将多能干细胞分化为原始类生殖细胞的方案

摘要

采用基于基底膜提取物覆盖的二维单层方法，逐步从人类诱导多能干细胞中稳健生成原始生殖细胞样细胞的指南。

摘要

体 外 使用人类多能干细胞分化极大地拓宽了对体内 早期发育中谱系指定事件的理解，这一阶段极具研究性。人类胚胎中最早指定的胚胎谱系之一是生殖细胞谱系，标志着原始生殖细胞（PGCs）的诱导。PGC是配子晚年唯一的创始群体，其规格是实现生物生殖能力的关键第一步。本文描述了一种稳健的从人类诱导多能干细胞（hiPSCs）生成PGC样细胞（PGCLCs）的方案，从初步评估hiPSC的多能状态和细胞特性开始，以确保PGCLC的有效分化。为此，讨论了不同细胞密度、板状涂层和用于PGCLC分化的hiPSCs的影响。最后，提供了利用免疫荧光和流式细胞术对hPGCLCs的表征和定量工作流程。分化方案重点关注大多数实验室中易于建立和测试的条件，并可根据需要进行调整。此外，该协议速度快，能够确定hiPSC是否适合PGCLC分化。该方案旨在促进hPGCLC在不同hiPSC系系和培养平台上的一致性和兼容性，确保强健的产率支持可靠表征，并进一步优化下游分化步骤，实现人体 体外 配子发生的成功。

引言

人类生殖系发育是一个高度协调的过程，始于胚胎早期发育，始于原始生殖细胞（PGCs）的指定，这些细胞最终形成卵母细胞和^精子细胞。在体内，PGC指定发生在着床^2,3后不久，响应邻近细胞^4,5的诱导信号。啮齿动物中PGCs的发育已被广泛研究，特别是通过遗传学研究，证明了信号通路如BMP、WNT和TGFβ 6,7,8,9的参与。按照指定，PGCs会经历表观遗传重编程，其特征包括全基因组DNA去甲基化和染色质重塑，随后确定（性别特异性）生殖系身份10,11,12,13,14。

在哺乳动物中，PGC规范由信号通路间的协调串扰驱动，某些方面在人类、非人灵长类、猪和小鼠中具有进化保守性，包括多能因子如POU5F1和NANOG ^{9,15,16,17,18}.尽管存在共同特征，但物种特异性PGC分化机制和基因调控网络的差异限制了动物模型向人类的直接翻译 9,19,20,21。

要理解人类配子发生，使用人体材料的研究是必要的，但由于早期人类胚胎的获取有限，研究仍然具有挑战性。能够体外分化人类原始生殖细胞样细胞（hPGCLCs）的方案不断进步，如诱导多能干细胞（hiPSCs），减少了对人类性腺组织的依赖，同时促进了放大和遗传学研究（^18,22）。大多数已建立的hPGCLC分化策略依赖于三维（3D）聚集体或胚胎体¹⁸。利用这些平台，多项研究表明hPGCLCs重现了早期人类PGCs的关键表观遗传特征，包括生殖系转录程序^23,24和全基因组DNA甲基化重编程²⁵。这些体外平台共同拥有显著的人类PGC生物学知识，包括谱系承诺和表观遗传重置。然而，基于聚合的hPGCLC分化方案仍具挑战性，因其耗时，且hPGCLCs在稳健表观遗传特征分析、进一步分化检测或高通量实验应用中的总产值仍然较低。

最近，一种基于单层的无送料法，利用稀释基底膜提取物（BMEx）结合低水平BMP4将hiPSCs分化为hPGCLCs，在组织培养板中推广相对容易，并在短分化窗口（5天）内实现高效率（~55%）²⁶。与其他需要在诱导前进行中间Activin A启动步骤且使用更高BMP4浓度（40–50 ng/^mL）的二维系统^相比，该BMEx方法无需前诱导步骤，使用较低的BMP4水平（10 ng/mL），同时保持相当的效率和更高的可扩展性。

