在斑马鱼中，安全剂量（≤200 µg/mL）的 mollugin 与尾部再生能力的改善相关，同时伴随着凋亡相关基因表达、炎症标志物、抗氧化酶活性以及巨噬细胞相关标志物的变化。这些发现表明，mollugin 可能在斑马鱼尾部再生过程中调节局部损伤反应。
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研究文章
* These authors contributed equally
在斑马鱼中，安全剂量（≤200 µg/mL）的 mollugin 与尾部再生能力的改善相关，同时伴随着凋亡相关基因表达、炎症标志物、抗氧化酶活性以及巨噬细胞相关标志物的变化。这些发现表明，mollugin 可能在斑马鱼尾部再生过程中调节局部损伤反应。
Mollugin 是一种天然的萘醌类化合物，已有报道称其具有抗炎和抗氧化活性，但其在组织再生中的作用仍不完全清楚。本研究采用斑马鱼尾部截断模型，探讨 Mollugin 对伤口修复及相关免疫和氧化还原反应的影响。在尾部损伤后，对斑马鱼胚胎分别用 22 µg/mL、66 µg/mL 和 200 µg/mL 浓度的 Mollugin 进行处理。Mollugin 处理呈现出剂量依赖性的尾部区域修复改善，同时伴随凋亡相关基因表达的下调，以及对促炎介质（包括 IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4 和 NF-κB1）的抑制作用。与此同时，Mollugin 恢复了超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等抗氧化酶的活性。在 Tg(mpeg1:GFP) 斑马鱼中进行的荧光成像显示，Mollugin 对巨噬细胞聚集具有时间依赖性影响：在损伤后 24 小时未见明显减少，但在 48 小时时，66 和 200 µg/mL 组的巨噬细胞阳性区域较损伤模型组减少。qRT-PCR 分析进一步显示，M1 型相关标志物 iNOS 的表达降低，而 M2 型相关标志物精氨酸酶-1 的表达升高。综上所述，这些结果表明 Mollugin 可能通过调节炎症、氧化应激、凋亡相关及巨噬细胞相关标志物，促进斑马鱼尾部再生。未来仍需进一步研究以明确其潜在的细胞与分子机制。
组织再生是一种关键的生理过程，生物体通过该过程修复损伤，涉及细胞增殖、分化以及微环境稳态的复杂调控1。在脊椎动物模型中，斑马鱼因其强大的再生能力，已成为研究伤口修复机制的重要体系。特别是斑马鱼尾鳍的再生，涵盖了多种生物学事件的时空协调过程，包括炎症调控、氧化应答平衡以及细胞凋亡控制2,3。近年来，天然产物的药理活性已成为再生医学研究的焦点。其中，萘醌类化合物因其多样的生物学效应而受到广泛关注4。 mollugin 是一种来源于茜草科植物的萘醌类化合物，在既往研究中已显示出抗炎、抗氧化以及细胞周期调控活性5,6。然而，其在组织再生中的作用机制尚不明确，其在调节炎症微环境及免疫细胞极化方面的潜在作用仍需系统研究。
损伤后，炎症反应迅速被激活，并直接影响组织修复。适度的炎症信号对于清除坏死组织和启动再生程序至关重要，而过度的炎症级联反应则会加剧氧化应激，导致组织纤维化7。细胞因子（包括 IL-1β、IL-6 和 TNF-α）在损伤后显著升高，并伴随 TLR4/NF-κB 信号通路的激活，从而放大炎症反应并促进组织重塑8,9。细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和 CC 趋化因子配体 2（CCL-2）在损伤后也升高，与中性粒细胞和巨噬细胞向受损组织的募集增加相关10。值得注意的是，氧化失衡会进一步加重组织损伤，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性降低提示抗氧化能力受损2,11。
巨噬细胞是炎症微环境的关键调控因子，其功能极化显著影响组织再生过程12。M1型巨噬细胞与诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达及促炎活性相关，而M2型巨噬细胞则表达精氨酸酶-1（Arg-1），并与组织修复相关13,14。巨噬细胞的极化受到局部细胞因子、氧化应激以及凋亡相关信号的影响。在此背景下，由B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白和caspase-3组成的凋亡调控网络不仅影响损伤部位的细胞存活，还通过释放"find-me"信号间接调节免疫细胞的趋化行为15。因此，探索能够同时调控炎症反应、氧化应激和巨噬细胞极化的干预策略，可能有助于促进组织再生。
