左键沿波形依次点击五个连续且不同的波峰（峰值点）。点击鼠标右键后，数据面板将计算并显示收缩频率（单位：bpm）（补充图 S1）。

结果

本实验方案描述了分离兔十二指肠肌条的标准化制备方法，以及利用离体器官灌流系统实时记录其动态张力和频率变化的过程。按照该方案，通过累积给药方式将HXZQ-OL依次加入盛有20 mL Tyrode's溶液的浴槽中，使其终体积浓度分别达到10、20、30、40和50 µL/mL。参照《中国药典》（2025年版）标准，这些浓度分别相当于生药切片浓度为6.6、13.2、19.8、26.4和33.0 mg/mL。在测试的最高HXZQ-OL浓度（33.0 mg/mL）下，Tyrode's溶液的pH值（7.37 ± 0.08）和渗透压（297 ± 4 mOsm/L）与对照组Tyrode's溶液（pH 7.38 ± 0.05；渗透压295 ± 3 mOsm/L；n = 3次独立制备；P > 0.05，Student's t-检验）相比无显著差异。这些结果表明，收缩张力的浓度依赖性降低并非由非特异性的pH或渗透压变化所致（图5A–C）。每次给药后，需待肠肌收缩反应达到稳定平台期，再加入下一浓度药物。为进一步验证HXZQ-OL对预收缩肠肌的舒...

讨论

离体器官灌注与张力记录技术是研究平滑肌生理学与药理学的经典方法。这些技术所得结果对于阐明胃肠道运动障碍、血管疾病及子宫功能障碍的病理生理机制具有重要意义^12,13,14,15. 采用标准化的兔 离体 十二指肠模型显示，HXZQ-OL可诱导肠平滑肌呈浓度依赖性舒张。由于HXZQ-OL减轻了乙酰胆碱和氯化钡诱导的收缩反应，该结果与抑制胆碱能和钙依赖性收缩反应一致。^16,17,18然而，该器官浴槽实验方案并不能直接鉴定分子靶点（如M3受体或L型钙通道）；需要采用针对特定受体或通道的检测方法来验证这些作用机制。

本实验所采用的标准操作...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5-10 µL 移液器	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101004
10 µL 移液器吸头	LABSELECT	T-001-10
10 mL 容量瓶	四川蜀牛玻璃仪器有限公司	B-043804
100 mL 容量瓶	四川蜀牛玻璃仪器有限公司	B-043807
100-1000 µL 移液器	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101014
1250 µL 移液器吸头	LABSELECT	T-001-1250
20 mL 容量瓶	四川蜀牛玻璃仪器有限公司	B-010105
200 µL 移液器吸头	LABSELECT	T-001-200
50 mL 锥形离心管	LABSELECT	CT-002-50A
5-50 µL 移液器	Dalong Laboratory Instruments Co., Ltd.	7010101006
氯化乙酰胆碱	Supelco	PHR1546
一体化实验室计算机	联想	R5-3500U
硫酸阿托品	Macklin	A822893
氯化钡	Sigma-Aldrich	342920
氯化钙	Sigma-Aldrich	499609
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767
冰点渗透压仪	上海精密仪器有限公司	BS100
水平恒温平滑肌实验系统	成都仪器厂	DSQG-1
藿香正气口服液	太极集团有限公司	Z50020409
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
多通道生理信号记录与处理系统	成都仪器厂	RM6240XC
新西兰大白兔	邳州东方养殖有限公司（许可证号：SCXK[苏]2022-0004）	雌雄不限（体重 2.0–2.5 kg）
pH 计	上海雷磁	PHS-25
氯化钾	Sigma-Aldrich	P5405
聚维酮碘	H&H 医疗有限公司	3180132
精密天平（0.1 mg）	Sartorius	BCE64i
生理盐水溶液	H&H 医疗有限公司	100014438029
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6014
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888
磷酸二氢钠	Supelco	1063700250
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	P3761
盐酸维拉帕米	Macklin	V820460
涡旋混合器	麒麟-贝尔	XW-80A