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方法文章

一种用于评估结肠肿瘤类器官与免疫细胞共培养的多模态框架

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DOI：

10.3791/71204

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2026年9月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Oncology and Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了建立患者来源的结肠肿瘤类器官与自体淋巴细胞共培养的体系，随后使用治疗性小分子药物和免疫检查点抑制剂进行处理，以评估T细胞反应性及治疗效果。

摘要

T 细胞在癌症免疫治疗中发挥关键作用，了解其与肿瘤的相互作用对于开发新型免疫疗法至关重要。本方案详细描述了从我们的生物样本库中建立结直肠癌患者来源类器官（PDOs）的逐步操作流程，并构建自体 PDO-T 细胞共培养系统的方法。通过使用 Annexin V NIR 和裂解型 caspase-3 染色，我们标准化了用于表面和细胞内染色的流式细胞术方案，以评估 T 细胞反应性、细胞毒性以及肿瘤类器官的杀伤情况。除了基于流式细胞术的分析外，本方案还包括功能检测的方法学，例如 ELISpot 检测以定量颗粒酶 B 和穿孔素的分泌，以及活细胞成像技术，通过基于 Annexin V 的凋亡检测实时监测 T 细胞介导的肿瘤杀伤过程。该工作流程进一步详述了共培养条件的设置，包括在单药治疗和联合治疗模式下引入靶向抑制剂和免疫检查点抑制剂。本文提供了关键免疫学和肿瘤相关标志物的选择与应用指南，包括用于评估 T 细胞反应性的 CD137、T 细胞脱颗粒的 CD107a、肿瘤细胞凋亡的 caspase-3 以及肿瘤增殖的 Ki67。总体而言，本文为结直肠癌类器官的建立、自体 T 细胞的培养与扩增、共培养体系的构建、治疗干预以及后续的流式细胞术、ELISpot、共聚焦显微镜和活细胞成像分析提供了全面且可重复的技术框架。

引言

结直肠癌（CRC）尽管在早期检测和多模式治疗方面取得了进展，但仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一1。改善患者预后的重大挑战之一在于缺乏能够准确模拟人类CRC中复杂组织结构、瘤内异质性、肿瘤-免疫相互作用以及治疗反应的临床前模型2,3,4,5,6。传统的模型，包括基因工程小鼠模型（GEMMs）和患者来源的异种移植模型（PDXs），虽已显著推动了CRC研究，但仍存在明显局限性。GEMMs往往无法充分反映人类肿瘤的多样性，且其建立于与人类生理环境差异显著的小鼠微环境中。同样，PDX模型虽保留了部分肿瘤异质性，但成本高昂、耗时较长，依赖免疫缺陷小鼠，且由于物种特异性差异，难以用于研究人类特异性的免疫反应7,8。此外，对小型动物使用的日益严格的限制也凸显了对更具人类相关性和伦理可持续性的替代模型的需求。

近年来，患者来源的类器官（PDOs）已成为转化癌症研究的一种变革性平台。利用新鲜手术或活检样本生成的结直肠癌（CRC）类器官，能够保留原发肿瘤的组织学、遗传学和表型特征，包括克隆多样性以及对治疗有响应的细胞状态。这些特性使PDOs成为疾病建模、功能基因组学、生物标志物发现和个体化医学研究的有力工具7,8,9,10,11。尤为重要的是，将人类免疫组分整合到类器官系统中，进一步拓展了其应用价值。将结直肠癌类器官与外周血单个核细胞（PBMCs）或经基因工程改造的免疫细胞亚群共培养，可在具有生理相关性的系统中研究肿瘤–免疫相互作用、免疫逃逸机制、抗原呈递以及免疫治疗反应12。此类模型可用于评估检查点抑制剂、CAR-T/TCR疗法和双特异性抗体的效果，同时有助于揭示预测性生物标志物及耐药机制。

除免疫治疗外，结直肠癌类器官在药物筛选和精准肿瘤学应用中正变得愈发重要。可对患者来源的类器官进行化疗药物和靶向治疗药物的测试，以预测个体对治疗的反应，多项研究已证明类器官的反应与临床结果之间存在相关性。因此，这些系统为传统的基于动物的实验方法提供了一种可扩展且以患者为中心的替代方案10,13,14,15,16,17,18。

