本方案旨在利用孟德尔随机化（MR）和美国国家健康与营养检查调查（NHANES）数据，研究生活方式、饮食与尿路结石之间的关联。
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研究文章
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本方案旨在利用孟德尔随机化（MR）和美国国家健康与营养检查调查（NHANES）数据，研究生活方式、饮食与尿路结石之间的关联。
本研究通过整合孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）分析与美国国家健康与营养检查调查（National Health and Nutrition Examination Survey, NHANES）数据，评估了生活方式习惯和膳食因素对尿石症风险的影响。工具变量来源于全基因组关联研究数据集，而尿石症结局数据则来自FinnGen数据库。主要的MR分析采用逆方差加权法，并通过其他多种MR方法验证结果的稳健性。NHANES数据进一步评估了生活方式特征、膳食模式与肾结石发生之间的关系。MR分析表明，较高的税前收入与尿石症风险呈负相关。摄入较多的新鲜水果和茶，以及较高的钾和维生素E摄入量，也与较低的结石形成可能性相关。NHANES分析发现，睡眠剥夺、睡眠障碍、抑郁和较高的体重指数是肾结石病的显著危险因素。此外，以较高的膳食炎症指数评分为代表的促炎性膳食模式会增加结石风险，而遵循2020年健康饮食指数（HEI-2020）、终止高血压膳食疗法（DASH）和替代性地中海饮食（aMED）等膳食模式则显示出保护性关联。这些发现为进一步理解可调控的饮食和生活方式对尿石症的影响提供了依据，可能有助于预防和治疗策略的制定。
全球尿石症的发病率不断上升，一生中约有10%的人口曾受其影响，在工业化国家中患病率更高1,2,3。由于诊断、治疗以及反复发作的结石事件管理所带来的费用，该疾病给医疗系统带来了沉重负担。此外，尿石症可导致严重并发症，包括肾绞痛、血尿、尿路感染和慢性肾病，从而影响患者的生活质量并增加发病率4,5。
尽管尿石症患病率较高且给医疗系统带来沉重负担，但其发病机制仍不明确。目前的研究已确定多种与尿石形成相关的危险因素，包括饮食习惯、液体摄入量、肥胖、代谢紊乱以及遗传易感性6,7,8,9。尽管以往的观察性研究已分别将各种生活方式行为或饮食因素与尿石风险相关联，但大多数研究仅孤立地考察这些暴露因素，或未考虑遗传混杂的影响。因此，迫切需要采用更为严谨的方法来揭示这些危险因素与尿石症发生之间的因果关系。孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）是一种分析方法，利用遗传变异作为工具变量来评估暴露对结局的因果效应，从而减少混杂偏倚和反向因果关系的影响10。通过应用MR方法，研究人员能够加强风险因素与疾病结局之间因果推断的可靠性，从而更清晰地揭示疾病的病因机制。
本研究采用孟德尔随机化（MR）方法，探讨多种风险因素与尿石症发病风险之间的因果关系。此外，我们利用美国国家健康与营养调查（NHANES）这一全面且具有全国代表性的数据集对研究结果进行验证。通过整合遗传流行病学与传统流行病学数据，本研究旨在更明确地阐明影响尿石形成的相关因素，并识别潜在的预防和干预靶点。我们假设，生活方式和饮食因素对尿石形成风险具有因果效应，即不健康行为会增加风险，而某些特定的有益饮食成分则可降低风险。
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国家健康与营养检查调查（NHANES）的研究方案已获得国家卫生统计中心（NCHS）研究伦理审查委员会（ERB）的批准。由于NHANES数据集是公开可获取的，研究人员无需向其所在机构的审查委员会（IRB）另行申请批准。本全基因组关联研究（GWAS）的汇总统计结果也可公开获取。根据数据存储库的使用条款以及授予原始研究调查人员的批准，本二次分析无需新的IRB批准或额外的个体知情同意。每个参与的GWAS研究均在其原始出版物中提供了伦理监督和知情同意程序的详细信息。所有分析均遵循各机构的政策以及《赫尔辛基宣言》的原则。完整的研究方案详见图1。
