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单次静脉注射产吲哚减毒Brucella对NOD小鼠的影响：1型糖尿病发病及胰岛免疫重塑的评估

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DOI：

10.3791/71193

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2026年5月26日

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1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A'M University Health Science Center, 2Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine ' Biomedical Sciences, Texas A'M University, 3Bond Life Sciences Center, The University of Missouri

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了将一种可产生吲哚的减毒Brucella melitensis菌株通过静脉注射给予NOD/ShiLtJ小鼠，随后进行纵向糖尿病监测、胰腺组织学分析，以及可选的高重空间蛋白质组学和单细胞RNA测序，以评估胰岛免疫重编程情况。

摘要

1型糖尿病（T1D）由自身免疫介导的胰腺β细胞破坏所致，目前的治疗方法无法恢复持久的免疫耐受。通过代谢工程改造、可产生免疫调节代谢物的细菌代表了一种有前景的单剂量治疗策略。本文提供了一项全面的实验方案，通过单次静脉注射产吲哚的减毒Brucella melitensis菌株BmΔvjbR::tnaA，评估其对糖尿病前期雌性NOD/ShiLtJ小鼠自身免疫性糖尿病发病的影响。

该方案首先从冻存的甘油菌种中复苏 BmΔvjbR::tnaA，将其接种于选择性培养基中培养至对数中期，并根据光密度计算菌落形成单位。选用雌性 NOD 小鼠， <5周龄小鼠在无麻醉状态下被固定，并通过侧尾静脉注射磷酸盐缓冲液中特定剂量的细菌，同时置于加热垫上维持体温。在实验期间，于禁食2小时后每周监测2次血糖水平，持续70至105天；若连续两次检测血糖值≥250 mg/dL，则定义为糖尿病。实验终点时，取胰腺组织在中性缓冲福尔马林中固定72小时，经石蜡包埋后切片，进行苏木精-伊红染色、胰岛素免疫组织化学染色及胰岛总面积定量分析。福尔马林固定石蜡包埋切片用于空间蛋白质组学分析，采用包含25种标记物的抗体 panel，以可视化调控性和效应性免疫细胞群体。最后，新鲜胰腺组织进行单细胞分离、3′文库构建、测序及基于Seurat的生物信息学分析，以描绘免疫细胞与基质细胞群体中的转录变化。

该整合方案可实现可重复的单剂量细菌治疗递送，并对胰岛免疫重塑进行多模态表征，为在自身免疫模型中测试代谢物工程化微生物以及在单细胞分辨率下解析组织特异性免疫机制提供了研究框架。

引言

1型糖尿病（T1D）是一种慢性自身免疫性疾病，其特征是免疫介导的胰岛素生成性胰腺β细胞破坏，导致终身依赖胰岛素以及血管并发症风险增加1。NOD/ShiLtJ小鼠重现了人类自身免疫性糖尿病的关键特征，包括自发性胰岛炎及进展为明显糖尿病的过程，被广泛用作机制研究和治疗研究的临床前模型1,2,3。目前的T1D治疗方法——包括免疫抑制药物、单克隆抗体和过继性调节性T细胞（Treg）疗法——可暂时延缓疾病进展，但往往无法持久恢复免疫耐受或持续保护β细胞质量1,2,4,5,6,7,8,9,10,11。

调节性T细胞（Tregs）及其他调节性细胞群体是新兴1型糖尿病（T1D）疗法的主要靶点，包括自体多克隆Treg输注、工程化抗原特异性Treg以及基于IL-2的治疗方案1,2,4,5,6,7,8,9,10,11。然而，胰岛局部的促炎性微环境可能削弱这些疗法的效果，凸显了对组织驻留免疫网络进行局部重编程的必要性2,7。微生物来源的色氨酸代谢物，特别是吲哚及其相关化合物，可通过促进调节性T细胞分化、诱导抗炎型巨噬细胞极化以及抑制Th17反应，调节固有免疫和适应性免疫12,13。因此，活体微生物疗法和代谢工程化细菌代表了一种有前景的策略，可原位递送免疫调节性代谢物并重塑组织免疫状态12,13,14,15,16,17,18。