天然化合物在调控这些生物过程方面已展现出独特优势。近期研究表明，萘醌类物质由于其共轭结构，具有清除自由基的潜力；其苯醌核心可通过电子转移机制影响氧化还原敏感的信号通路16,17。已有报道指出， mollugin 可减轻DSS诱导的结肠炎中的炎症反应，表现为结肠组织中促炎细胞因子生成减少以及TLR4表达下调18。此外，mollugin 被证实可在巨噬细胞中抑制TAK1-NF-κB/MAPK信号通路并激活Keap1-Nrf2通路6；然而，其对体内伤口模型中巨噬细胞极化以及凋亡-抗凋亡网络的影响尚未阐明。此外，mollugin 的剂量依赖性生物学效应及其在组织再生过程中的调控作用仍有待系统阐明。
本研究探讨了莫诺苷（Mollugin）在斑马鱼尾鳍再生模型中的作用。具体而言，我们检测了莫诺苷处理后尾鳍再生情况、凋亡相关基因表达、炎症信号通路、抗氧化酶活性以及与巨噬细胞相关反应的变化。研究结果表明，在该斑马鱼模型中，莫诺苷处理与尾鳍再生改善及多种损伤应答标志物的变化相关。
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所有动物实验均遵循美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》，并经福州第一医院伦理委员会批准（批准号：202408002）。
斑马鱼繁殖
所有实验均使用在标准实验室条件下饲养的斑马鱼 (Danio rerio) 进行。野生型 AB 斑马鱼用于毒性检测和尾部截断再生实验。Tg(mpeg1:GFP) 斑马鱼专门用于巨噬细胞成像。Tg(mpeg1:GFP) 是一种巨噬细胞报告品系，其中在巨噬细胞表达的 mpeg1 启动子调控下，GFP 的表达可标记巨噬细胞谱系细胞。所有斑马鱼品系均在 28.5 °C、14 小时光照/10 小时黑暗的光周期条件下饲养。实验仅使用形态正常的胚胎。所有实验中，胚胎均在 Danieau 缓冲液中孵育，该缓冲液使用试剂级化学品配制，包括 NaCl、KCl、Ca(NO₃)₂·4H₂O、MgSO₄·7H₂O 和 HEPES，并调节至 pH 7.2。
药物配制与安全性测定
将 mollugin（40 mg）溶解于 1 mL DMSO 中，配制成 40 mg/mL 的储备液。先用 Danieau’s 缓冲液将储备液按 1:10 稀释至 4 mg/mL，再进一步稀释为 22、66 和 200 µg/mL 用于处理。为确定最大安全浓度，取受精后 48 小时（hpf）的 AB 品系胚胎，经去壳后用 0.003% 次氯酸钠消毒，随后分配至 6 孔板中（每组 n=20，设三个重复孔）。将胚胎置于 E3 培养基中，分别加入 mollugin（22 µg/mL、66 µg/mL、200 µg/mL、240 µg/mL、280 µg/mL、320 µg/mL 或 360 µg/mL），在 28.5 °C 下孵育 48 小时。在体视显微镜下观察胚胎存活情况，并将胚胎存活率 ≥90% 的最高浓度确定为后续实验的安全上限。
尾部截肢与再生模型构建
为进行再生研究，将48 hpf的野生型AB胚胎用含有0.03%三卡因的胚胎培养基麻醉，并置于体视显微镜下侧向固定。在尾部截肢前，胚胎维持在Daniléau缓冲液中。在体视显微镜引导下进行标准化的横向尾部截肢操作。截肢线位于脊索末端稍后方，以脊索后端作为解剖学标志。使用显微手术刀切除该标志远端的尾鳍褶，以确保各标本间损伤程度一致。截肢后立即（0 h）使用体视荧光显微镜采集图像。截肢完成后，将胚胎转移至相应的基于E3的处理培养基中进行再生实验。Mollugin工作液通过将Mollugin储备液稀释至E3培养基中，配制成终浓度为22、66和200 µg/mL的溶液。在再生期间，通过浸泡方式给予Mollugin。为保持溶剂暴露条件一致，未损伤对照组和损伤模型组均维持在含0.5% DMSO的E3培养基中，该DMSO浓度与200 µg/mL Mollugin组中的终浓度相同。胚胎置于6孔板中，在28.5 °C条件下培养2天，并每天更换相应的基于E3的处理培养基。在截肢后24 h和48 h，分别在明场和荧光条件下成像，以记录尾部再生情况及巨噬细胞分布。图像测量使用ImageJ软件进行分析。