磁共振设计
双样本孟德尔随机化（two-sample MR）是一种利用可公开获取的大样本全基因组关联研究（GWAS）数据集中的遗传工具（即单核苷酸多态性 [SNPs]）作为工具变量（IVs），来识别暴露表型与结局之间因果关系的方法。通过弥补观察性研究中残余混杂因素和反向因果关系等常见缺陷，双样本MR可增强推断暴露-结局关联因果性的能力。一项设计良好的MR研究基于以下三个假设：（i）相关性假设：遗传变异与风险因素相关；（ii）独立性假设：遗传变异与混杂因素无关；（iii）排他性限制假设：遗传变异仅通过风险因素影响结局11,12。
数据来源与工具变量的选择
在本项MR分析中，我们检索了公开可用的GWAS数据库，包括IEU openGWAS、GWAS目录以及已发表的GWAS汇总数据，以获取符合条件的暴露数据集。因此，无需额外的伦理审批。暴露因素被分为两类：（i）生活方式因素和（ii）饮食因素。对于每种暴露，选择标准如下：（1）GWAS研究对象为欧洲血统个体，以尽量减少人群分层影响；（2）样本量足够大（通常 >100,000名参与者），以确保工具变量选择具有足够的统计效能；（3）GWAS提供了包含单核苷酸多态性（SNP）水平效应估计值、标准误和p值的汇总数据；（4）表型定义与我们关注的暴露一致。当同一暴露存在多个数据集时，我们优先保留样本量最大的数据集，因为更大的样本量可提供更精确的效应估计，并产生更多全基因组显著的SNP作为工具变量。当样本量相近时，我们选择表型定义最严格的数据集，或排除了与结局GWAS存在样本重叠的数据集，以避免潜在的样本重叠偏倚。
最初，我们设定全基因组显著性阈值为 p < 5E-8，以识别与每种暴露因素高度相关的SNP。然而，由于某些潜在风险因素作为暴露时所识别出的SNP数量有限，我们采用了稍高的截断值，范围为 p < 1E-7 至 p < 1E-5。本研究中所用暴露因素的详细信息见补充表1。所有SNP均进行了剪枝（clumping），以在严格的剪枝窗口下避免连锁不平衡（r2 = 0.01 且 kb = 5,000）。采用严格模式进行数据协调（harmonization）（action=3），以剔除等位基因频率为中间值的回文SNP。使用F统计量评估工具变量（IVs）与暴露因素之间的相关强度，并剔除F < 10的IVs，以确保各潜在风险因素的遗传工具关联强度，并避免弱工具偏倚。尿石症数据（病例数 = 9713，对照数 = 366,693）提取自FinnGen数据库（finngen_R9_N14_CALCUKIDUR），该数据库是一个大型公共项目，涵盖超过37万名芬兰生物样本库参与者13。尿石症的诊断依据ICD-10标准。
MR 统计分析
工具变量选择、孟德尔随机化分析及数据可视化均在 R 中进行，主要使用支持 TwoSampleMR 和 MRPRESSO 的软件包。采用了多种孟德尔随机化方法，包括逆方差加权随机效应模型（IVW）14,15、MR-Egger16、加权中位数法17、加权众数法18 和简单众数法19。随机效应 IVW 模型被作为主要分析方法，因为在不存在方向性多效性的情况下，该方法可通过元分析整合每个工具变量的 Wald 比值，提供可靠的因果估计。此外，还进行了 MR-Egger、加权中位数、加权众数和简单众数分析，以评估研究结果的一致性和稳健性。
采用 Cochran’s Q 统计量评估各个 SNP 之间的异质性。通过逐一剔除每个工具变量的留一法敏感性分析，进一步检验孟德尔随机化（MR）估计值的稳定性。使用 MR-Egger 截距检验和孟德尔随机化多效性残差和异常值（MR-PRESSO）方法，评估多效性及异常值 SNP 对因果推断的影响。采用 Benjamini–Hochberg 方法进行多重检验校正，并以错误发现率调整后的 p 值阈值 0.0520 作为具有统计学意义的标准。孟德尔随机化分析的统计效能计算通过在线工具完成，该工具网址为 https://sb452.shinyapps.io/power/。因果关联以比值比及其相应的 95% 置信区间表示。所有统计分析均使用由统计计算基金会开发的 R 软件 4.2.2 版本进行。