本文介绍了一种可操作性强、可扩展的实验方案，用于建立患者来源的结直肠癌类器官，并将其整合到免疫共培养系统中，以开展转化医学和临床前研究。肿瘤组织经酶解消化后，在优化的生长条件下嵌入三维细胞外基质中培养，以维持肿瘤异质性和谱系分化特性。所建立的类器官可进行扩增、冷冻保存、遗传操作，并可用于后续多种应用，包括分子表征、药物干预研究和免疫谱分析。此外，通过与外周血单个核细胞（PBMCs）共培养，可评估免疫介导的细胞毒性、免疫检查点阻断敏感性以及肿瘤特异性免疫活化情况。

我们进一步描述了组织处理、类器官质量评估、流式细胞术分析、免疫荧光成像以及基于ELISpot的免疫监测等实验方案。总体而言，这些基于类器官的系统为研究结直肠癌生物学特性、治疗耐药性、肿瘤异质性及免疫治疗反应提供了符合伦理且具有临床相关性的平台。类器官工程技术及微环境整合的持续进展，正不断确立这些模型在未来结直肠癌研究和精准肿瘤学中的核心地位。

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方案

所有患者均在蒙特菲奥雷爱因斯坦综合癌症中心生物样本库方案（爱因斯坦机构审查委员会编号：2021-13730）获得批准后签署知情同意书。临床协调和监管支持由癌症临床试验办公室（CCTO）提供。肿瘤组织在标准治疗性手术切除及病理学评估后采集，并用于福尔马林固定、患者来源类器官培养，或在含20%胎牛血清和10%二甲基亚砜的DMEM培养基中冷冻保存。所有试剂的配制方法见表1。

1. 从活检或切除组织建立肿瘤类器官培养（4 小时）

  1. 将新鲜获取的肿瘤组织置于无菌培养皿中，用类器官洗涤缓冲液在冰上清洗5次，每次5分钟。使用无菌剃刀刀片或细针将组织切割成大约 1–2 mm3的小立方体。
    注意： 在解剖过程中，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）保持组织湿润，防止干燥。
  2. 将切割后的组织碎片转移至15 mL离心管中，用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗一次，并在室温（RT）下以200 × g离心5分钟。小心弃去上清液，然后将组织小块转移至无菌6孔板或35 mm培养皿中。
  3. 使用无菌、倾斜、经高压灭菌的剪刀将组织进一步剪碎。用1×温和胶原酶/透明质酸酶溶液，将1 mL该溶液稀释于9 mL DPBS中。加入10 µL Y-27632（ROCK抑制剂）和20 µL Primocin。
  4. 将预温的解离溶液加入含有组织碎片的15 mL离心管中。使用经包被的P1000枪头，在吹打前重新包被枪头，反复吹打以搅动组织碎片。
  5. 将15 mL离心管置于37 °C摇动水浴中孵育30分钟，每10分钟颠倒一次。待组织碎片沉降后，将大部分消化液转移至新管中，并在室温下以500 × g离心5分钟。
  6. 向原始15 mL离心管中加入1 mL DMEM，使用经包被的P1000枪头剧烈吹打，以机械方式解离组织碎片并释放更多隐窝结构。
  7. 在显微镜下观察解离进展，监测组织是否已分解为单细胞或小细胞团。取10–20 µL含组织碎片的DMEM转移至培养皿中，在显微镜下检查隐窝结构。
    注意： 孵育时间因样本类型而异。对于活检样本，孵育时间为 15–30分钟；对于手术切除样本，则为 45–60分钟。
  8. 一旦检测到隐窝结构（或活检样本孵育30分钟后/切除样本孵育60分钟后），加入等体积的预冷基础培养基终止消化反应，并在室温下以500 × g离心5分钟。
  9. 用DPBS洗涤沉淀以重悬细胞，再次离心。可选步骤：将悬液转移至锥形离心管中，在室温下以 300 × g离心5分钟 以沉淀细胞。
    注意： 对于 结直肠癌（CRC），通常无需进行红细胞裂解。
  10. 若沉淀呈红色，需在室温下用 5 mL红细胞裂解缓冲液 孵育15分钟以裂解红细胞。裂解完成后，立即用PBS补满离心管并再次离心。
  11. 用 DPBS洗涤沉淀一次。在室温下以 300 × g离心5分钟，弃去上清液。用少量培养基重悬沉淀。使用 血细胞计数板 结合台盼蓝染色排除法或 自动细胞计数仪计数活细胞。
  12. 将细胞重悬于 预冷的Matrigel（基底膜基质） 中（可选：每10 µL培养基含约1.5–3 × 104个细胞）。使用预冷的宽口枪头将细胞悬液与 基底膜基质混合（部分实验室采用1:1的基底膜基质与完全类器官培养基比例）。
    注意： 保持基底膜基质及所有混合物 处于低温 状态，以防止提前聚合。
  13. 将约50 µL细胞–基底膜基质混合液滴加至预温的无菌 24孔培养板的每个孔中。将培养板置于37 °C孵育10–12分钟，使基底膜基质凝固成圆顶状（可将培养板倒置放置）。
  14. 待基底膜基质凝固后，将培养板翻转至正常位置。小心地向每孔加入500 µL含ROCK抑制剂（1:1000）和Primocin（1:500）的PDO培养基。
    注意： 在建立冷冻类器官生物样本库之前，所有培养基中均应使用Primocin以防止污染。
  15. 每周 两次 更换类器官培养基，使用新鲜的完全类器官培养基。定期在显微镜下监测类器官生长情况。