在进行再生量化时，以 µm2 为单位测量尾部恢复区域的绝对面积，未对胚胎大小或原始尾部大小进行归一化处理。为尽量减少变异性，所有胚胎均在脊索末端后方的同一解剖标志处进行截断，且各组均采用相同的解剖标志来定义测量区域。在 ImageJ 中根据尾部轮廓手动勾画感兴趣区域，分析由对处理分组不知情的研究人员完成。对于巨噬细胞阳性区域的量化，使用 ImageJ 分析 Tg(mpeg1:GFP) 胚胎的 GFP 荧光图像。尾部损伤/再生区域采用与尾部面积测量相同的解剖标志手动定义为感兴趣区域。图像被转换为 8 位灰度图像，并对同一实验中的所有图像使用相同的背景校正设置扣除背景荧光。随后，在每个实验内对所有图像统一应用固定的荧光阈值，以识别与 GFP 阳性巨噬细胞相关的信号。巨噬细胞阳性区域被计算为在定义的感兴趣区域内超过阈值的 GFP 阳性面积。测量基于荧光阳性面积，而非荧光强度或人工细胞计数。所有图像分析均由对处理分组不知情的研究人员完成。
RNA 提取与定量实时 PCR（qRT-PCR）
再生实验完成后，收集各实验条件下胚胎并进行 pooling（每组至少 20 个胚胎）用于 RNA 分析。每个实验条件下，一个生物学重复由来自同一实验组的至少 20 个胚胎组成的混合样本构成。每种条件制备三个独立的混合生物学重复样本，并用于统计分析。总 RNA 在苯酚/胍类 RNA 提取试剂中经机械匀浆后提取。RNA 质量和浓度通过分光光度法测定 A260/A280 比值进行评估。使用商业逆转录试剂盒合成 cDNA。PCR 扩增采用 SYBR Green 试剂进行。qRT-PCR 扩增循环条件如下：95 °C 预变性 30 秒，随后进行 40 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 5 秒，60 °C 退火/延伸 30 秒。检测与细胞凋亡（caspase-3 和 Bcl-2）、炎症（TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB1、TLR4、CCL2 和 ICAM1）以及巨噬细胞表型（iNOS 和 arginase-1）相关基因的表达水平。β-Actin 作为内参基因。基因表达的倍数变化采用 2−ΔΔCt 法计算。引物信息见表 1。
SOD 和 CAT 活性测定
SOD 和 CAT 水平用于评估尾部损伤后的抗氧化状态。在截尾后 48 小时，收集各组斑马鱼并在冷 PBS 中匀浆。离心后，取上清液，使用商用活性检测试剂盒测定 SOD 和 CAT 活性。SOD 活性采用基于 WST-1 的检测试剂盒，按照制造商说明书进行检测。将样品与标准品一同加入 96 孔检测板，用酶标仪读取吸光度。酶活性通过标准曲线计算获得。所有检测均设三个重复。
统计学分析
数据以至少三次独立实验的均值 ± 标准误（SEM）表示。在毒性检测中，每次独立实验包含一个胚胎批次，每组20个胚胎，设三个复孔。在Tg(mpeg1:GFP)斑马鱼的再生成像和巨噬细胞成像实验中，以单个胚胎作为测量单位，每组分析10个胚胎。在qRT-PCR分析中，一个生物学重复为来自同一实验组的至少20个胚胎组成的混合样本，每种条件分析三个独立的混合生物学重复。在SOD和CAT活性分析中，每种条件分析五个独立的混合生物学重复。组间差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并结合Tukey事后检验进行分析。统计学分析在GraphPad Prism软件中进行。以p < 0.05为差异具有统计学意义。
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毒性与安全剂量的确定
为研究莫诺苷（Mollugin）的作用，我们首先进行了毒性测试。结果显示，在浓度不超过 200 µg/mL 时，斑马鱼胚胎的死亡率保持在较低水平；而当浓度超过 200 µg/mL 时，死亡率显著升高（表 2）。因此，确定最高安全剂量为 200 µg/mL，低剂量和中剂量则分别设定为 22 和 66 µg/mL。
尾部截断模型及早期尾部区域修复评估
随后，在48 hpf野生型AB斑马鱼中建立了尾部截断模型，并通过显微镜观察确认模型构建成功（图1）。此后，将Mollugin的安全剂量应用于模型组。截断后24小时，与损伤模型组相比，200 µg/mL Mollugin处理组的尾部修复面积增加（P < 0.01）。截断后48小时，66 µg/mL和200 µg/mL Mollugin处理组的尾部修复面积均较损伤模型组显著增加（P < 0.01）。由于在截断后48小时尾部区域的修复仍...
