利用针式肌动描记法评估小鼠主动脉内在硬度：探究循环环境影响的转化研究框架

摘要

本文介绍了一种通过针式肌动描记法评估主动脉固有壁硬度（弹性模量）的实验方案，以及探究循环环境在调节主动脉固有壁硬度中潜在作用的研究方法。

摘要

主动脉硬化是心血管疾病及其他慢性疾病（包括认知功能下降、肾功能障碍、视力受损以及葡萄糖-胰岛素功能减退）的独立危险因素。体内评估主动脉硬度通常采用基于张力测定法或超声技术的方法，分别用于可视化动脉波形或纵向动脉节段。然而，体内测量结果受到多种因素的影响，例如动脉压和自主神经输入，这限制了对主动脉硬度变化机制及其原因的深入理解。临床前小鼠模型允许直接获取主动脉组织，提供了一个独特的实验框架，可在排除混杂生理变量干扰的情况下，同时评估体内主动脉硬度及主动脉的内在力学特性。这些模型还可直接探究循环环境（即血液中循环生物活性分子的组成）及其在从临床前到临床转化过程中调节主动脉硬度的作用。在众多临床前与临床研究中，循环环境的改变已被证实是多种情况下主动脉硬化的关键机制基础，这些情况包括原发性衰老以及与癌症和癌症治疗相关的早衰，并且在介导干预措施效应方面也发挥重要作用。本文提供了一套逐步操作指南，用于评估：（1）临床前小鼠模型中的主动脉内在硬度（弹性模量）；（2）利用临床前和临床生物样本，评估循环环境（及其组分）对主动脉硬化的贡献。

引言

主动脉硬化是心血管疾病及其他慢性疾病的独立危险因素^1,2. 主动脉僵硬度评估 体内 可能缺乏机制上的解析度，因为调节主动脉硬度的是整合性的生理过程 体内 （例如，血压和自主神经输入）²因此，需要评估主动脉的内在刚度（即主动脉壁刚度/弹性模量） 离体 使用针式肌动描记法可直接评估主动脉僵硬度，且不受混杂生理变量的影响²此外，使用一种 离体 实验方法可用于探究可能介导主动脉壁僵硬的潜在分子机制。与评估动脉僵硬度的其他既定方法相比 离体，例如压力肌动描记法、双轴平面测试和循环/脉动肌动描记系统，这些方法依赖于生理系统的建模（如管腔内压力和脉动血流动力学），而针式肌动描记法则可在高度受控的条件下通过等长张力直接评估主动脉壁的刚度，且无需 体内 建模。

循环环境（即血液中生物活性分子的集合）与主动脉直接且频繁接触，在主动脉硬化的情况下（例如生理性/原发性衰老以及早衰，如癌症幸存者或癌症幸存模型）通常会发生改变^3,4。我们利用临床前（小鼠）和临床（人类）生物样本（血浆和血清）已证实，循环环境在原发性⁴和早发性衰老³过程中均直接促进主动脉硬化。此外，我们建立了一套实验框架，用于确定循环环境中特定组分在介导其对主动脉硬化影响中的直接作用^3,5,6。本文中，我们详细阐述并描述了使用针式肌动描记法（pin myography）评估主动脉本征硬度以及循环环境（及其组分）对主动脉硬化贡献的逐步实验方法，并提供了代表性结果（含图示和参考文献）。

方案

本研究使用雄性野生型C57BL/6J年轻成年小鼠（4月龄）。实验小鼠的饲养和操作程序均经科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 冷生理盐水溶液（CPSS）的制备

1. 在 1 L 的 diH₂O 中配制 Ca²⁺ Ringer's 储存液，并于 4 °C 保存（表 1）。
2. 在 100 mL 的 diH₂O 中加入 13.9 g MOPS，配制 MOPS 缓冲液储存液，并于 4 °C 保存。
3. 在 100 mL 的 diH₂O 中加入 0.186 g EDTA，配制 EDTA 储存液，调节 pH 至 8.0，并于室温保存。
4. 配制含有上述储存液及下表所列化学试剂的 CPSS（表 2）。用 diH₂O 定容至 2 L，在 34 °C 下调节 pH 至 7.4，并通过 ≤ 0.45 µm 滤膜过滤。分装至 50 mL 离心管中，于 -20 °C 保存。