2. 从血液中分离人外周血单个核细胞（2 小时）

  1. 将5 mL Histopaque分装至无菌15 mL Falcon管中，平衡至室温，然后在其上小心地叠加等体积的新鲜人全血（最多5 mL）。沿Ficoll管壁缓慢加样，避免扰动界面；每管总体积不超过10 mL。
    注意：离心前应保持 Ficoll 与血液层的清晰分界，以实现最佳分离效果。
  2. 若使用多个离心管，需在离心机中正确配平。避免混合或振荡。 血-菲可液界面必须保持完整。
  3. 离心处理 1500 x g 室温下孵育15分钟。使用 0刹车设置以防止梯度被破坏。离心后将形成明显的分层：a) 下层的红细胞层，b) 中间的外周血单个核细胞（PBMC）絮状层，c) 上层的血浆层。轻柔吸除并弃去血浆，直至露出絮状层。
    注意： 轻柔操作离心管，避免扰动PBMC层。
  4. 使用一支新的无菌移液管，小心吸取 血沉棕黄层 含有外周血单个核细胞，将细胞转移至新的无菌容器中 15 mL Falcon 管。为去除 Ficoll 和血小板，用 10 mL PBSA（PBS + 0.1% BSA）通过 1000 x g 离心洗涤细胞两次 g 室温下孵育7分钟，每次洗涤后小心弃去上清液。
  5. 为去除残留血小板，用PBSA洗涤一次，离心 200 x g 室温下孵育7分钟。小心弃去上清液。如果沉淀呈红色，则加入5 mL红细胞裂解缓冲液，孵育以进行红细胞裂解。 37 °C 5 分钟，然后用 PBSA 洗涤，并在 200 × g 条件下离心 g 室温下持续 7 分钟。
  6. 将PBMC沉淀重悬于2 mL DPBS或培养基中，使用台盼蓝染色结合血细胞计数板或自动细胞计数仪测定活细胞数量。若不立即使用，应将PBMC以5–10 x 106 细胞/mL，置于含90% FBS和10% DMSO的冻存液中，逐步降温至–80 °C 过夜后，转移至液氮中长期保存。
  7. PBMCs 的扩增（7–12 天）：
    1. 通过离心沉淀细胞，离心条件为 500 x g 室温下孵育5分钟。重悬于5 × 105 细胞/孔，置于T细胞扩增培养基中，并用CD3/CD28混合物激活。
    2. 用 500 IU/mL IL-2 刺激细胞，孵育 3 天。第 3 天混匀并计数细胞，然后加入含 IL-2 的 T 细胞扩增培养基扩大培养。
    3. 将细胞用完全T细胞扩增培养基调整至浓度为1–2.5 × 10^5 个细胞/mL，培养2天，在扩增期间每2–3天监测一次细胞活力。
      注意：每 2–3 天更换一次新鲜、预温的完全培养基（不得超过 >3天）。PBMCs可用T细胞冻存液冷冻保存，以备后续使用。