这里提供了详细的分步骤指南，介绍了2D hPGCLC BMEx分化方案，首先是hiPSC维持的初步评估，包括多能性和细胞特性，随后测试不同hiPSC板层涂层和细胞密度对hPGCLC分化的影响。此外，还描述了通过流式细胞术分析和免疫荧光进行下游表征。提供关键操作点和故障排除指导，以减少实验室偏差，使研究人员能够在该二维格式中持续重现hPGCLC的分化结果。

方案

该方案遵循莱顿大学医学中心（LUMC）、LUMC生物样本库与生物材料（TCBio）以及莱顿高PSC中心（根据BB24.037）的指导方针和法规。本协议中使用的所有材料和对照雄性（XY）高多能干系（M54和M199）均列于 材料表中。所有组织培养程序均在专用的二级生物安全组织培养室内进行，配备加湿常氧培养箱（37°C，5%_CO2）、多功能台式离心机（摆斗转子）和带立体显微镜的二级生物安全柜。

注意：并非所有高压性高压细胞系都能分化为^hPGCLCs26,29。然而，如果PGCLC分化使用其他hiPSC且观察到PGCLCs，这里描述的方法（图1A）将允许放大hPGCLC的产生。

1. 为高多能干细胞培养的组织培养板涂覆

该方案描述了在组织培养板上涂覆稀释的BMEx和维隆内克素。

1. 基底膜提取物（BMEx）涂层
   1. 冰冻解冻一块BMEx。这可以是Geltrex、Cultrex或Matrigel。
   2. 将基底膜提取物的分度液在冷DMEM/F12中稀释至最终浓度1%（v/v），并轻柔地重新悬浮。
   3. 每孔将1毫升稀释的BMEx涂覆在6孔板的所需孔数。
   4. 将涂层平板在37°C下孵育至少30分钟。
      注意：涂层板可在2–8°C下保存长达一周。使用保存在2–8°C的涂层板时，应在37°C下孵育至少10分钟后再继续使用。
2. 维托内克素涂层
   1. 将一组维托内克素在室温（RT）下解冻10–15分钟。
   2. 将维吞内克稀释至无钙镁DPBS中的最终浓度5 μg/mL（DPBS -/-），并轻轻复悬。
   3. 在6孔板的目标孔数上，每孔涂1毫升稀释的维托内克素。
   4. 将涂层的6孔板在RT下孵育1小时。

2. 高多性干细胞（hiPSCs）维护通道

1. 制备培养基：无血清细胞培养基mTeSR Plus，辅以支原体污染预防液（MycoZap（1：1000））。
2. 从准备被传代的细胞中抽取培养基。
3. 向每个孔加入0.5毫升人PSC选择剂和传代剂（ReLeSR），并在1分钟内抽取。确保在细胞上留下非常薄的一层。
4. 在37°C下孵育6分钟。
5. 敲击6孔板的侧面几次。
6. 用p1000移液器上下移液，小心地用1毫升培养基分离细胞，并定期检查菌落片段大小，使其大小保持在50–200微米之间。
7. 取预涂的6孔板，去除涂层溶液（步骤1）。
8. 每个孔中加入2毫升培养基。
9. 将含有分离高多能干细胞（hiPSCs）菌落片段的培养基以所需比例转移到新孔中。
   注意：理想的HiPSC菌落片段分离比例为1：6-1：50，允许每4至7天传代一次。
10. 将携带过代的 HiPSCs 菌落片段的细胞培养板放入加湿的常氧培养箱（37 °C，5% CO₂）。
11. 每隔一天用2毫升培养基刷新培养基，直到hiPSC准备好再次传代。
    注意：每个6孔中添加4毫升培养基，避免周末需要刷新。
    注意：当汇聚度过低时不要转代hiPSCs，当汇聚度过高以维持健康的HiPSC培养并避免自发分化时，应丢弃培养物。