2. 小鼠主动脉的解剖（图1、图2和图3）

1. 使用异氟烷（2.5%）吸入麻醉小鼠，并将小鼠置于仰卧位图1A-C).
2. 当小鼠达到手术麻醉深度后，通过心脏穿刺采集血液，并采用双侧胸廓切开法实施二次安乐死图1B–C).
3. 接下来，小心地从主动脉弓至腹主动脉处分离主动脉图1D–F).
4. 将主动脉置于CPSS中，使用Fine Science Tools Vannas弹簧剪刀（2.5 mm）去除所有结缔组织和血管周围脂肪组织图2A–E).
5. 在主动脉弓下方的胸段主动脉区域，仔细截取三段宽1 mm的主动脉组织图3).
6. 将两段1 mm的主动脉组织置于装有CPSS的1.5 mL离心管中，于-80 °C保存，直至进行应力-应变针肌描记实验。将3^rd 根据下述方法进行适当分割，以便后续进行组织学测量。

3. 应力-应变针肌实验

注意：将使用Pin微血管张力测定系统进行 体外 主动脉僵硬度检测（图4 和 图5).

1. 首先，将含有约 6 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）的腔室预热至 37 °C，并解冻 1 mm 的冷冻主动脉节段。
   ​注意：也可使用其他适当氧合且 pH 值受控的生理盐溶液，具体方法如前所述⁷。
2. 当温度达到 37 °C 后，按照制造商的校准程序进行操作。
   1. 将校准桥放置在肌动图仪上，确保 T 型平衡杆不接触与肌动图腔室力传感器相连的针。
   2. 确保力传感器针不受任何外力作用。当相对力稳定后，在 T 型桥上放置一个 2 g 的砝码，使 T 型平衡杆对力传感器针施加约 2 g 的力。
   3. 确认力读数在 9.71–9.91 mN 范围内。若符合，则校准完成。
3. 确定基线微米读数并记录该数值（即初始读数）。
   1. 在解剖镜下，确定两个平行针接近接触时的基线微米距离（图 4）。
      注意：请勿让两根针相互接触，以免损坏设备或干扰肌动图腔室内力传感器的正常工作。
4. 在解剖显微镜下，将 1 mm 主动脉节段套在两根针上，并使用微卡尺记录节段的宽度（图 6A）。然后将腔室单元连接至针式肌动图系统接口。
   ​注意：在安装主动脉时，应增加针之间的宽度以对主动脉节段施加张力，从而将其牢固固定在两根针上，防止主动脉节段脱落。
5. 若已对主动脉施加张力，且腔室已连接并安装至针式肌动图系统，则将微调定位器返回至上述步骤 3.3 中确定的"初始位置"。
6. 完成主动脉的预拉伸。
   1. 通过将两根针之间的距离从初始微调定位器位置增加 1 mm 来拉伸主动脉（图 6B）。
   2. 随后，通过将针返回至初始微调定位器读数来松弛主动脉。重复此拉伸-松弛过程三次（图 6A）。
      ​注意：在最后一次拉伸-松弛循环结束后，微调定位器应恢复至初始读数。
7. 在针式肌动图系统界面上，对每个正在使用的腔室进行力读数归零（图 7）。
8. 开始应力-应变实验。
   1. 通过调节微调定位器，将力读数增加至约 1 mN（图 7）。
   2. 在力达到约 1 mN 并平衡约 3–5 秒后，记录此时微调定位器的新读数以及第一个力读数。
   3. 将微调定位器每次增加 50 µm（即 5 个刻度/格），并让主动脉节段拉伸 3 分钟。3 分钟后记录力值。
   4. 每间隔 3 分钟继续将微调定位器增加 50 µm，并记录力值，直至达到"屈服点"。
      注意：屈服点是指主动脉发生不可逆结构损伤（如撕裂或断裂，或力值显著下降）前所能承受的最大力值。
   5. 在首次达到屈服点后，再额外拉伸 50 µm 以确认屈服点。确保此时力值保持下降状态或略高于屈服点。若未确认屈服点，则继续每 3 分钟增加一次，直至确认屈服点。
   6. 一旦确认屈服点，实验即告完成。立即开始数据分析。

