利用口内扫描对拔除的人类前磨牙进行残余牙周膜的非破坏性三维定量分析

摘要

本方案详细介绍了一种非破坏性、定量的三维数字化方法，用于评估拔除牙齿上残留的牙周膜。通过使用口内扫描和逆向工程软件，我们建立了一种离体牙周评估的工作流程，为临床前研究中比较不同拔牙技术提供了方法学基础。

摘要

意向性牙再植术是保留伴有牙髓病变的天然牙的一种有效治疗方法。其成功与否关键取决于残留牙周膜（PDL）的活性与结构完整性。传统的评估方法，如组织学切片或二维摄影，或具有破坏性，或受限于投影误差。为克服这些局限性，本方案提出一种基于高精度口内扫描的非破坏性、定量评估残留PDL的方法。将拔除的牙齿进行染色以可视化PDL组织，并进行三维扫描以生成高保真数字模型。利用逆向工程软件对数据进行分析，定义感兴趣区域，并通过颜色阈值法量化残留PDL的覆盖面积。该方法可在不破坏生物样本的前提下，准确计算PDL的真实三维覆盖面积。为评估本方案的敏感性与实用性，将其应用于比较使用牙周膜分离器的微创（MI）拔牙术与传统镊拔牙术。数字化分析显示，MI方法保留的PDL组织显著更多（61.99%），优于传统方法（50.46%）。此外，后续的细胞活性检测结果进一步验证了数字化分析结果，表明MI组具有显著更高的代谢活性。本研究最终建立了一种ex vivo定量评估PDL的概念验证工作流程，为临床前研究中不同拔牙技术的比较提供了坚实的方学基础。

引言

意向性牙再植术 increasingly recognized as a viable, last-resort treatment modality for preserving natural teeth that would otherwise be deemed hopeless. 它适用于处理持续存在的根尖周病变、无法通过非手术方法治疗的难以接近的根管穿孔，或广泛的吸收性病变^1,2。标准操作步骤包括：将患牙拔除，进行牙体脱位后的直视检查，实施治疗性干预（包括根尖切除、根尖预备和根尖充填），随后将牙齿重新植入原来的牙槽窝中^1,2。

根面残留牙周膜（PDL）组织的存在及其完整性是决定牙齿再植后愈合模式的最关键预后因素^3,4。健康的完整PDL屏障对于恢复生理性动度以及预防替代性吸收（牙根固连）或炎症性牙根吸收等并发症至关重要。然而，无论是创伤性还是医源性导致的牙齿脱位，均会破坏牙周膜纤维的附着，并切断其神经血管供应⁵。因此，PDL的生物学重建对于再植牙的牙周组织愈合至关重要³。大量研究已证实，在牙体离体期间的临床操作中，最大限度地保持残留PDL组织的活力和体积是一项关键的预后因素，其对再植牙长期功能存留的重要性已在文献中得到充分证实^6,7。

由于拔牙过程本身会破坏牙周膜（PDL）附着，因此拔牙技术的选择直接影响根面残留PDL组织的体积和活性。传统的镊子拔牙会施加旋转力和牵引力，可能导致PDL被挤压于牙槽骨上，或因摩擦而被撕脱。为了尽量减少此类创伤，已开发出微创（MI）拔牙技术。既往研究报道，MI技术可显著减少对患牙牙周组织的手术创伤⁸。目前已发展出使用牙周膜切开刀切断PDL附着，或采用避免杠杆力的垂直拔牙系统等技术，以保护根面残留的PDL组织。例如，病例报告记录了在应用MI系统进行意向性牙再植和外科牵引时，临床效果得到改善^9,10。这些发现表明，减少拔牙创伤可能有助于提高根面残留PDL组织的保留程度。