3. hPGCLC分化

1. hPGCLC分化前的准备（第0天）。
   1. 在开始hPGCLC分化前，先刷新hiPSC培养基1小时。
   2. 准备涂层溶液：1% BMEx溶液，在冷DMEM/F12中稀释v/v。
   3. 用0.5毫升涂层溶液涂覆12孔板所需的孔数。
   4. 在开始分化前，将涂层板在37°C下孵育至少30分钟。
   5. 准备培养基：2%（v/v）BMEx溶液，冷培养基中，并补充解冻后回收培养基（RevitaCell）（1：100）。
      注意：在准备和包丁HiPSCs时，将培养基冰藏保存。
2. hPGCLC分化的hiPSC涂板（第0天）。
   1. 从含有hiPSC的6孔中取出培养基，用于hPGCLC分化。从高质量的高PSCs开始，保持50–80%的汇聚率，且无自发分化迹象。
   2. 每孔加入1毫升胰蛋白酶溶液（TrypLE）。
   3. 在37°C下培养高能干细胞5分钟。
   4. 通过用p1000移液器小心地将hiPSCs菌落重新悬浮2–3次，制作单细胞悬浮液。
   5. 在倒置显微镜下检查是否获得单细胞悬浮液。如果不行，用p1000移液器再将hiPSCs菌落再休眠1–2次。
   6. 将高多能球细胞悬浮液转移到15毫升管上。
   7. 将4 mL DMEM-F12培养基加入15 mL管。
   8. 将高多能干细胞悬浮液以200 x g 离心5分钟。
   9. 抽取上清液，并小心将高多能干细胞重新悬浮于0.5–1.0毫升的装平培养基中。
   10. 使用细胞计数器或血细胞计HiPSC数量，并计算hPGCLC分化每孔所需的hiPSC数量。
       注意：起始点可使用40–80K电池/^平方 厘米的电镀密度。然而，对于每个细胞系和每个传代号，建议进行板化密度优化以实现最佳产率。这里，hiPSCs被以10K至100K细胞/cm^²的板密度进行板化。
   11. 小心地将所需数量的hiPSCs重新悬浮在适当体积的镀金介质中（12孔板每孔1毫升），并确保使用p1000移液器获得均匀的细胞悬浮液。
   12. 从培养箱取出涂层的12孔板，去除涂层溶液。
   13. 向12孔板的每个孔加入1毫升细胞悬浮液。
   14. 小心摇晃板子，确保细胞在井中均匀分布。
   15. 将12孔培养板放入加湿的常氧培养箱（37°C，5%_CO2）中，浸泡16至24小时。
3. hPGCLC分化（第1–2天）
   1. 制备RB27基础培养基：高级RPMI160，含B-27（1：100）、1x氨基酸替代（Glutamax）、1xMEM非必需氨基酸和防止支原体污染溶液（1：1000）。
   2. 制备分化培养基：将2%（v/v）BMEx溶液置于冷的RB27基础培养基中，加入BMP4至最终浓度10 ng/mL。基底膜提取物对于诱导腔生成和在 体内触发PGCLC指定是必需的。
      注意：分化培养基应冰敷或保持在4°C。 分化培养基可在分化协议的第一天和第二天准备。
   3. 在第1天（在装甲hiPSC后16–24小时内），取出培养箱中的板并取出装甲介质。
   4. 每孔添加0.5毫升RB27基底培养基，对孔进行清洗。
   5. 抽取RB27基础培养基，每孔加入1毫升分化培养基。
   6. 将带细胞的平板放回加湿的常氧培养箱（37°C，5%_CO2）。
   7. 分化第2天，每孔用1毫升分化培养基刷新细胞。
4. hPGCLC分化（第3–5天）
   1. 制备换培养基：RB27基础培养基，补充BMP4（10 ng/mL）、LIF（10 ng/mL）、SCF（50 ng/mL）和EGF（50 ng/mL）。切换培养基反映了体内从hPGC规格转向生存和增殖 的过程。 BMEx被省略，因为已不再需要发声生成。
   2. 第3天和第4天，分别用1毫升换培养基刷新每个井。
   3. 分化第5天，hPGCLCs可通过免疫荧光或流式细胞术进行鉴定。