观察性研究人群与设计
用于横断面研究的20,797名参与者来自2009–2020年周期的美国国家健康与营养调查（NHANES），该调查基于分层、多阶段概率抽样设计，针对美国非机构化平民人口的全国代表性样本进行。完整的纳入与排除标准见补充图1。在24,593名完成饮食访谈和肾脏状况问卷的参与者中，排除了生活方式和人口统计学信息等数据缺失者。所有参与者均回答了肾脏状况问卷，并被问及“是否曾患过肾结石？”若回答为“是”，则定义为患有肾结石。
膳食模式评分
通过收集NHANES参与者的全面膳食摄入数据，评估其在访谈前24小时内所摄入食物所产生的能量消耗、营养素摄入以及其他食物成分。由于面对面的膳食访谈能提供更高的准确性和一致性，因此采用首次访谈的膳食数据来评估膳食质量，并生成膳食质量指数。膳食炎症指数（Dietary Inflammatory Index, DII）通过整合45种具有促炎或抗炎特性的膳食成分，用于评估个体膳食模式的炎症特性21。计算DII时使用了来自NHANES的28种食物。DII得分越高（正值越大），表示促炎能力越强；而DII得分越低（负值越大），则表示抗炎能力越强。健康饮食指数-2020（Healthy Eating Index-2020, HEI-2020）是最新版本，用于评估膳食摄入与2020–2025年美国膳食指南（DGA）之间的符合程度，包含13个组别：总水果、全果、蔬菜和豆类、全谷物、乳制品、总蛋白质食物、海鲜和植物蛋白、脂肪酸、精制谷物、钠、添加糖以及饱和脂肪摄入22,23。HEI-2020得分范围为0至100分，得分越高表示膳食越健康。阻止高血压的膳食方法（Dietary Approaches to Stop Hypertension, DASH）评分包含九个成分：总脂肪、饱和脂肪、蛋白质、纤维、胆固醇、钙、镁、钾和钠，评分范围为0至9分，得分越高表示越符合DASH膳食模式24。替代性地中海饮食模型（alternative Mediterranean Diet model, aMED）包含九个成分：蔬菜、豆类、水果、坚果、全谷物、红肉和加工肉类、鱼类、酒精以及单不饱和脂肪与饱和脂肪的比例25。aMED得分范围为0至9分，得分越高表示越符合地中海饮食模型。上述所有膳食模式评分均使用“dietaryindex” R软件包进行计算。
生活方式与协变量
问卷数据提供了有关参与者人口统计学特征、健康状况和生活方式特征的信息，包括年龄、性别、种族或族裔、教育程度、家庭收入、体力活动、吸烟习惯和饮酒情况。种族和族裔被分为非西班牙裔白人、非西班牙裔黑人、墨西哥裔美国人、其他西班牙裔群体以及其他种族或族裔类别。教育程度分为高中以下教育和高中以上教育两类。家庭收入水平通过贫困收入比（PIR）界定：低收入（PIR < 1.30）、中等收入（1.30 ≤ PIR < 3.50）和高收入（≥ 3.50）。糖尿病病史根据自我报告（是或否）获取。闲暇时间体力活动（LTPA）根据运动强度和持续时间分为三类：中等强度运动 < 75 分钟；75–150 分钟；以及 ≥ 150 分钟，或高强度活动 ≥ 75 分钟。久坐行为根据久坐时间被划分为是（≥ 6 小时）或否（< 6 小时）。根据PHQ-9问卷评分和抑郁状况，抑郁评分 ≥ 10 被归类为临床抑郁阈值。吸烟定义为曾经吸烟（ lifetime 吸烟超过100支）。饮酒情况分为从不饮酒、适度饮酒（男性每天 ≤ 2 饮，女性每天 ≤ 1 饮）和重度饮酒（男性每天 > 2 饮，女性每天 > 1 饮）。睡眠时长分为三类（< 7 小时、7–9 小时和 ≥ 9 小时），睡眠问题根据自我报告分为是或否。体重指数（BMI）分为偏瘦或正常（< 25 kg/m2）、超重（25–30 kg/m2）或肥胖（> 30 kg/m2）。
统计学分析