我们先前开发了一种代谢工程改造的Brucella melitensis菌株BmΔvjbR::tnaA，该菌株可组成型产生吲哚，并通过扩增调节性T细胞（Tregs）和重塑炎症微环境来控制自身免疫性关节炎14,15,16。诸如BmΔvjbR等减毒的Brucella菌株已被广泛表征为疫苗平台，且可经遗传修饰以携带免疫调节有效载荷14,15,16。

本文介绍了一种在NOD/ShiLtJ模型中评估单次静脉注射BmΔvjbR::tnaA的详细方案，包括细菌制备、标准化的静脉给药、糖尿病监测，以及通过组织学、高重空间蛋白质组学和单细胞RNA测序对胰腺组织进行多模态分析。该工作流程为测试经代谢物工程改造的微生物作为器官特异性自身免疫疾病的单剂量免疫疗法提供了实用框架。前期剂量-反应分析表明，减毒菌株在剂量高达1 × 1010 CFU时具有良好的安全性和耐受性。

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方案

所有动物实验均严格遵循伦理准则，并经德克萨斯农工大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。&M 大学（方案编号：2021-0123）

1. BmΔvjbR::tnaA 的制备与表征

  1. 细菌菌株背景与保存
    ​注意：BmΔvjbR::tnaA 源自 Brucella melitensis 16M 缺失 vjbR 毒力调控因子并插入 大肠杆菌 tnaA 组成型吲哚生成基因，如先前所述14,15,16.
    1. 将甘油菌种保存液在20%甘油中于−80 °C保存。
  2. 选择性琼脂上的细菌培养
    1. 从 −80 °C 保存条件下取出一管冻存的甘油菌种。取 10–20 µL 菌液划线接种于添加氯霉素（25–30 µg/mL）的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板。
    2. 在37 °C、常氧CO₂条件下培养平板48–72小时，直至出现可见的单个菌落（直径2–3 mm）。
      注意：操作时需小心 布鲁氏菌 菌株操作需要具备适当的生物安全等级设施（最低BSL2）。应遵循机构的生物安全规程及所需审批程序。
  3. 液体培养物制备
    1. 选择一个新鲜的TSA平板（≤1周内制备）。使用无菌接种环挑取2–3个独立菌落。
    2. 在无菌的15 mL离心管中接种10 mL添加氯霉素（25–30 µg/mL）的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），于37 °C、250 rpm振荡培养，环境CO₂条件下孵育。
      ​注意：放大实验时，使用带有挡板的250 mL锥形瓶。
  4. 生长监测与收获
    1. 使用添加氯霉素的无菌TSB作为空白对照校准分光光度计。
    2. 每2–3小时测量一次OD₆₀₀。
    3. 继续培养至OD₆₀₀达到2.0 ± 0.2（约18–24小时）。
      关键步骤：在 OD₆₀₀ = 2.0 ± 0.2 时收获，以确保细菌浓度和活性的一致性。
      ​注意: 在这些条件下，OD₆₀₀ ≈ 2.0 对应于对数生长中期至后期。
  5. 菌落形成单位（CFU）估算
    1. 使用以下关系式估算细菌浓度：
      OD₆₀₀ = 1 对应于 5 × 109 CFU/mL
      ​注意：在 OD₆₀₀ = 2.0 时，10 mL 培养液中大约含有 1 × 1011 菌落形成单位
    2. 可选： 制备10倍系列稀释液（10⁻6 至10⁻9) 于无菌 PBS 中。取 100 µL 接种至添加氯霉素的 TSA 培养基上。37 °C 培养 48–72 小时。计数菌落以确认 CFU。
  6. 细菌的收获与浓缩
    1. 将10 mL培养物转移至无菌的15 mL锥形管中。
    2. 在 3,000–4,000 × g 条件下离心 g 室温下孵育10分钟。
    3. 小心吸出并弃去上清液，切勿扰动沉淀。
  7. 注射用重悬
    1. 向细菌沉淀中加入1 mL无菌、无内毒素的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）。用移液器轻柔吹打10–15次，直至形成均匀悬液，无可见团块。
      ​注意：最终浓度约为 1 × 1011 CFU/mL
  8. 储存与使用
    1. 将细菌悬液置于冰上，并保存在密闭试管中。制备后4小时内用于静脉注射。
      注意：请勿冷冻或过夜保存，因为细菌活力会下降。
      ​暂停点：细菌可在冰上保存最多4小时；建议当天使用。