4. 通过免疫荧光和流式细胞术对hPGCLCs的表征

1. 免疫荧光表征。
   1. 制备渗透溶液：0.3% Triton X-100，稀释于PBS。
   2. 准备洗涤液：0.05% Tween 20 in PBS（PBST）
   3. 制备阻断液：1%牛血清白蛋白（BSA）在PBST中。
   4. 去除用于hPGCLC分离的孔中的切换介质。
   5. 用每孔1毫升DPBS（-/-）清洗细胞。
   6. 用每孔1毫升4%对甲醛（PFA）在PBS中固定细胞，浸泡15分钟，置于RT下。
   7. 用PBS清洗细胞3次，每次5分钟，每孔使用1毫升。
      注意：此时，板材可在开始免疫荧光前保存4°C。
   8. 用渗透溶液在RT下通透细胞15分钟，每孔使用1毫升。
   9. 用洗涤液清洗细胞3次，每次5分钟，每孔使用1毫升。
   10. 用阻断液在RT下阻断细胞1小时，每孔使用1毫升。
   11. 制备初级抗体溶液：稀释感兴趣的一级抗体以阻断溶液。
       注：本文使用了两种PGC标记抗体组合：山羊抗SOX17和兔抗TFAP2C，以及山羊抗SOX17和小鼠抗POU5F1（材料表）。
   12. 去除阻断溶液，每孔加入0.4毫升初级抗体溶液，并在4°C下过夜培养。
       注意：包含阴性对照组以评估非特异性抗体结合非常重要。为此，先在阻断液中浸泡一口，去除一级抗体，然后用二级抗体溶液染色该层。
   13. 第二天，去除初级抗体溶液，用PBST清洗细胞3次，每次5分钟。
   14. 制备二级抗体溶液：稀释感兴趣的二级抗体（材料表）和DAPI（1：500）在阻断溶液中。
       注意：次级抗体溶液对光敏感，应放在黑暗中。
   15. 去除PBST，并在黑暗下RT下每孔加入0.4毫升二级抗体溶液1小时。
   16. 用PBS清洗细胞3次，每次5分钟，每孔使用1毫升。
   17. 做细胞成像（20倍物镜）。
       注：免疫荧光图像使用Airyscan显微镜的20倍物镜拍摄，明场图像则使用4倍物镜和EVOS显微镜的10倍物镜拍摄。
2. 通过流式细胞术进行表征
   1. 准备FACS缓冲区：DPBS中0.5% BSA（-/-）
   2. 用hPGCLCs从井中移除开关培养基。
   3. 用1 mL DPBS（-/-）清洗细胞。
   4. 每孔加入0.5毫升预热的Accutase，并在37°C下孵育15分钟。 对于解离，Accutase优于胰蛋白酶溶液，因为hPGCLCs对解离极为敏感。
   5. 通过小心地用p1000重新浮起电池2–3次，制作单电池悬浮液。
   6. 在倒置显微镜下检查是否获得单细胞悬浮液。如果不行，再用p1000移液器将细胞重新悬浮1–2次。
   7. 将细胞悬浮液过滤至15毫升管中，过滤40微米滤网。
   8. 用5毫升FACS缓冲液清洗40微米滤网。
   9. 将细胞悬浮液以300 x g 离心5分钟。
   10. 去除上清液。
   11. 将细胞沉淀重新悬浮于0.3 mL FACS缓冲液中，置于1.5 mL管中。
       注意：可选择使用细胞计数器或血细胞计计数。如果计数这些细胞，预计每槽约有100万个单元，而12孔板则有。
   12. 准备足够的对照样本进行流式细胞术（未染色和单染色对照）。为此，将15–30微升细胞悬浮液转移到1.5毫升管中，并注入FACS缓冲液至100微升。
       注：本研究制备了3种单染色：EPCAM-PEcy7（1：200）、ITGA6-BV421（1：200）和7AAD（1：200）。含有结合抗体和7AAD的溶液对光敏感，应放在黑暗中。
   13. 将感兴趣的结合抗体直接加入细胞悬浮液中，以实现足够的稀释效果。这里，以下结合的PGC标记抗体被使用：EPCAM-PEcy7（1：200）和ITGA6-BV421（1：200）（材料表）。
   14. 将细胞与结合抗体一起在黑暗中冰上孵育30分钟。
   15. 向样品、未染色对照组和单抗体对照组加入1毫升FACS缓冲液，并以300 x g 离心5分钟。
   16. 去除上清液。
   17. 将样品重新悬浮于0.5 mL，对照样品则以含1 mM EDTA的FACS缓冲液0.2 mL再悬浮。这防止细胞聚集。
   18. 将样品和对照加入带有细胞过滤盖的5毫升FACS管中，然后通过过滤。
   19. 在用流式细胞仪测量前几分钟，直接向每个样品添加7AAD。
   20. 使用流式细胞仪测量样本。这里使用了基于荧光的细胞分析仪测量样品，数据使用FACSDiva软件（v9.0）收集，FlowJo软件（v10.10.0）用于分析数据。
   21. 使用对照样本（未染色和单抗体对照）来设置门控策略，并在必要时进行补偿。
   22. 在放入机器前先对样本进行漩涡处理。
   23. 首先根据面积[前向散射面积（FSC-A）和侧散射面积（SSC-A）]设置门，从所有事件中提取细胞群。
   24. 从该细胞群中，根据大小[FSC-宽度（FSC-W）和FSC高度（FSC-H）]和颗粒[SSC-W和SSC-H]提取单细胞。
   25. 通过设置7AAD阴性细胞门，排除死细胞进行进一步分析。
   26. 用样品检查门阀是否正确设置，必要时调整。
   27. 分析该活细胞群体的关注标记。其中，EPCAM和ITGA6的门控细胞阳性对应hPGCLCs。

