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研究文章

MPO 表达与乳腺癌免疫微环境的关联：基于生物信息学与单细胞分析的见解

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DOI：

10.3791/71189

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2026年8月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2Third Affiliated Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 5College of Traditional Chinese Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种可重复的生物信息学与单细胞分析工作流程，用于探索髓过氧化物酶（MPO）表达与乳腺癌中免疫/髓系特征之间的关联。由于分析基于公开数据集和计算机模拟方法，研究结果应视为探索性发现，并用于提出假设。

摘要

乳腺癌仍是癌症相关死亡的主要原因，探索性计算工作流程有助于优先筛选与免疫相关的标志物以供进一步研究。本研究利用癌症基因组图谱乳腺浸润性导管癌（TCGA-BRCA）的批量转录组数据以及公共单细胞数据集GSE161529，分析髓过氧化物酶（MPO）表达与临床结局、免疫浸润、甲基化、上游调控因子注释、单细胞表达模式、虚拟敲低敏感性结果、药物-基因相互作用检索以及吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）注释之间的关联。在乳腺癌组织中，MPO表达水平低于邻近非肿瘤组织。较高的MPO表达与更长的无进展间隔期相关，但其与总生存期和疾病特异性生存期的关联无统计学显著性。受试者工作特征（ROC）分析提示在所分析的公共数据集中存在肿瘤与正常组织的区分能力，但不应将其解读为临床诊断验证。免疫去卷积与富集分析表明，MPO表达主要与免疫相关及髓系相关转录特征共变，而非表明其对肿瘤微环境中的免疫反应具有内在调控作用。在单细胞分辨率下，MPO信号稀疏，在基于k近邻（KNN）的邻域扩展前仅检测到85个MPO阳性细胞。由于稀疏表达、细胞类型注释不确定性、dropout效应、双细胞污染或环境RNA等因素可能影响结果，对可检测的MPO信号及MPO相关评分的解释需持谨慎态度。 在计算机中 虚拟敲低提示了候选的免疫和炎症相关转录变化，但这些结果被视为探索性发现，需进一步验证。基于药物-基因相互作用数据库（DGIdb）的药物-基因检索及ADMET注释仅用作初步的化学注释，不被解释为治疗证据。总体而言，本研究提供了一种可重复的计算机模拟工作流程，用于提出关于乳腺癌中MPO相关免疫/髓系特征的假设，但这些假设仍需在外部队列中验证并进行实验确认。

引言

乳腺癌是一种高度异质性的免疫相关恶性肿瘤1。其疾病进展、复发和转移风险以及治疗反应与肿瘤免疫微环境（TIME）的组成和功能状态密切相关2。尽管综合治疗策略正在不断优化，但部分患者仍会出现疾病进展或复发，凸显了迫切需要识别能够表征TIME状态并支持风险分层的分子生物标志物，同时阐明其潜在机制。

髓过氧化物酶（MPO）是一种含血红素的过氧化物酶，主要在中性粒细胞中表达，在较小程度上也在单核细胞和巨噬细胞中表达。通过生成次氯酸及其他活性氧化物，MPO 参与抗菌防御，但也可能促进氧化性组织损伤和慢性炎症。在癌症中，MPO 的生物学意义似乎具有情境依赖性3。一方面，MPO 介导的氧化应激已被认为通过 DNA 损伤、脂质和蛋白质氧化、炎症信号传导以及肿瘤微环境的重塑，参与了致癌过程和肿瘤进展4,5,6。另一方面，在某些肿瘤背景下，MPO 阳性的先天免疫细胞或髓系细胞浸润与较好的预后或抗肿瘤免疫活性相关7,8,9。这些看似矛盾的研究结果提示，MPO 的临床和生物学意义可能取决于肿瘤类型、疾病阶段、MPO 的细胞来源以及肿瘤微环境的免疫组成。然而，MPO 在乳腺癌中的表达模式及其预后意义，特别是在单细胞水平上的特征，仍尚未完全阐明。