然而，尽管临床上普遍认可无创拔牙技术的优势，但关于微创（MI）方法相较于传统技术在保存残留牙周膜（PDL）组织方面所能达到的程度，目前仍缺乏直接的量化证据。这一知识空白主要源于现有评估方法的局限性。既往研究主要采用主观性或破坏性方法来评估根面残留的牙周膜。组织学切片仍是细胞水平分析的金标准¹¹，但该方法具有固有的破坏性，导致样本无法用于后续研究。另一种方法是染色结合二维（2D）摄影来表征残留牙周膜¹²，但这些方法无法对整个根面的残留牙周膜组织进行准确量化。二维图像难以精确反映复杂曲面的三维牙根表面积，不可避免地引入投影误差和形变，从而导致定量结果不准确。

近年来，口内数字扫描技术取得了显著进展，具有高精度和快速数据采集的优点。已有研究采用数字化方法测量印模和软组织变化，或评估年轻人的牙齿磨耗¹³。该技术的应用甚至已扩展至复杂的体积分析，例如在口腔外科中评估面部肿胀¹⁴。这些技术能够生成高保真的三维（3D）模型，并可在逆向工程软件中进行操作和测量，为非破坏性、定量分析提供了潜在解决方案。然而，迄今为止，口内扫描在评估拔除牙齿残留牙周膜（PDL）方面的潜在应用尚未被探索。

本方案的总体目标是建立一种标准化的、非破坏性的操作流程，将生物染色与高精度口内扫描及三维逆向工程相结合。通过创建具有彩色纹理表面图的高保真数字模型，该方法可对整个牙根表面残留的牙周膜（PDL）进行更客观、可重复的测量。本研究应用该流程比较两种拔牙技术——牙周膜分离器辅助的微创拔牙与传统钳拔法——在人类前磨牙中残留牙周膜覆盖情况的差异。研究假设微创方法比传统方法能保留更高比例的残留牙周膜覆盖。

重要的是，本方案严格设计为一种用于实验室或临床前环境的ex vivo研究工具。该操作涉及染色、空气干燥、数字扫描以及基于软件的分割分析，其总分析时间较长，无法满足意向性再植术中尽量缩短牙根外时间的要求。因此，该方法适用于：（i）在受控条件下比较不同拔牙技术对牙周膜保留效果的优劣；（ii）在教育环境中进行培训与校准；以及（iii）将数字化牙周膜覆盖度指标与生物学结局相关联的验证性研究。该方法在解剖结构复杂的多根牙中的适用性尚需进一步研究。

方案

该研究方案遵循北京大学口腔医学院伦理委员会（PKUSSIRB-202054022）的指南进行。

1. 患者选择与分组

1. 选择因正畸需要拔除前磨牙的患者。确保前磨牙符合纳入标准，无龋齿或牙周病。
2. 排除患有高血压、糖尿病、吸烟史，或年龄小于16岁或大于45岁的患者。
3. 将前磨牙随机分配至两个实验组：对照组（传统拔除）和微创组（牙周膜刀辅助拔除）。
4. 将每组中的牙齿随机分配至三维扫描分析路径或生物学验证（CCK-8）路径，确保每种评估方法使用独立样本。

2. 拔牙操作步骤

1. 所有拔牙操作均应在标准局部麻醉下进行。
2. 方法A：传统拔牙术（对照组）
   1. 在牙颈部周围进行牙龈分离。
   2. 将拔牙钳置于牙冠颈部区域。
   3. 施加旋转力，直至牙齿松动，然后用拔牙钳将牙齿从牙槽窝中取出。
3. 方法B：微创拔牙术（MI组）
   1. 进行牙龈分离。
      注意：操作牙周膜分离器时需小心，避免软组织损伤或器械折断。
   2. 将牙周膜分离器尽可能深入地插入牙周膜间隙，深度至少达到根长的三分之二。
   3. 使用牙周膜分离器环形切断根部周围的牙周膜纤维，使牙齿松动。
   4. 用拔牙钳垂直牵引，将牙齿从牙槽窝中拔出。