结果

hiPSCs的质量和稳定状态对于进一步区分非常重要
在分化实验和分析之前，hiPSC在6孔板中至少维持了3次通道（不同涂层中）。当细胞菌落达到70–80%的汇聚度时，hiPSC被传递（见图1B），这也是启动hPGCLC分化的最佳HiPSC汇聚点。健康的高多能干细胞培养物在明场图像中显示出均匀的群体形态，无暗区或分化区域（见图1B）。然而，当细胞菌落未保持最佳汇聚或出现分化迹象时，hiPSCs的质量受到影响（见图1B）。在低汇合点，hiPSC继续增殖，群体形成需要更多时间，直到汇聚点适合进行传代或分化实验。在高汇聚时，hiPSC层叠生长，同时出现分化区域。hiPSCs的多能状态通过SOX2或POU5F1的表达得到确认，这两种转录因子对于维持^hiPSCs的多能性和自我更新至关重要，且最重要的是，hPGCLCs31不表达SOX2。采用Phalloidin染色评估细胞骨架组织和菌落形态，以指示hiPSCs的质量。注意，细胞形态差异与SOX2或POU5F1的还原有关（见图1B）。

高多能干细胞维持底物对hPGCLC分化的影响
为评估在不同涂层底物上维持hiPSC是否影响hPGCLCs的分化，对不同底物（Geltrex、Matrigel、Cultrex和维隆内克素）进行了hiPSCs培养（见图2）。在所有底物上，hiPSCs均表现出强健且均匀的核SoX2或POU5F1水平，表明其多能状态。在Geltrex、Matrigel和Cultrex上维持的hiPSC菌落形态相似，包括明显的菌落边界和不规则的整体菌落形状，与维坦内克素上的圆形菌落相较（见图2）。达到70–80%汇聚度的hiPSC被以40K细胞/^cm² 的密度进行板化，并在Geltrex²⁶上分化为hPGCLCs。第5天，明场图像显示所有条件下均有典型的hPGCLC菌落（见图3）。此外，在所有条件下均鉴定出三阳性SOX17/TFAP2C/PDPN或双阳性SOX17/POUF51 hPGCLCs（见图3）。这表明分化方案可以在不同条件下培养的 HiPSCs 上使用。