肿瘤免疫微环境（TIME）包含异质性的髓系、淋巴系、基质和上皮细胞组分10。髓过氧化物酶（MPO）经典地与中性粒细胞及其他髓系来源细胞相关，因此在整体肿瘤表达谱中检测到的MPO相关信号可能反映的是免疫细胞组成，而非肿瘤细胞内在的活性10。在乳腺癌中，MPO信号在整体及单细胞数据集中的分布情况、其与免疫浸润估计值的关联性，以及下游计算分析的可重复性仍缺乏充分表征。因此，本研究将MPO视为一个与免疫相关的标志物，用于探索性工作流程的开发，而非作为已证实的TIME因果调控因子或经验证的治疗靶点。与单一队列的差异表达分析或单一平台的免疫浸润估计相比，整合整体转录组学、免疫去卷积、甲基化注释、单细胞图谱映射和计算扰动分析的工作流程，可提供更全面的基因相关免疫背景的探索视角。该方法有助于优先筛选候选标志物并生成可验证的假设，尤其在尚无实验数据可用时具有重要意义。然而，此类计算整合本身无法确定基因的细胞来源、因果关系、药理活性或临床实用性。随着大规模公共癌症队列和单细胞转录组技术的发展，生物信息学方法可用于在群体和单细胞水平上探索基因表达、临床结局、免疫细胞组成及转录状态之间的关联11。基于单细胞基因调控网络的计算扰动方法，可能进一步提供有关基因相关转录敏感性的假设生成信息12,13。因此，本研究旨在表征MPO在乳腺癌中的表达模式、生存关联、免疫/髓系背景、甲基化谱、单细胞分布以及探索性计算扰动谱。整体工作流程如图1所示。

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方案

从 TCGA 数据库获取数据

TCGA 乳腺浸润性癌（TCGA-BRCA）队列的RNA测序数据和临床信息来自基因组数据共享门户14。从该门户提取了以每百万转录本（TPM）格式表示的STAR流程RNA-seq数据，并匹配相应的临床注释信息。排除了缺乏对应临床信息的RNA-seq样本。在基于表达水平的分析中，TPM值被转换为log2(TPM + 1)。使用基因符号MPO和Ensembl基因ID ENSG00000005381.8提取MPO的表达数据。对于需要将样本分为MPO高表达和低表达组的分析，仅纳入TCGA-BRCA肿瘤样本，排除邻近的正常组织样本。肿瘤样本根据TCGA-BRCA肿瘤样本中log2(TPM + 1)转换后的MPO表达值的中位数进行分组：MPO表达值大于或等于中位数的样本归入MPO-high组，低于中位数的样本归入MPO-low组。除非另有说明，该基于中位数的分组策略用于生存分析、差异表达分析、富集分析、甲基化分组以及免疫细胞富集比较。临床病理特征，包括性别、年龄、种族、病理T分期、组织学分级、PAM50亚型、病理分期、肿瘤状态，以及总生存期（OS）、无进展间隔期（PFI）和疾病特异性生存期（DSS）等生存终点，均使用R 4.2.1版本进行分析。

公共免疫组织化学图像检索

采用邻近的正常乳腺组织和乳腺癌组织的髓过氧化物酶（MPO）免疫组织化学（IHC）代表性图像作为蛋白质水平的定性参考。这些图像未纳入定量形态测量或统计学分析。方框区域表示高倍放大显示的部位。比例尺在20×图像中表示100 µm，在40×图像中表示50 µm。

表达相关性分析

采用 TCGA-BRCA 数据集分析在乳腺癌中与 MPO 表达共变的基因。计算 MPO 与所有蛋白编码基因之间的全基因组 Pearson 相关系数，并选取正相关性最强的前 30 个基因和负相关性最强的前 30 个基因用于可视化展示。对于涉及多个检测基因的相关性分析，采用 Benjamini-Hochberg 错误发现率方法对名义 p 值进行校正。MPO 相关的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络通过相互作用基因/蛋白质检索工具（STRING）数据库构建，仅保留相互作用评分大于 0.40 的蛋白质对用于可视化15。

功能富集 分析

通过比较MPO高表达与MPO低表达的TCGA-BRCA肿瘤组，筛选出差异表达基因（DEGs），筛选阈值设定为|log2FC| > 1，且经Benjamini-Hochberg方法校正的p值 < 0.05。采用R软件包clusterProfiler 4.4.4对差异表达基因进行功能富集分析，包括基因本体（GO）的生物过程、细胞组分、分子功能以及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析16,17,18,19,20。当校正后的p值 < 0.05时，认为GO和KEGG富集项具有显著性。