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在本研究中，我们考察了 mollugin 对斑马鱼尾部再生的影响。在测试的剂量范围内，mollugin 处理与损伤后尾部区域恢复改善相关，并伴随凋亡相关基因表达、炎症标志物、抗氧化酶活性以及巨噬细胞相关标志物的变化。
斑马鱼作为再生研究的重要模型，其尾部再生过程涉及多种信号通路的协同作用19。损伤后，caspase-3 水平升高，而 Bcl-2 表达下降，表明细胞凋亡增强。这种过度的凋亡激活不仅耗竭了再生细胞库，还加剧了继发性炎症反应，导致进一步的组织损伤20,21。使用 Mollugin 处理可恢复凋亡标志物的平衡，提示其可能具有抑制过度 caspase-3 活性或增强 Bcl-2 保护作用的潜力，从而保留对再生至关重要的细胞资源。
炎症在组织修复中具有重要作用。适度的炎症有助于清除病原体和坏死组织，而过度或持续时间过长的炎症则会导致促炎性细胞因子及上游调节因子...
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作者声明无竞争利益。
本研究由福建省卫生健康委员会（项目编号：2022QNA085）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔组织培养板 | Corning | 3516 | |
| 过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | A007-1-1 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| CMax Plus 微孔板读数仪 | Molecular Devices | iD3s | |
| Danieau’s 缓冲液 – Ca(NO3)2·4H2O | 广州医药集团有限公司，中国 | N/A | Danieau’s 缓冲液中的终浓度：0.6 mM。 |
| Danieau’s 缓冲液 – HEPES | 广州医药集团有限公司，中国 | N/A | Danieau’s 缓冲液中的终浓度：5 mM；pH 调整至 7.2。 |
| Danieau’s 缓冲液 – KCl | 广州医药集团有限公司，中国 | N/A | Danieau’s 缓冲液中的终浓度：0.7 mM。 |
| Danieau’s 缓冲液 – MgSO4·7H2O | 广州医药集团有限公司，中国 | N/A | Danieau’s 缓冲液中的终浓度：0.4 mM。 |
| Danieau’s 缓冲液 – NaCl | 广州医药集团有限公司，中国 | N/A | Danieau’s 缓冲液中的终浓度：58 mM。 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E3 胚胎培养基 | 实验室自制（标准配方） | N/A | 标准配方。 |
| 基因特异性 qPCR 引物（tnfα、il1β、il6、nfkb1、tlr4、ccl2、icam1、inos、arginase-1、caspase-3、bcl2、β-actin） | 生工生物工程有限公司 | N/A | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | N/A | 版本 8.0。 |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | N/A | 版本 1.52n。 |
| 莫诺苷（≥98%，HPLC） | Sigma-Aldrich | SMB00431 | 来自茜草（Rubia cordifolia）的活性化合物，用 DMSO 溶解至 40 mg/mL，并在 E3 培养基中稀释为 22、66 和 200 µg/mL。 |
| 电动组织匀浆器 | IKA, T10 basic ULTRA-TURRAX（或同等产品） | N/A | |
| NovoScript 第一链 cDNA 合成超混液 | 诺唯赞 | abs60077 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| 实时 PCR 系统（Archimed X4） | 圣湘生物科技股份有限公司 | Archimed X4 | |
| 制冷型微量离心机 | SCILOGEX | CF1524R | |
| 无 RNA 酶吸头 | 生工生物工程有限公司 | F603222-0010 | |
| RNAiso Plus | 宝生物工程（大连）有限公司 | 9109 | 基于苯酚/胍的 RNA 提取试剂。 |
| 无 RNase 微量离心管，1.5 mL | Axygen / Eppendorf | N/A | |
| SMZ800N 荧光体视显微镜 | 尼康 | SMZ800N | 用于成像 Tg(mpeg1:GFP) 幼鱼并定量巨噬细胞聚集。 |
| 次氯酸钠溶液 | McLean, USA | N/A | 工作液浓度为 0.003%。 |
| SYBR Green qPCR Mix（2× SYBR qPCR Mix） | 诺唯赞 | E096 | |
| SZX16 体视显微镜 | 奥林巴斯 | SZX16 | 用于幼鱼的形态学观察、毒性评估和尾鳍截断。 |
| 总超氧化物歧化酶（T-SOD）检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | A001-3 | |
| 转基因斑马鱼 Tg (mpeg1:GFP) | 安必瑞，福建，中国（或本实验室保种群体） | N/A | 巨噬细胞报告基因品系。 |
| 三卡因甲磺酸盐（MS-222） | Sigma-Aldrich | E10521 | 工作液浓度为 0.03%。 |
| UltraPure 无 DNase/RNase 蒸馏水 | Invitrogen | 10977023 | |
| 野生型斑马鱼，CZ98 品系（Danio rerio） | 安必瑞，福建，中国 | N/A | 受精卵和幼鱼由成年亲鱼繁殖获得。 |
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