初始高多能干细胞密度对hPGCLC分化的影响
在Geltrex上，检查最佳种子密度对于hPGCLC的最佳分化非常重要，因为不同的hiPSC增殖速率不同。此外，如果随着 hiPSC 持续传递，hPGCLC 分化效率下降，建议调整 hiPSC 播种细胞密度。为评估播种细胞密度对hPGCLC分化效率的影响，hiPSCs以不同密度播种，从10K到100K细胞/cm^² （见图4A）。第5天，通过流式细胞术使用两种不同的结合抗体EPCAM和整合素α6（ITGA6）³²，评估hPGCLCs的百分比。流式细胞术分析遵循标准的序列门控策略，该策略适用于以40K细胞/^cm² 种子的M199高能干细胞（见图4B）。简而言之，对总细胞群体（所有事件）进行了门控以排除碎屑（颗粒面积），然后根据大小（FSC）和颗粒度（SSC）选择单细胞，最后根据7AAD染色排除死细胞。随后，通过染色和未染色样本设定表达EPCAM-cy7和ITGA6-BV421细胞的定量门槛（见图4B）。

比较不同种子密度和在不同底物上培养的hiPSC的hPGCLC分化效率，显示出密度依赖的趋势（见图4C）。在20–40K细胞/^cm2的种子密度下，M54和M199高能干细胞表现出最高比例的EPCAM+/ITGA6+双阳性hPGCLCs，这些均来自Geltrex和Cultrex上的hiPSCs。有趣的是，密度越高，分化效率越低。使用PGC标记SOX17/TFAP2C/PDPN或SOX17/POUF51对hPGCLCs进行免疫荧光检测，验证了流式细胞术结果（见图4D）。这些结果表明，调整播种密度以适应特定的hiPSCs对于获得最佳分化效率非常重要。结合免疫荧光和流式细胞术增强了hPGCLC分化分析的稳健性。

图1：hPGCLC的分化工作流程及hiPSC质量。 （A） 本研究所用工作流程的示意图。hiPSCs在培养基中保持，分化当天（第0天，D0）达到60–80%的合流率。在D0中，hiPSCs被解离为单细胞，并以所需的播种密度（在培养基中）进行机密化。次日，细胞先用分化培养基（D1–D3）处理，随后交换培养基（D3–D5）。在D5上，hPGCLCs被用于免疫荧光或流式细胞术。（B）明场图像（顶排——4倍放大）;免疫荧光用于SOX2染色、PHALLOIDIN染色和DAPI染色（中排）;以及POU5F1、PHALLOIDIN染色和DAPI染色（下排）显示了不同的聚合度高中干细胞。比例杆=50微米。图1A中的图纸由作者使用Adobe Illustrator中的基础绘图工具制作;没有使用任何付费软件或工具。因此，不需要版权许可。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：各种涂层基底在高多能糖浆培养过程中的影响。 明场图像（顶排）;免疫荧光用于SOX2染色、PHALLOIDIN染色和DAPI染色（中排）;以及POU5F1、PHALLOIDIN染色和DAPI染色（下排），显示hiPSC在不同涂层基底上培养。比例杆=50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：多种涂层底物在高多能干细胞培养过程中对hPGCLC分化的影响。 明场图像（顶排10倍放大）;免疫荧光用于SOX17、TFAP2C、PDPN和DAPI染色（中排）;以及在第5天进行hPGCLCs分化的POU5F1、SOX17和DAPI染色（下排），使用Geltrex，从不同涂层基底培养的hiPSCs开始。黄色虚线突出显示含有hPGCLCs的区域。比例杆=25微米（上排）和50微米（中排和下排）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：hiPSC种子密度对hPGCLC分化的影响。 （A）使用不同hiPSC播种密度（40K细胞/cm^²、60K细胞/平方厘米、80K细胞^/cm²）进行hPGCLCs分化的第1天（D1）和D3明场图像。比例尺 = 250微米，4倍放大。（B）代表性流式细胞术图，展示量化EPCAM+/ITGA6+ hPGCLCs百分比的门控策略。为此，使用了M199 hiPSCs（在Geltrex上），种子密度为40K细胞/^平方厘米。（C）条形图，显示使用hiPSCs（M199和M54）在不同涂层上培养并以不同密度播种时，EPCAM+/ITGA6+ hiPGCLCs在D5的百分比。（D）免疫荧光检测SOX17、TFAP2C、PDPN和DAPI染色（左侧面板）;以及使用hiPSCs（M199和M54，Geltrex）在40K和80K细胞/平方厘米处播种的hPGCLCs分化D5处SOX17、POU5F1和DAPI染色（右侧面板）。比例杆=50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