3. 样品制备与染色

1. 拔除后立即用无菌生理盐水冲洗牙齿 10 分钟，以去除血液和碎屑。
   警告：甲苯胺蓝为有害化学品。操作时需佩戴适当的个人防护装备（手套、护目镜）。
2. 将牙齿浸入 0.1% 甲苯胺蓝溶液（用磷酸盐缓冲液 PBS 配制）中染色 40 分钟，以显示牙周膜（PDL）组织。
3. 用生理盐水冲洗 10 分钟以去除染液，并用三用枪轻轻吹干表面以除去多余水分。
   注意：牙根表面应呈现均匀的蓝紫色，而暴露的牙骨质应未被染色，呈浅米色。

4. 三维数字化扫描

1. 根据制造商的说明校准口内数字扫描仪，以确保精度达到 0.02 mm。
2. 使用止血钳固定牙冠，以避免遮挡根面视野。
3. 在标准扫描条件下扫描整个根面。对牙冠进行补充扫描，以完成三维模型的构建。
4. 使用扫描仪配套的专有软件将数字扫描数据导出为高分辨率的三维对象（OBJ）文件及相关数据包；纹理图像以 JPG 格式保存。
   注意：实时扫描预览必须显示根面为连续、高密度的网格，无任何孔洞或伪影。纹理图像应能清晰区分经蓝色染色的区域与未染色的根面。

5. 三维模型重建与定量分析

1. 图像预处理
   1. 阈值校准
      1. 将 JPG 纹理贴图导入图像编辑软件，将图像转换为 8 位灰度图。
      2. 打开阈值工具（图像 > 调节 > 阈值），检查直方图以记录捕获所有蓝色染色牙周膜像素的最小灰度值。由三位独立观察者确定最小灰度阈值。
   2. 将原始 JPG 纹理贴图导入图像编辑软件。进入选择 > 色彩范围。选择“阴影”模式，将范围设为65，容差设为20%（根据5.1.1阈值数据校准）。
      注意：请确认所有蓝色染色的牙周膜区域均已完全选中，且未包含任何未染色的牙根表面。
   3. 复制选中的蓝色染色区域，并将其粘贴到新的白色图层上，以生成二值掩膜（牙周膜区域为蓝色，裸露牙根区域为白色）。保存处理后的纹理图像，以覆盖原始 JPG 文件。
2. 定量测量
   1. 将处理后的3D模型导入逆向工程软件。
   2. 使用多边形 > 修剪以定义感兴趣区域（ROI），排除牙龈和根尖周组织。将ROI的上边界设定在釉牙骨质界（CEJ）下方2 mm处。在分析中排除根尖端3 mm区域。
   3. 选择 "增强的蓝色区域" 在选定的ROI内。选择后，残留的牙周膜组织以红色突出显示。
   4. 导航至分析模块 > 计算 > 计算面积以确定ROI的总面积以及蓝色区域（残留PDL）的表面积。
   5. 使用公式 1 计算 PDL 覆盖率的百分比：
      ​PDL覆盖率（%）=（残留PDL面积／ROI总面积）× 100
3. 可视化
   1. 垂直于牙体长轴拍摄四个牙根面（唇侧、舌侧、近中和远中）的图像，以进行详细的视觉评估。

6. 生物学验证（细胞活力检测）

注意：本节描述了对部分样本（每组 n = 8）进行的验证步骤，以证实数字分析结果。

1. 提取后立即把牙齿放入含有预热（37 °C）培养基的无菌离心管中。
2. 样本须在1小时内置于4°C冰盒中运送到实验室。使用添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）进行样本运输及细胞活力检测。
3. 样本到达后立即在生物安全柜中用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗牙齿。
4. 在样本到达后10分钟内，于室温下使用无菌手术刀片小心刮取根面中三分之一区域的牙周膜（PDL）组织（感兴趣区域由刻度牙周探针界定），以最大限度保持细胞活力。
5. 用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化所收集的组织30分钟。将细胞悬液在室温（22–25 °C）下以120 × g离心5分钟，获得含细胞的沉淀物。
   注意：离心后，试管底部应形成可见的白色沉淀。若未观察到沉淀，应以120 × g再次离心1分钟。
6. 按照制造商说明书配制CCK-8（Cell Counting Kit-8）溶液与培养基按1:10（v/v）比例混合，将沉淀物重悬于600 µL该混合液中。
7. 将上述悬液以每孔200 µL分装至96孔板中（每样本设3个技术重复孔）。将培养板置于含5% CO₂的湿润培养箱中，37°C孵育3小时。
8. 从每一孔中转移50 µL上清液至新的96孔板中。
9. 使用酶标仪在450 nm处测定吸光度（光密度，OD）。记录各组平均OD值用于统计学比较。
   注意：（i）甲苯胺蓝染色液及冲洗废液应作为危险化学品废物收集，并根据机构化学品安全指南处置；（ii）牙周膜组织、使用过的手术刀片及细胞培养废弃物应作为生物危险废物（生物安全等级1级）处理，须按照机构生物安全规程进行高压灭菌或焚烧；（iii）个人防护装备（手套、移液器吸头、纸巾等）应丢弃于指定的生物危害容器中。

