利用口内扫描对拔除的人类前磨牙进行残余牙周膜的非破坏性三维定量分析

摘要

本方案详细介绍了一种非破坏性、定量的三维数字化方法，用于评估拔除牙齿上残留的牙周膜。通过使用口内扫描和逆向工程软件，我们建立了一种离体牙周评估的工作流程，为临床前研究中比较不同拔牙技术提供了方法学基础。

摘要

意向性牙再植术是保留伴有牙髓病变的天然牙的一种有效治疗方法。其成功与否关键取决于残留牙周膜（PDL）的活性与结构完整性。传统的评估方法，如组织学切片或二维摄影，或具有破坏性，或受限于投影误差。为克服这些局限性，本方案提出一种基于高精度口内扫描的非破坏性、定量评估残留PDL的方法。将拔除的牙齿进行染色以可视化PDL组织，并进行三维扫描以生成高保真数字模型。利用逆向工程软件对数据进行分析，定义感兴趣区域，并通过颜色阈值法量化残留PDL的覆盖面积。该方法可在不破坏生物样本的前提下，准确计算PDL的真实三维覆盖面积。为评估本方案的敏感性与实用性，将其应用于比较使用牙周膜分离器的微创（MI）拔牙术与传统镊拔牙术。数字化分析显示，MI方法保留的PDL组织显著更多（61.99%），优于传统方法（50.46%）。此外，后续的细胞活性检测结果进一步验证了数字化分析结果，表明MI组具有显著更高的代谢活性。本研究最终建立了一种ex vivo定量评估PDL的概念验证工作流程，为临床前研究中不同拔牙技术的比较提供了坚实的方学基础。

引言

意向性牙再植术 increasingly recognized as a viable, last-resort treatment modality for preserving natural teeth that would otherwise be deemed hopeless. 它适用于处理持续存在的根尖周病变、无法通过非手术方法治疗的难以接近的根管穿孔，或广泛的吸收性病变^1,2。标准操作步骤包括：将患牙拔除，进行牙体脱位后的直视检查，实施治疗性干预（包括根尖切除、根尖预备和根尖充填），随后将牙齿重新植入原来的牙槽窝中^1,2。

根面残留牙周膜（PDL）组织的存在及其完整性是决定牙齿再植后愈合模式的最关键预后因素^3,4。健康的完整PDL屏障对于恢复生理性动度以及预防替代性吸收（牙根固连）或炎症性牙根吸收等并发症至关重要。然而，无论是创伤性还是医源性导致的牙齿脱位，均会破坏牙周膜纤维的附着，并切断其神经血管供应⁵。因此，PDL的生物学重建对于再植牙的牙周组织愈合至关重要

方案

该研究方案遵循北京大学口腔医学院伦理委员会（PKUSSIRB-202054022）的指南进行。

1. 患者选择与分组

1. 选择因正畸需要拔除前磨牙的患者。确保前磨牙符合纳入标准，无龋齿或牙周病。
2. 排除患有高血压、糖尿病、吸烟史，或年龄小于16岁或大于45岁的患者。
3. 将前磨牙随机分配至两个实验组：对照组（传统拔除）和微创组（牙周膜刀辅助拔除）。
4. 将每组中的牙齿随机分配至三维扫描分析路径或生物学验证（CCK-8）路径，确保每种评估方法使用独立样本。

2. 拔牙操作步骤

1. 所有拔牙操作均应在标准局部麻醉下进行。
2. 方法A：传统拔牙术（对照组）
   1. 在牙颈部周围进行牙龈分离。
   2. 将拔牙钳置于牙冠颈部区域。
   3. 施加旋转力，直至牙齿松动，然后用拔牙钳将牙齿从牙槽窝中取出。
3. 方法B：微创拔牙术（MI组）
   1. 进行牙龈分离。
      注意：操作牙周膜分离器时需小心，避免软组织损伤或器械折断。
   2. 将牙周膜分离器尽可能深入地插入牙周膜间隙，深度至少达到根长的三分之二。

结果

本研究建立的实验流程成功验证了一种对拔除牙齿上残留牙周膜进行定量评估的非破坏性方案。如实验设计所示（图1），该方案结合了临床拔牙操作、数字化采集与生物学验证。通过应用口内数字化扫描，继而进行三维逆向工程，实现了对牙根表面的精确重建（图2）。数字模型基于颜色阈值区分染色的牙周膜组织与暴露的牙根表面，且感兴趣区域（ROI）排除了牙龈和根尖部位的变异，以聚焦于功能牙根表面的分析。