4. 分析应力-应变针式肌动描记实验以确定胶原和弹性蛋白区域的弹性模量

1. 利用肌动图仪获得的力读数，结合以下公式绘制应力-应变曲线：
   菌株 (λ) = ∆d / [d(i)]
   此处 d 是直径和 d_i 是初始直径；
   应激 (t) = λL / [2(HD)] 
   其中 L 是一维载荷， H 是内膜中层厚度，以及 D 为血管长度。一旦生成应力-应变曲线，即按照前述方法利用曲线计算高力区和低力区^8,9 (图8).
2. 计算高力区域（胶原区域） (图8B).
   1. 根据应力-应变曲线最后四个数据点的线性回归拟合斜率，确定其弹性模量。要从应力-应变图中获取高力测量值，请按以下步骤操作：
      1. 右键单击图表上的数据点并选择 选择数据 > 添加 > 输入系列名称：弹性模量.
      2. 系列X值：从应变值中选择4个数据点。这些数据点应包括力接近其目标值时的3个点 "屈服点"确保将屈服点作为第四个点包含在内。
      3. Y 轴数值：从应力值中选择 4 个数据点，应包括力接近断裂点时的前 3 个点 "屈服点"确保将屈服点作为第四个点包含在内。
      4. 点击 好的 和 添加趋势线 > 线性 > 在图表上显示方程 > 显示 图表中的 R 平方值.
   2. 方程的斜率即为高力弹性模量。为确保弹性模量的准确性，R平方值应≥0.99。
3. 计算低应力区域（弹性蛋白区域） (图8C)
   1. 通过将七阶多项式方程拟合至数据（r），确定应力-应变曲线上以弹性蛋白为主区域（曲率约为0的低力区域）的边界² > 0.99），然后计算该方程的根。第一个根代表极低受力区域与弹性蛋白区域之间的边界，第二个根代表弹性蛋白区域与胶原纤维开始受力之间的边界。
   2. 然后，通过拟合两个根之间应力-应变数据的线性方程，将其斜率确定为低载荷区域的弹性模量^8,9。为了获得此结果：
      1. 制作一个电子表格，其列如图所示 补充表 1.
      2. 将其转化为一个 "txt" 记录并将其在R代码软件中打开 "弹性模量" R 脚本
      3. 为了使用数据，需检查斜率是否正常——3^rd R 输出中的导数图应呈 "M".
      4. 在 结果 标签，其下的数值 斜率 弹性模量是纵坐标。确保弹性模量的R平方值大于或等于0.99，以保证其准确性。
      5. 要在电子表格中获得该值，需选择从一阶导数和二阶导数之间所对应的应变值（及其相应的应力值） R 代码结果 表。
      6. 按照第4.2步中概述的步骤操作，以获得方程及R值² 电子表格图表中的数值。

5. 主动脉直径和管壁厚度的评估

1. 将最后1 mm的主动脉节段放入装有最佳切割温度（OCT）包埋剂的冷冻模具中。将组织环的管腔面朝下、居中放置于模具底部，确保管腔轴线与切面垂直，以获得横切面。
2. 准备一个盛有液氮冷却的2-甲基丁烷的容器，然后将冷冻模具浸入冷的2-甲基丁烷中，直至OCT变为不透明的白色。
3. 将冷冻模具储存于-80 °C直至切片。设置冷冻切片机温度至适宜的OCT切片温度（≈-20 °C），然后将冻结的组织块安装到样品夹持器上。
4. 固定于夹持器后，小心修块，保持切片厚度为7 µm，直至组织出现。
5. 在载玻片上标记小鼠编号，并以7 µm厚度切取4–5张主动脉组织的横切面。
6. 为将切片组织转移至载玻片，先将所有切片置于冷冻切片机的载物台（也称刀片台）上，再将标记好的载玻片直接覆盖其上。
7. 转移完成后，将载玻片在空气中干燥。
8. 在明场显微镜下以10倍放大倍数拍摄切片图像。将图像保存为JPG/TIFF格式，并在图片底部添加比例尺。
9. 进行分析时，打开ImageJ软件，依次点击 文件 > 打开，选择主动脉图像。
10. 打开主动脉图像后，使用Control + +图标放大比例尺区域，然后使用直线工具测量比例尺的长度。按Control + M以填充测量结果。结果中“长度”项的数值即为比例尺的实际测量值。
11. 为校准软件，依次点击 分析 > 设置尺度。在像素距离栏中输入ImageJ在第8步中测得的线段长度；在已知距离栏中输入比例尺的实际长度，并在单位栏中填写测量单位（µm、mm、cm等）。
12. 勾选全局选项框，以自动校准后续所有图像。注意其他图像中的比例尺是否不同，或ImageJ是否已关闭；若存在上述情况，则需重新校准。
13. 测量管壁厚度时，使用直线工具，从管腔内缘垂直画线至外膜外缘。按Control + M，测量结果将自动填入结果选项卡中。
14. 重复步骤5.13，在主动脉周长上均匀选取6个位置进行测量，并记录每个数值。
15. 为计算每只小鼠主动脉的平均厚度，取同一只小鼠的4–5个样本所得厚度值求平均。
16. 测量管腔直径时，选择多边形工具，顺时针描记管腔内边界。按Control + M记录周长（µm）。
17. 以逆时针方向重复描记，起始点选择不同位置。确保两次测得的周长值接近，并取其平均值作为该主动脉环的周长。
18. 对同一只小鼠的4–5个主动脉样本重复步骤5.16，并将所有周长值取平均。
19. 计算直径时，使用公式： 直径（µm）= 周长 / 3.14。

6. 循环环境介导的主动脉弹性模量

注意：为了确定循环因子或特定化合物是否改变主动脉的内在硬度，可将未经干预的小鼠胸主动脉环进行孵育 离体 在定义的标准培养条件下（37 °C，5% CO₂）₂，20% O₂₂，加湿）（图9).