体外配子发生是一个强大的实验平台，用于在受控培养条件下、患者特异性基础下研究人类生殖系发育、生殖毒性和不孕症。尽管已有多种用于区分hPGCLCs与高多能干细胞的方案报告，^但该领域的进展因实验室中标准化、可扩展且可重复的方法有限而受阻。近期研究描述了简化高效的hPGCLC诱导方法，包括基于BMP4的微图案分化²⁷，一种快速的二维单层平台，使hPGCLC能在3.5天内生成，²⁸，以及模拟着床周发育和旁分泌生态位信号的三维培养系统³³。尽管这些协议高效支持hPGCLC的差异化，但仍不足以作为高通量平台。为了使基于hPGCLC的研究具有广泛适用性，尤其是在生殖毒理学筛查方面，相关方案必须稳健、技术可及，并且与后续定量检测兼容。本文将对hPGCLCs的BMEx分化协议进行逐步分析，重点介绍决定可重复性和性能的关键技术参数。

成功分化的一个重要决定因素是高多能细胞的初始多能性状态。传代数、细胞健康、品系特异性特征及分化前培养条件都会影响hPGCLC的分化结果。在 hiPSC 维持阶段，可以关注涂层底物、播种细胞密度和培养板格式，这些共同定义了 hPGCLC 分化初期的菌落结构和信号环境。本研究展示了使用hiPSC在不同涂层和不同种子密度上培养对hPGCLCs分化（针对Geltrex）的影响。这里测试的两种hiPSC系在20,000–40,000细胞/cm^² 的播种密度下均显示出最大分化效率。这凸显了在引入新细胞系、延长传代后，或改变实验布局或培养板格式时，确定最佳播种密度的必要性。即使是表面面积与体积比或生长动力学上的看似微小变化，也可能需要优化以保持高分化效率。因此，建议用户先进行小规模的先导实验，以确定hPGCLC分化的最佳条件。

尽管方法稳健，但应当承认其局限性。虽然与多种涂层和密度相容，但分化效率仍受 hiPSC 固有特性敏感，包括表观遗传状态和传代历史，这些特性难以完全控制。若干检测的HiPSCs似乎无法分化为hPGCLCs26。最重要的是，与维托内克素是完全定义的产品不同，BMEx是动物衍生产品，批次间存在差异，这可能影响重复性。尽管此前对不同批次的Matrigel、Cultrex和Geltrex进行了测试并结果一致，^但这一问题仍是一个隐忧，应考虑完全定义的BMEx替代品，以确保未来的可重复性和可转移性。本研究中使用了两条雄性（XY）hiPSC系，但该方案已在雌性（XX）和雄性（XY）²⁶系上测试。最后，虽然该方案产生了hPGCLCs，已被证明在转录上与hPGCs相似且具备进一步发展能力^26,34，但此处未涉及生殖细胞后期阶段的进一步成熟。尽管筛选式应用已证明可扩展性，但基于自动化的适应和跨实验室验证将进一步强化转化应用。

相较于现有的hPGCLC区分策略，该协议具有多项优势。与高度专业化或基质限制方法不同，它兼容常用的高多能干细胞（hiPSC）维护底物和培养板格式，从而降低了技术障碍。对密度优化和早期质量控制的重视进一步提升了体 外 配子发生领域的持续挑战。