2. NOD/ShiLtJ 小鼠的获取、饲养与准备

  1. 获取雌性 NOD/ShiLtJ 小鼠。实验前至少适应环境 7 天。
    注：由于雌性小鼠糖尿病发生率更高且更稳定，因此使用雌性小鼠。
  2. 将小鼠饲养在独立通风的笼具中，维持特定病原体阴性条件。每笼最多饲养五只小鼠。
  3. 自由提供垫料、环境丰富物、食物和饮水。ad libitum。保持温度在 20–24 °C，湿度在 40–60%，并维持 12 小时光照/12 小时黑暗循环。
  4. 使用年龄小于 5 周的小鼠。记录基础体重。
  5. 在笼具水平上将小鼠随机分配至处理组和对照组。为每只小鼠分配唯一标识符（耳标或尾部纹身）。
    ​注：维护所有小鼠及其分组信息的主记录。
  6. 在注射前至少 30 分钟将笼具转移至操作室。将笼具置于设定为 37–40 °C 的加热垫上，以促进尾静脉扩张。

3. 经尾侧静脉进行静脉注射

  1. 采用无菌技术，将 100 µL 细菌悬液吸入无菌胰岛素注射器（29G–30G）中。用相应的实验小鼠编号标记每支注射器。
  2. 准备含有 100 µL 无菌 PBS 的对照注射器。
    注意：注射前应立即准备注射器。
  3. 将每只小鼠放入固定器中，使其尾部可被操作。
    注意：尾静脉注射时不得使用麻醉。
  4. 用 70% 乙醇擦拭尾部，并使其自然干燥。
  5. 在充足光照下观察尾部侧静脉。
    提示：若静脉不可见，可对尾部进行加温。
  6. 轻轻牵拉尾部远端三分之一处以施加轻度张力。将针头斜面朝上，以浅角度（10–15°）插入侧静脉。
  7. 在 5–10 秒内缓慢注射 100 µL。拔出针头后，用无菌纱布轻压注射部位。
    ​关键步骤：若无阻力、肿胀或苍白现象，则表明静脉注射成功。
  8. 将小鼠放回笼子，并置于加热垫上。观察 5–10 分钟，记录任何痛苦迹象或不良事件。
  9. 在 2 小时时间窗内，按随机顺序完成所有小鼠的注射操作。

4. 血糖监测与糖尿病定义

  1. 注射后第7天开始进行葡萄糖监测。每周测量2次血糖，直至研究终点。
  2. 测量前2小时撤除食物，但保持饮水供应。
  3. 固定小鼠。用70%乙醇清洁尾尖。
  4. 使用无菌采血针或针头在尾尖上划一小口。弃去第一滴血。将第二滴血收集到血糖仪试纸上。记录血糖值、小鼠编号及日期。
    ​注意：若尾尖出现瘢痕，应更换新的采血部位。
  5. 若两次相隔至少24小时的连续测量中，血糖值均≥250 mg/dL，则定义为糖尿病。
  6. 根据机构指南，对出现严重疾病症状的小鼠实施安乐死。