针对总体研究人群，总结了参与者的特征，并根据肾结石状况进一步分类。连续变量以均值及其标准误表示，而分类变量和有序变量则以频数和百分比表示。由于NHANES采用复杂且具有全国代表性的抽样设计，分析过程中应用了12年期的样本权重。采用逻辑回归分析膳食模式评分、生活方式与肾结石之间的关联。在此情况下，膳食模式评分被分为三分位数。在回归模型中，模型1根据年龄（连续年份）、性别（男性和女性）和种族（非西班牙裔白人、非西班牙裔黑人、西班牙裔等）进行校正，模型2在模型1的基础上进一步校正教育水平、贫困收入比（PIR）和糖尿病病史。所有分析均采用双侧检验，当p值< 0.05时认为具有统计学显著性。NHANES数据使用SAS 9.4版进行统计分析。
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生活方式与尿石症的孟德尔随机化分析
图2 显示了生活方式因素与尿石症风险之间的随机效应IVW结果。我们发现饮酒频率（OR = 1.37，95% CI = 1.14–1.66， p = 0.001）与遗传预测的每增加1个标准差的尿石症风险升高存在因果关联，而税前收入（OR = 0.31，95% CI = 0.16–0.63， p = 0.001）与尿路结石患者呈负相关。经FDR校正后，结果依然稳健。补充方法中显示出一致且连贯的趋势补充材料 图2，补充 图3, 补充图4,
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根据孟德尔随机化研究结果，较高的收入、摄入新鲜水果、饮茶以及较高水平的钾和维生素E可显著降低尿路结石的风险。根据美国国家健康与营养调查（NHANES）数据，睡眠不足、睡眠障碍、抑郁、高体重指数（BMI）以及促炎性饮食（高DII）会增加肾结石的风险，而HEI-2020、DASH和aMED等健康膳食模式则可降低风险。
该整合的孟德尔随机化（MR）与 NHANES 框架的有效性依赖于若干由方案定义的关键步骤。SNP 的筛选需进行严格的 clumping 处理（r2=0.01，kb=5,000），并进行一致性校正以剔除回文变异，同时要求 F 统计量阈值高于 10，以避免弱工具变量偏倚。一个常见问题是某些暴露因素（如维生素 E）可用的 SNP 数量较少，此时需放宽 p 值阈值（1E-5 至 1E-7）；若出现这种情况，我们建议使用更严格的阈值验证结果，并重新计算 F 统计量。当 MR-PRESSO 检测到水平多效性时，应剔除异常值 SNP。与依赖自我报告饮食数据且无法排除反向因果关系的传统观察性研究相比，我们的 MR 方法利用在受精时即已固定的遗传变异，提供了更强的因果...
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本工作由浙江省医药卫生科技计划（2025HY0499；2025ZR046）和国家自然科学基金（82400854）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 全基因组关联研究暴露数据库 | IEU OpenGWAS 项目 | https://gwas.mrcieu.ac.uk/ | 与暴露因素相关的公开遗传数据 |
| 全基因组关联研究结果数据库 | FinnGen | https://www.finngen.fi/zh-cn | 与肾结石相关的公开遗传数据 |
| NHANES 2009–2020年的人口统计特征 &社会经济数据集 | 美国疾病控制与预防中心国家健康与营养调查 | DEMO | 公开可用的数据集，包含人口统计学、社会经济和生活方式变量 |
| NHANES 2009–2020年膳食摄入 | 美国疾病控制与预防中心国家健康与营养调查 | 24小时回顾法 | 膳食摄入评估 |
| NHANES 2009–2020年问卷 | 美国疾病控制与预防中心国家健康与营养调查 | 问卷调查 | 描述您是否患有肾结石 |
| R | R 基金会 | https://www.rproject.org（版本 4.2.2） | 用于分析 NHANES 和孟德尔数据的软件 |
| SAS | SAS 公司 | http://www.sas.com/(版本 9.4) | 用于分析 NHANES 数据的软件 |
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