基于MPO高表达组与MPO低表达组之间差异表达统计量的预排序基因列表，进行基因集富集分析（GSEA）。分析使用了MSigDB C2经典通路集合c2.cp.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt，该集合对应于MSigDB v2022.1.Hs，包含3,050个基因集21,22。富集结果的显著性判定标准为Benjamini–Hochberg校正后的p值< 0.05、FDR q值< 0.25，以及|标准化富集评分|> 1。在适用情况下，使用GOplot软件包计算显著富集项的Z分数，用于可视化展示。

肿瘤中免疫细胞富集的分析

使用R软件包estimate 1.0.13版本中实现的ESTIMATE算法，评估TCGA-BRCA队列中的免疫和基质成分。以log2(TPM + 1)转换后的表达数据作为输入，计算每个肿瘤样本的免疫评分、基质评分和ESTIMATE评分。利用TIMER/TIMER2.0分析MPO表达水平与TCGA-BRCA队列中主要免疫细胞群体估计浸润水平之间的关联，包括B细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞23,24,25。基于TIMER的结果被解释为来自相应在线资源的免疫浸润估计值。针对24种免疫细胞类型的免疫细胞富集分析，采用R软件包GSVA 1.46.0版本进行单样本基因集富集分析（ssGSEA）26。基于CIBERSORT解析22种免疫细胞类型所使用的LM22免疫细胞特征矩阵见补充表1。采用Spearman秩相关分析MPO表达水平与免疫细胞富集评分之间的相关性。利用Wilcoxon秩和检验比较按中位数划分的MPO高表达组与MPO低表达组肿瘤之间免疫细胞富集评分的差异。对于涉及多种免疫细胞类型的分析，采用Benjamini–Hochberg错误发现率方法对p值进行校正。

MPO 基因的 DNA 甲基化

使用MethSurv评估MPO基因座内的DNA甲基化模式。TCGA-BRCA的CpG甲基化β值及其与生存的相关性数据均来自MethSurv平台。对选定的MPO相关CpG位点进行可视化，并利用MethSurv提供的生存分析结果评估其与生存结局的关联27。对于涉及多个CpG位点的分析，采用Benjamini-Hochberg错误发现率方法在所检测的MPO相关CpG位点间对p值进行校正。这些甲基化分析被解读为探索性表观遗传注释。

中性粒细胞相关基因的PPI网络构建及相关性分析

为了研究髓过氧化物酶（MPO）与中性粒细胞相关生物学之间的关联，进行了系统的网络分析。从现有文献中整理出一组包含已确立的中性粒细胞活化及相关的炎症过程介质的基因集。完整的中性粒细胞相关基因列表见补充表2。将基因符号统一为官方基因符号，去除重复条目，并将可用基因与TCGA-BRCA表达矩阵取交集后，进行STRING/蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析、枢纽基因优先排序以及MPO与枢纽基因的相关性分析。使用STRING数据库（版本11.5）构建这些基因之间的PPI网络，设定中等置信度相互作用评分阈值（>0.40）。基于度中心性（即每个节点直接相互作用的数量）对网络中的枢纽基因进行算法优先排序。选取度评分最高的前20个基因用于后续相关性分析。

随后，从 TCGA-BRCA 转录组数据集中提取了这些枢纽基因和 MPO 的表达谱。采用 Spearman 秩相关对 MPO 与每个枢纽基因之间的关联性进行统计学评估。为了刻画枢纽基因彼此之间的相关性模式，计算了所有肿瘤样本中两两之间的 Spearman 相关矩阵。这些相关性分析为后续的可视化提供了定量基础，包括 MPO 与枢纽基因相关性的棒棒图，以及展示枢纽基因间相关性模式的和弦图/热图。