三维数字化分析揭示了两种拔牙方法之间残留牙周膜（PDL）的显著形态学差异，为该方案的敏感性提供了定量证据（图3A、B）。在微创（MI）组中，残留的PDL组织通常表现为致密的网状或大片斑块状分布，覆盖了大部分牙根表面。相比之下，对照组的残留PDL主要呈孤立点状或碎片状分布，暴露的牙根表面区域明显更大，尤其是在舌侧部位。两组之间的牙根总表面积具有可比性（MI组：137.0 ± 24.17 mm^2.......

讨论

意向性再植的成功在很大程度上依赖于牙根表面存活的牙周膜（PDL）细胞的保存。尽管微创拔牙技术已在临床上被推荐用于减少创伤^8,9,10，但由于缺乏客观评估工具，其对残留PDL组织带来的生物学益处仍难以量化。本研究建立了一种概念验证性的、非破坏性的三维数字化分析方案，用于量化残留的PDL组织。研究结果支持了以下假设：与传统拔牙方法相比，微创方法能显著更好地保存牙根表面的残留PDL组织。

本研究的主要贡献在于验证了一种基于口内扫描的体外牙周膜（PDL）评估工作流程。传统的组织学方法虽能提供细胞水平的细节，但会破坏样本¹¹。相比之下，以往的二维摄影方法在映射具有复杂曲面几何形态的牙根时，易受投影失真的影响¹²。本实验方案通过结合高精度口内扫描（精度< 20 µm）与逆向工程软件，克服了上述局限性。该方法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	Servicbio	CCP-96H	用于细胞培养和吸光度测量的多孔板
生物安全柜	赛默飞世尔科技	1300 系列4 A2	用于无菌操作的II级生物安全柜
Cell Counting Kit-8（CCK-8）溶液	MedChemExpress	HY-K0301	细胞活力检测试剂
离心	中国科学技术大学中佳科学仪器有限公司	SC-3610	用于细胞沉淀的实验室离心机
培养基	Gibco	DMEM 11965	用于细胞转运与培养的基础培养基
牙科钳	金钟外科手术器械	K0F130/K0F100	标准牙科拔除器械
胎牛血清	安徽康源生物科技有限公司	KY-01003S	培养基用胎牛血清补充剂
刻度牙周探针	金钟外科器械	K6F040	协助从牙周膜上刮取  根的中三分之一
止血钳	金钟外科手术器械	J31130	用于扫描过程中固定牙齿的手术工具
加湿培养箱	赛默飞世尔科技	形态	细胞培养箱保持在37℃°37°C，5% CO2
图像编辑软件	Adobe Systems Inc.	Adobe Photoshop CC 2018	颜色选择软件
图像编辑软件	Wayne Rasband，美国国立卫生研究院	ImageJ2 v2.14.0	颜色阈值软件
口内数字扫描仪	Aidite (Qinhuangdao) Technology Co., Ltd.	Aidite Cameo	用于三维数字模型获取的光学扫描仪
局部麻醉	皮埃尔·罗兰牙科产品	普鲁卡因 阿替卡因	牙科麻醉剂（例如阿替卡因或利多卡因）
酶标仪	Biotek	Elx808	用于在 450 nm 处测量光密度的分光光度计
青霉素/链霉素	Gibco	15070063	培养基用抗生素添加剂
牙周膜剪	Carl Martin	LS529PT	微创提取器械
逆向工程软件	Geomagic 公司	Geomagic Studio 2013	用于表面积计算的3D建模软件
无菌离心管	Servicbio	EP-1500-J	用于样本采集和处理的塑料管
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010	生物样本洗涤缓冲液
无菌手术刀片	佳源医疗器械	无菌手术刀片	用于刮取牙周膜组织的刀片
无菌生理盐水	赛维尔生物	G4702-500ML	用于冲洗离体牙的生理盐水
甲苯胺蓝	普通实验室供应商	甲苯胺蓝（0.1% 溶液）	用于牙周膜可视化的生物染色剂
胰蛋白酶	Gibco	25200056	用于组织消化的酶解试剂