5. 胰腺的收获、固定与处理

  1. 根据批准的方案对小鼠实施安乐死。仔细解剖并收集胰腺，包括所有叶。
  2. 将胰腺置于10%中性缓冲甲醛溶液中，固定液与组织体积比至少为10:1。室温固定72小时。
    注意：应在化学通风橱内佩戴适当的个人防护装备操作甲醛。
  3. 固定后，将组织转移至70%乙醇中。
  4. 将固定后的组织送至组织学核心实验室，进行石蜡包埋、在带正电荷的载玻片上切片（厚度5 µm）、苏木精-伊红染色以及胰岛素免疫组织化学染色。
    ​注意：如计划进行其他下游分析，请要求保留未染色切片。

6. 组织学评估与胰岛面积定量

  1. 使用切片扫描仪或显微镜获取全切片图像。
  2. 在引用的软件中打开图像。使用适当的工具手动标注胰岛。
  3. 使用标注工具测量胰岛面积。
  4. 导出测量数据以进行分析。
    ​注意：胰岛总面积包括内分泌细胞和浸润细胞。

7. 多种下游分析

  1. 计算每只小鼠的平均胰岛面积。使用适当的统计学方法比较各组间差异。
  2. 可选：空间蛋白质组学分析（参见补充表 S1）
    1. 将福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片置于带正电荷的载玻片上。将样本送至空间蛋白质组学服务提供商，并提供抗体面板的具体信息。
  3. 可选：单细胞RNA测序（参见补充表 S2）
    1. 取出胰腺组织并置于冷培养基中。
    2. 将样本送至基因组学核心平台进行单细胞分离与文库构建。
    3. 使用适当的分析流程（如 Cell Ranger、Seurat）处理测序数据。
    4. 在发表前将测序数据存入公共数据库。

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结果

尽管本文所述的广义方案现已优化为单剂量预防方案，但此处展示这些初步结果仅用于说明通过该工作流程可获得的预期组织学和血糖读数。

健康胰腺与 1 型糖尿病胰腺的整体疾病背景及对比通过示意图展示于 图1A自身免疫对β细胞的破坏及随之而来的胰岛素生成能力丧失，如本示意图所示，反映了人类及NOD小鼠中1型糖尿病（T1D）公认的发病机制1B。根据总结的实验方案，纳入雌性NOD/ShiLtJ小鼠进行研究。 图2A.

所示的代表性概念验证数据 图3 （葡萄糖轨迹和总胰岛面积）来自一项初步小规模队列研究，该研究采用两次给药方案（第0天和第21天）。本研究中的纵向血糖测量结果显示，与对照组（给予载体）相比，接受BmΔvjbR::tnaA治疗的小鼠血糖水平更稳定，高血糖的发生时间也更延迟图3A）。组织学和形态计量...

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讨论

本文所展示的代表性结果存在一个关键局限性，即用于说明分析终点的数据（图3）来源于采用两剂接种方案的早期小规模预试验队列。由于该方案现已优化为单剂预防性给药方案，因此需要开展更大规模的后续研究，采用本文所述的优化后单剂方案，以确立正式的统计学有效性。

本 JoVE 方案描述了在 NOD/ShiLtJ 小鼠中静脉单次注射产吲哚减毒 Brucella melitensis 菌株的操作流程，结合标准化的监测与组织学评估，证明该工作流程可用于捕捉 1 型糖尿病中的初步疗效信号。在本研究展示的初步队列中，与对照组相比，BmΔvjbR::tnaA 延缓了糖尿病的发病，并保护了胰岛结构，这通过纵向血糖监测以及总胰岛面积增加且胰岛素染色保持完整得以证实（图 3A–C）6。这些发现与先前研究结果一致，表明对细菌进行代谢工程改造以及微生物来源的色氨酸代谢物能够抑制炎症反应并促进调节性免疫...