7. 统计分析与方法学验证

1. 数据收集：汇总定量数据，包括总根表面积（mm²）、总根长度（mm）、平均根直径（mm）、根体积（mm³）以及根尖数量。使用适当的图像分析软件从扫描图像中提取这些参数。确保每份样本的数据准确记录，并保存原始图像以供后续验证。将所有数据整理至电子表格中，以便进行统计分析。²），总染色面积（mm²来自三维分析的PDL覆盖百分比（%）以及生物测定的OD值。
2. 正态性检验：使用Shapiro-Wilk检验评估数据分布的正态性。
3. 组间比较：
   1. 比较MI组与对照组的PDL覆盖率和OD值。
   2. 对于正态分布的数据，采用非配对学生t检验；对于非正态分布的数据，采用Mann-Whitney U检验。
   3. 计算效应量（Cohen’s d）以确定差异的大小。
4. 方法学稳健性分析：
   1. 进行线性回归分析 "根表面积" 作为自变量 "PDL 覆盖率" 作为因变量。
   2. 计算皮尔逊相关系数（r），以评估测量方法是否受牙齿大小的影响。若相关性不显著（P < 0.05），则表明该方法无显著偏倚。 > 0.05）表明具有稳健性。
5. 可靠性分析：
   1. 生成小提琴图并结合箱线图，以可视化数据的概率密度和分布特征。
   2. 比较各组间数据分布的形态和集中程度。
6. 观察者内部与观察者间可靠性检验：
   1. 从总数据集中随机选取16个样本（每组8个）进行可靠性评估。
   2. 为评估观察者内部重复性，在相同16个样本上以一周间隔重复完整的分割与测量步骤，共进行两次试验。
   3. 为确保观察者间的一致性，应对另外两名独立观察者提供关于分割方案的标准化培训。
   4. 三名观察者应独立对相同的16个样本进行感兴趣区域（ROI）定义、颜色阈值分割及面积计算。
   5. 计算组内相关系数 ICC(A,1) 及其 95% 置信区间，以量化观察者内和观察者间比较的绝对一致性。报告 ICC 值 >0.90 为优秀，0.75–0.90 为良好，0.50–0.75 为中等，以及 <0.50 为差。
   6. 对所有成对比较进行Bland-Altman分析。计算平均差值（偏倚）及95%一致性界限（平均差值 ± 1.96 SD）。配对t检验结果无统计学意义（P < 0.05）表明两种测量方法之间无系统性偏差。 > 0.05）表明系统性偏差可忽略不计。
7. 软件：使用适当的软件进行所有统计分析。考虑 P < 0.05 作为具有统计学意义的显著性水平。

结果

本研究建立的实验流程成功验证了一种对拔除牙齿上残留牙周膜进行定量评估的非破坏性方案。如实验设计所示（图1），该方案结合了临床拔牙操作、数字化采集与生物学验证。通过应用口内数字化扫描，继而进行三维逆向工程，实现了对牙根表面的精确重建（图2）。数字模型基于颜色阈值区分染色的牙周膜组织与暴露的牙根表面，且感兴趣区域（ROI）排除了牙龈和根尖部位的变异，以聚焦于功能牙根表面的分析。

三维数字化分析揭示了两种拔牙方法之间残留牙周膜（PDL）的显著形态学差异，为该方案的敏感性提供了定量证据（图3A、B）。在微创（MI）组中，残留的PDL组织通常表现为致密的网状或大片斑块状分布，覆盖了大部分牙根表面。相比之下，对照组的残留PDL主要呈孤立点状或碎片状分布，暴露的牙根表面区域明显更大，尤其是在舌侧部位。两组之间的牙根总表面积具有可比性（MI组：137.0 ± 24.17 mm^2...