这里描述的方法论框架对于生殖毒理学、不孕不育建模和发育生物学尤为相关。其与可扩展格式的兼容性使化合物筛选能够实现中高通量，同时其可重复性支持跨研究比较和协作联盟的工作。更广泛地说，系统性地标准化hPGCLC诱导方案在各实验室间，比较表征和功能终点^18,35，对于推动体外配子发生向预测性人体相关平台的推进至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7AAD活力染色溶液	BioLegend	420403	稀释1:200
Accutase	STEMCELL Technologies	7920
高级RPMI 1640培养基	Gibco	12633012
Alexa Flour 488山羊抗小鼠IgG	Invitrogen	A21202	稀释1:500
Alexa Flour 594山羊抗兔IgG	Invitrogen	A21207	稀释1:500
Alexa Flour 647山羊抗山羊IgG	Invitrogen	A21447	稀释1:500
Alexa Fluor Phalloidin 594	Invitrogen	A12381	稀释1:400
Alexa Fluor Phalloidin 647	Invitrogen	A30107	稀释1:400
抗CD49f（ITGA6）抗体，Brilliant Violet 421	Biolegend	313624	稀释1:200
抗CD326（EPCAM1）抗体，PE/Cyanine7	Biolegend	324222	稀释1:200
抗SOX2抗体，兔多克隆	Merck	ab5603	稀释1:200
抗SOX17抗体，山羊多克隆	R&D Systems	AF1924	稀释1:500
抗OCT3/4（POU5F1）抗体，小鼠单克隆	Santa Cruz Biotechnology	SC-5279	稀释1:200
抗Podoplanin（PDPN）抗体，小鼠单克隆	Abcam	ab256561	稀释1:200
抗AP-2γ（TFAP2C）抗体，兔多克隆	Cell Signaling Technology	2320S	稀释1:300
B-27补充剂，无血清	Gibco	17504044	稀释1:100
BD FACSCanto	BD Biosciences		流式细胞术设备
BD FACSDiva软件版本9.0	BD Biosciences		软件
牛血清白蛋白（BSA），V级	Roche	10735086001	溶解于PBST
CELLSTAR 12孔细胞培养板	Greiner	665180
CELLSTAR 15 mL管	Greiner	188271
CELLSTAR 6孔细胞培养板	Greiner	657160
Corning 40微米细胞过滤器	Corning	431750
Cultrex干细胞合格，减少生长因子基底膜基质	R&D systems	3434-101-02	稀释至冷DMEM-F12
DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）	Invitrogen	D3571	稀释1:500
DMEM:F12，GlutaMAX补充	Gibco	31331028
DPBS，无钙，无镁	Gibco	14190144
EVOS M5000	Invitrogen		成像设备
EVOS M5000软件版本1.3.660.548	Invitrogen		软件
Falcon 5 mL圆底聚苯乙烯试管，带细胞过滤器快拆盖	Corning	352235
FlowJo软件版本10.10.0	BD Biosciences		软件
Geltrex减少生长因子基底膜基质，LDEV-Free，干细胞合格	Gibco	A1413302	稀释至冷DMEM-F12
GlutaMAX补充	Gibco	35050061	稀释1:100
FlowJo软件版本10.10.0	BD Biosciences		软件
Geltrex减少生长因子基底膜基质，LDEV-Free，干细胞合格	Gibco	A1413302	稀释至冷DMEM-F12
GlutaMAX补充	Gibco	35050061	稀释1:100
hiPSCs M54	LUMC hiPSC核心设施	LUMC0054iCTRL03	hiPSCs可在申请MTA后分发
hiPSCs M199	LUMC hiPSC核心设施	LUMC0199iCTRL01	hiPSCs可在申请MTA后分发
LUNA-II自动细胞计数器	Logos Biosystems		细胞计数设备
LUNA-II软件版本2.3.5	Logos Biosystems		软件
Matrigel hESC-Qualified Matrix，LDEV-free	Corning	354277	稀释至冷DMEM-F12
MEM非必需氨基酸溶液	Gibco	11140050	稀释1:100
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
MycoZap Plus-CL	Lonza	VZA-2011	稀释1:1000
甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich	1040051000	先溶解至水中的8% PFA；然后用0.2 M磷酸盐缓冲液稀释至4%（1:1）
PIPETMAN P1000，100-1000微升，金属弹出器	Gilson	F144059M
PIPETMAN P200，20-200微升，金属弹出器	Gilson	F144058M
PIPETMAN P10，1-10微升，金属弹出器	Gilson	F144055M
重组人BMP4，CF	R&D Systems	314