靶向 MPO 的上游转录因子和 miRNA 的预测

利用 KnockTF 数据库（https://bio.liclab.net/KnockTF/index.php）28,29、ChIP 数据库（http://chip-atlas.org/）30,31 和 GTRD 数据库32,33（https://gtrd.biouml.org/#!）预测 MPO 的靶向转录因子。此外，使用 TargetScan 数据库（https://www.targetscan.org/vert_80/）预测靶向 MPO 的潜在 miRNA 结合位点。Venn 图通过 MicroBioinformatics 网站（https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/example.html）34 生成。

髓过氧化物酶的单细胞分析

特定数据集 GSE161529 来源于基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）。数据预处理首先在细胞水平进行过滤，以排除低质量细胞——即满足以下任一条件的细胞：线粒体基因表达超过 25%、总唯一分子标识符（UMI）计数低于 5000，或检测到的基因数少于 2500 个。随后，对环境 RNA 污染和技术批次效应进行了校正35。采用主成分分析（PCA）进行降维以评估细胞间的相似性，继而使用 UMAP 进行细胞聚类与可视化。然后，根据细胞的典型标记基因，将不同聚类注释为相应的细胞类型11。用于单细胞特征评分的 MPO 相关基因集见于补充文件 1。在评分前，基因符号被统一为官方基因符号，去除重复条目，并将可用基因与 GSE161529 表达矩阵取交集。采用 AUCell、Seurat AddModuleScore 和 ssGSEA 方法计算每个细胞的 MPO 相关评分。三种方法所得评分经 Z 分数标准化，缩放至可比范围后整合，生成用于下游描述性分析的综合 MPO 相关评分。通过分析细胞间相互作用网络，比较了基于 MPO 相关信号分层的上皮肿瘤细胞与多种伙伴细胞类型之间推断的配体–受体通讯模式。这些结果被解读为描述性通讯模式，而非表明表达 MPO 的细胞直接介导细胞间通讯的证据。

使用 scTenifoldKnk 进行 MPO 的单细胞虚拟敲低及通路富集分析

通过整合 Seurat 和 scTenifoldKnk 对 MPO 进行了单细胞虚拟敲低分析。在完成标准质控（每个细胞检测到 200–6,000 个基因；线粒体基因比例 < 10%）后，对数据进行对数归一化处理，并选取 2,000 个高变基因用于降维和聚类分析。为富集与 MPO 相关的细胞环境，保留了髓系/中性粒细胞基因模块评分位于前 50% 的细胞。在这些细胞中，通过在 PCA 空间中以 MPO 阳性细胞为种子点，使用 k = 40 的最近邻扩展方法，定义了一个 MPO 邻近细胞亚群。该扩展亚群并不被视为纯粹的 MPO 阳性细胞群体，且未从该 KNN 扩展步骤中得出任何关于细胞类型比例的结论。随后，使用高变基因与 MPO（在 ≥25 个细胞中表达）的并集作为基因集合，对该亚群进行 scTenifoldKnk 虚拟敲低分析。筛选出显著扰动的基因（FDR < 0.05，经 BH 校正）。对所得基因进一步进行 GO 生物过程和 KEGG 通路的功能富集分析（q < 0.05）。

探索性药物-基因检索与 ADMET 注释

通过查询DGIdb获取初步的MPO相关药物-基因或化学物质-基因相互作用记录。由于数据库导出的相互作用列表可能包含由不同证据类型支持的条目，且未必直接对应具有临床可操作性的治疗药物，因此所获得的化合物被视为探索性注释，而非优先考虑的治疗候选物。随后使用SwissADME和ADMETlab汇总预测的理化性质、药代动力学及毒理学特性。这些计算机预测的注释信息用于为化合物层面的解读提供初步背景，并强调在考虑任何治疗相关性之前，仍需进一步开展药理学、毒理学和临床层面的系统整理36。

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结果

乳腺癌中 MPO 的表达模式及探索性生存关联

为了描述MPO在多种癌症数据集中的表达模式，我们分析了TCGA泛癌数据集中的MPO RNA-seq数据，发现膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳腺浸润性癌（BRCA）、多形性胶质母细胞瘤（GBM）、头颈部鳞状细胞癌（HNSC）、肾嫌色细胞癌（KICH）、肝细胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、胰腺腺癌（PAAD）、前列腺腺癌（PRAD）和甲状腺癌（THCA）的肿瘤组织中MPO表达水平较低，而结肠腺癌（COAD）、肾乳头状细胞癌（KIRP）及其他组织中MPO表达水平较高（图2A）。随后，我们评估了每种癌症类型中MPO表达与临床结局之间的关联。在TCGA-BRCA队列中，无论配对还是非配对比较，均显示肿瘤组织中的MPO表达低于正常/邻近组织（图2B、C）。根据肿瘤MPO表达的中位值将TCGA-BRCA肿瘤样本分层后，Kaplan-Me...