1. 解剖胸主动脉，每种条件取两个1 mm长的环状节段。清除所有血管周围脂肪组织。
2. 在96孔板中，将主动脉环置于由DMEM加1%青霉素-链霉素组成的标准培养基中孵育。
3. 向培养基中加入实验处理物。对于血浆或血清（可使用未经处理的血浆/血清），使用量为培养基总体积的10%。可使用临床前及临床（人源）血浆或血清^3,4,6 (图9).
4. 为确定在研究组间存在差异的循环因子的因果作用，可重复进行血浆/血清暴露实验，同时校正组间观察到的浓度差异（即标准化目标因子的浓度），确定目标因子在代表组间平均差异浓度下的直接效应，或阻断被认为介导循环环境效应的因子的信号通路。
   注意：后两种方法先前分别使用三甲胺-N-氧化物（TMAO）进行过⁵ 并阻断晚期糖基化终末产物受体³.
5. 为阐明过量超氧化物相关的氧化应激或线粒体在其中的作用
   在此模型系统中，为特异性检测超氧阴离子相关的氧化应激，请在孵育主动脉环时使用以下相应浓度：TEMPOL：1 µM^5,10 和 MitoQ：1 µM⁶.
6. 孵育48–72小时后，将主动脉环装入针式肌动图仪，并按照上述步骤进行操作。

结果

年龄相关的主动脉硬化

对于内在机械刚度，记录每个拉伸区间的相应作用力，并用于计算。在前述计算中，将生成应力-应变曲线，并计算这些曲线中1）胶原区域和/或2）弹性蛋白区域的弹性模量，具体方法如上所述，最初由Gioscia-Ryan等人⁹提出。应力-应变曲线中以胶原为主区域的弹性模量，通过拟合应力-应变曲线最后4个数据点所得线性方程的斜率来确定^8,9,11,12,13。应力-应变曲线中以弹性蛋白为主区域（低作用力区域）通过拟合一个七阶多项式方程（r ²> 0.99）并计算其根来确定。第一个根被定义为极低作用力区域与弹性蛋白区域之间的边界，...

讨论

使用微血管张力测定法评估主动脉内在硬度 离体 可评估主动脉固有僵硬度，且不受潜在混杂因素影响 体内 生理变量，如血压和自主神经输入²此外，这 离体 实验方法为筛选可能介导主动脉固有刚度差异的潜在分子机制提供了机会。本文提供了利用针式肌动描记法评估主动脉固有刚度的逐步操作指南，并展示了我们先前研究中使用该方法获得的代表性结果。此外，我们还详细说明了如何利用临床前和临床生物样本，探究循环环境在调节主动脉固有刚度中的作用，以及如何确定循环中特定因子在导致主动脉固有刚度差异中的因果作用。

我们先前已证明，在老年（27月龄）与年轻成年（6月龄）野生型C57BL/6N小鼠的主动脉组织中，主动脉僵硬度的胶原成分（即胶原主动脉弹性模量）升高，而弹性蛋白成分（即弹性蛋白主动脉弹性模量）则降低^8,9。此外，我们已确立循环环境在介导年龄相关性主动脉僵化中的直接作用——即将未经干预的年轻成...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-甲基丁烷	菲舍尔科技	AA19387AP
牛血清白蛋白	菲舍尔生物试剂	BP1600
氯化钙二水合物	西格玛-奥德里奇	C7902
冷冻模具	菲舍尔科技	NC9511236
D-(+)-葡萄糖（右旋糖）	西格玛-奥德里奇	G7021
DMEM	菲舍尔科技	MT10017CV
EDTA（分析纯）	菲舍尔化学	E478
氯化钾	西格玛-奥德里奇	P4504
七水合硫酸镁	西格玛-奥德里奇	M2773
MitoQ	凯曼化学	845959-50-4
磷酸二氢钠	西格玛-奥德里奇	S5011
MOPS（钠盐）	西格玛-奥德里奇	M9024
多通道血管张力测定系统	丹麦肌张力技术公司（DMT）	620M
氯化钠	菲舍尔化学	S271
青霉素-链霉素	菲舍尔科技	15-140-148
RAGE 抗体	R&D 系统	AF1145
丙酮酸钠	西格玛-奥德里奇	P2256
TEMPOL	西格玛-奥德里奇	2226-96-2
Tissue-Tek OCT 包埋剂	樱花	4583
三甲胺 N-氧化物（TMAO）	西格玛-奥德里奇	317594