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披露

作者无竞争性财务利益。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院基金R01CA273002和R21AI167793（资助J.S.和P.d.F.）以及NIH机构国家研究服务奖（T32，资助K.D.）的支持。我们感谢德克萨斯A&M大学健康科学中心提供机构支持。感谢Yava Jones-Hall博士进行盲法组织病理学评估，感谢Song实验室提供预实验和动物技术支持，感谢德克萨斯农工大学&M 基因组科学研究所 & 社会（TIGSS）分子基因组学工作区提供的单细胞RNA测序文库构建与测序服务、TIGSS生物信息学核心团队提供的数据分析与解读支持，以及Akoya Biosciences提供的空间蛋白质组学服务。我们感谢德克萨斯A&M 基因组科学研究所 & 社会（TIGSS）生物信息学核心（TBC）提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10% 中性缓冲福尔马林（NBF）VWR10790-714
10x Genomics Chromium Controller德克萨斯A&M大学TIGSS分子基因组学工作区&M大学
70% 乙醇VWR89125-164
用于FFPE的粘附性显微镜载玻片Leica Biosystems3800084E
Akoya 小鼠 FFPE 抗体面板（约 25 个标志物）Akoya Biosciences[面板 ID/自定义面板]
使用DNA HS试剂盒的Bioanalyzer或TapeStation德克萨斯A&M大学TIGSS分子基因组学工作区&安捷伦
BmΔvjbR::tnaA 细菌菌株实验室库存（Song/de Figueiredo 实验室）
Cell Ranger 分析流程10x Genomicsv7.1
氯霉素研究产品国际公司56-75-7
Chromium Next GEM 单细胞 3' 试剂盒10x Genomics 通过 TIGSS 核心平台
产气荚膜梭菌胶原酶默克生命科学C7657-100MG
DAPI 核染色Akoya Biosciences[服务提供]
FFPE包埋，H&E 染色、胰岛素免疫组化染色及切片扫描VMBS组织学实验室，德克萨斯农工大学&M 大学https://vetmed.tamu.edu/vmbs-histology-lab/
葡萄糖检测试纸EKF Diagnostics / Fisher Scientific22-022-649
葡萄糖检测试纸（替代）Ascensia Diabetes CareCONTOUR NEXT 试纸条
甘油（散装，500 mL）Millipore SigmaG7893-500ML
甘油（无菌，100 mL）Sigma Aldrich（G Biosciences）G5516-100ml
GraphPad Prism（或 R 中的 survival 软件包）GraphPad Software / Rv10.2
手持式血糖仪Ascensia Diabetes Care康拓 NEXT EZ
Illumina NextSeq 2000 测序仪TIGSS分子基因组学工作区，德克萨斯A&M 大学
胰岛素注射器，29–30 G（U-100）VWR10002-702
糖尿病检测用采血针Becton, Dickinson and Company (BD)366594
Liberase TL 研究级默克生命科学5401020001
低温加热垫开展科学RWD-69025
Miltenyi 细胞核/细胞分离试剂盒TIGSS 分子基因组学工作区，德克萨斯农工大学&美天旎生物技术
小鼠加热垫（替代方案）Kent ScientificRightTemp
小鼠固定器Braintree ScientificTV-RED 150-STD
NOD/ShiLtJ 小鼠（雌性，5 周龄）杰克逊实验室品系 #001976
P2 XLEAP 100循环流动池试剂盒Illumina 通过 TIGSS 核心平台
PhenoCycler 数据采集与质控服务Akoya Biosciences
PhenoCycler 试剂与成像工作流程Akoya Biosciences[服务提供]
PhenoCycler-Fusion 系统Akoya Biosciences
磷酸盐缓冲液（PBS），1×赛默飞世尔科技10010023
Protector RNase抑制剂Millipore Sigma3335402001
Qubit 荧光仪与双链DNA高灵敏度检测试剂盒TIGSS 分子基因组学工作区，德克萨斯农工大学&安普&梅（Amp&M）/赛默飞世尔科技（Thermo Fisher）
QuPath开源v0.4.3
R 软件R 项目v4.0+
Seurat（R 软件包）Satija 实验室 / CRANv4.3
StarDist开源v0.8.3
胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）VWRCA90002-706

参考文献

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