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讨论

本研究提出了一种探索性的公共数据集和计算机模拟工作流程，用于分析髓过氧化物酶（MPO）表达与乳腺癌中免疫/髓系特征之间的关联。TCGA-BRCA 分析显示，MPO 在肿瘤组织中的表达低于相邻的非肿瘤组织，且较高的 MPO 表达与更长的无进展间隔期相关。然而，总生存期和疾病特异性生存期的差异无统计学意义。因此，根据现有证据，不应将 MPO 视为可靠或已确立的预后生物标志物。未来的研究应采用多变量 Cox 回归模型评估 MPO，调整已确立的临床病理学变量，并结合独立验证队列和亚型分层分析。

与传统的单队列差异表达分析或单平台免疫浸润估计相比，这种以MPO为中心的工作流程整合了大规模转录组学、免疫富集、甲基化注释、单细胞映射以及虚拟扰动分析，从而更全面地探索与MPO相关的免疫/髓系特征。然而，该工作流程仍是对外部队列验证、空间或蛋白水平验证以及实验性扰动检测的补充，而非替代。

免疫浸润和富集结果应被解读为与MPO相关的免疫微环境，而非由MPO驱动的免疫重塑。MPO主要在中性粒细胞及其他髓系细胞中表达

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披露

作者声明本工作中不存在利益冲突。仅在稿件修改期间使用了基于人工智能的语言编辑工具，以辅助润色英文语言并提高可读性。该工具未用于研究设计、数据分析、图表生成、结果解释、参考文献选择或科学结论的推导。所有分析、结果、解释、参考文献及最终文本均经过作者仔细核对、审阅和批准，作者对稿件内容负全部责任。

致谢

作者感谢航天中心医院科研基金（YN202530）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CellChatR 软件包/开源https://github.com/sqjin/CellChat细胞间通讯分析
ChIP-Atlas公共数据库https://chip-atlas.org/转录因子靶点筛选；2021 年更新 
clusterProfilerBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/GO/KEGG 富集分析；v4.4.4
CytoscapeCytoscape 联盟https://cytoscape.org/网络可视化与拓扑结构分析
DGIdb华盛顿大学/公共数据库https://www.dgidb.org/药物-基因相互作用检索
GDC/TCGA-BRCA美国国家癌症研究所https://portal.gdc.cancer.gov/批量转录组学与临床数据来源
基因表达综合数据库：GSE161529NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/单细胞数据集来源
GSEA/MSigDBBroad 研究所https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb基因集富集分析与基因集参考；版本 3.0 
GSVABioconductorhttps://bioconductor.org/packages/GSVA/基因集变异/ssGSEA 相关评分；版本 1.46.0
GTRD公共数据库http://gtrd.biouml.org/转录因子靶点筛选；2021 年 
KnockTF公共数据库http://www.licpathway.net/KnockTF/index.html转录因子扰动资源；版本 2.0 
R统计计算 R 基金会https://www.r-project.org/统计计算环境
scTenifoldKnkR 软件包/开源https://github.com/cailab-tamu/scTenifoldKnk虚拟敲低分析
SeuratR 软件包/开源https://satijalab.org/seurat/单细胞预处理与聚类分析
STRINGELIXIR/公共数据库https://string-db.org/蛋白质-蛋白质相互作用分析；v11 
SwissADMESIB 瑞士生物信息学研究所http://www.swissadme.ch/类药性评估；2017 年发布/网络工具 
TIMER公共网络资源https://timer.cistrome.org/免疫浸润分析；TIMER2.0 
UCSC Xena 或关联的 TCGA 门户UCSChttps://xenabrowser.net/探索性数据访问/验证 

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