讨论

意向性再植的成功在很大程度上依赖于牙根表面存活的牙周膜（PDL）细胞的保存。尽管微创拔牙技术已在临床上被推荐用于减少创伤^8,9,10，但由于缺乏客观评估工具，其对残留PDL组织带来的生物学益处仍难以量化。本研究建立了一种概念验证性的、非破坏性的三维数字化分析方案，用于量化残留的PDL组织。研究结果支持了以下假设：与传统拔牙方法相比，微创方法能显著更好地保存牙根表面的残留PDL组织。

本研究的主要贡献在于验证了一种基于口内扫描的体外牙周膜（PDL）评估工作流程。传统的组织学方法虽能提供细胞水平的细节，但会破坏样本¹¹。相比之下，以往的二维摄影方法在映射具有复杂曲面几何形态的牙根时，易受投影失真的影响¹²。本实验方案通过结合高精度口内扫描（精度< 20 µm）与逆向工程软件，克服了上述局限性。该方法...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板	Servicbio	CCP-96H	用于细胞培养和吸光度测量的多孔板
生物安全柜	赛默飞世尔科技	1300 系列4 A2	用于无菌操作的II级生物安全柜
Cell Counting Kit-8（CCK-8）溶液	MedChemExpress	HY-K0301	细胞活力检测试剂
离心	中国科学技术大学中佳科学仪器有限公司	SC-3610	用于细胞沉淀的实验室离心机
培养基	Gibco	DMEM 11965	用于细胞转运与培养的基础培养基
牙科钳	金钟外科手术器械	K0F130/K0F100	标准牙科拔除器械
胎牛血清	安徽康源生物科技有限公司	KY-01003S	培养基用胎牛血清补充剂
刻度牙周探针	金钟外科器械	K6F040	协助从牙周膜上刮取  根的中三分之一
止血钳	金钟外科手术器械	J31130	用于扫描过程中固定牙齿的手术工具
加湿培养箱	赛默飞世尔科技	形态	细胞培养箱保持在37℃°37°C，5% CO2
图像编辑软件	Adobe Systems Inc.	Adobe Photoshop CC 2018	颜色选择软件
图像编辑软件	Wayne Rasband，美国国立卫生研究院	ImageJ2 v2.14.0	颜色阈值软件
口内数字扫描仪	Aidite (Qinhuangdao) Technology Co., Ltd.	Aidite Cameo	用于三维数字模型获取的光学扫描仪
局部麻醉	皮埃尔·罗兰牙科产品	普鲁卡因 阿替卡因	牙科麻醉剂（例如阿替卡因或利多卡因）
酶标仪	Biotek	Elx808	用于在 450 nm 处测量光密度的分光光度计
青霉素/链霉素	Gibco	15070063	培养基用抗生素添加剂
牙周膜剪	Carl Martin	LS529PT	微创提取器械
逆向工程软件	Geomagic 公司	Geomagic Studio 2013	用于表面积计算的3D建模软件
无菌离心管	Servicbio	EP-1500-J	用于样本采集和处理的塑料管
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010	生物样本洗涤缓冲液
无菌手术刀片	佳源医疗器械	无菌手术刀片	用于刮取牙周膜组织的刀片
无菌生理盐水	赛维尔生物	G4702-500ML	用于冲洗离体牙的生理盐水
甲苯胺蓝	普通实验室供应商	甲苯胺蓝（0.1% 溶液）	用于牙周膜可视化的生物染色剂
胰蛋白酶	Gibco	25200056	用于组织消化的酶解试剂