3. 类器官共培养（4天）：

  1. 准备与质量控制：
    1. 在共培养前，确保类器官健康、无污染且已进行表型表征。从已签署知情同意书的供体或商业来源获取外周血单个核细胞（PBMCs），并在使用前确认其活力和基本表型。
    2. 确定 PBMCs 将以新鲜、静置或预激活状态使用，并明确其为自体或异体来源。在共培养前评估类器官的活力、大小均一性及标志物表达情况。
    3. 验证 PBMCs 的活力及基础免疫组成（CD3、CD4、CD8、NK 标志物、单核细胞），并记录供体元数据。
  2. 用于与 PBMCs 共培养的类器官分离：
    1. 移除培养基，向每孔中加入预热的细胞回收溶液，以溶解细胞外基质并释放类器官。使用宽口移液吸头轻轻重悬类器官，并短暂孵育至基质溶解、类器官释放。
    2. 将悬液转移至收集管中，必要时加入 0.5 M EDTA，并用平衡缓冲液调节体积。离心收集类器官沉淀，弃去上清液，用含补充剂（HEPES 和 Glutamax）及抗生素的基础培养基洗涤，再次离心以重新形成沉淀。
    3. 将类器官重悬于完全培养基中，接种至组织培养处理的培养板中，并在进一步处理前恢复培养约 24 小时。
  3. PBMCs 的并行复苏：
    1. 按照标准操作快速解冻冻存的 PBMCs，并立即将其稀释至预热的 T 细胞扩增培养基中，以尽量减少渗透压冲击。
      注：解冻过程中通常会出现部分细胞损失；预热培养基可提高细胞回收率。
    2. 以 400 × g 离心解冻后的 PBMCs 以形成沉淀，去除冻存液，并在含苯并核酸酶的 T 细胞扩增培养基中短暂孵育，以减少细胞聚集并提高单细胞悬液质量。
    3. 用新鲜扩增培养基洗涤并重新离心收集 PBMCs，随后将其重悬于补充细胞因子（如 IL-2）的 T 细胞培养基中，以维持细胞活力和恢复。将 PBMCs 接种至多孔板中，在共培养前进行过夜静置。
  4. 共培养前准备（共培养前 1 天）：
    1. 可选：在共培养前用免疫刺激性细胞因子（如 IFN-γ）处理类器官，以增强抗原呈递通路。
    2. 至少提前 24 小时准备共培养板，通过在孔中包被共刺激抗体（如抗 CD28）并在 4 °C 下保存。使用前去除未结合的抗体，并用 DPBS 洗涤两次。
  5. 类器官解离为单细胞（共培养实验当天）：
    1. 收集预刺激的类器官，离心去上清，然后加入酶解解离试剂（如 TrypLE）重悬，同时回收任何贴壁细胞，以获得完整的细胞群体。
    2. 轻柔混匀孵育，并在显微镜下观察，直至大多数类器官解离为单细胞或小细胞簇，避免过度消化。
    3. 用缓冲液终止解离反应，离心收集细胞，去除上清，并用 T 细胞培养基重悬，用于计数和混合。
  6. 细胞计数与共培养前准备：
    1. 轻柔混匀细胞悬液，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪结合活力染料测定活细胞数量。在 T 细胞培养基中将肿瘤细胞与 PBMCs 的比例调整至所需密度。
    2. 通过离心收集 PBMCs，重悬于新鲜培养基中，并测定活细胞数。用补充细胞因子（如 IL-2）及可选免疫调节抗体（如抗 PD-1）的 T 细胞培养基洗涤并重悬 PBMCs，视需要而定。
  7. 进行共培养：
    1. 按所需效应细胞与靶细胞比例混合解离后的肿瘤细胞与 PBMCs。在加样前洗涤抗 CD28 包被的孔，避免孔壁干燥。
    2. 将类器官与 PBMCs 的混合物以所需检测体积接种，并在标准培养条件下孵育。根据实验需要，适时补充培养基或传代培养。
  8. 实验设计与对照设置（用于治疗策略）：
    1. 利用共培养系统评估药物（如免疫检查点抑制剂或小分子化合物）如何调节 PBMCs 对肿瘤类器官的反应。
    2. 设置生物学重复（多个类器官系和 PBMCs 供体）和技术重复（每种条件至少三个重复孔）。
    3. 设置对照组：仅类器官、仅 PBMCs（空白或激活）、类器官 + PBMCs（空白）、类器官 + 药物、PBMCs + 药物。
  9. 典型的共培养时间点框架：
    1. 在共培养启动后 24、48 和 72 小时分析共培养体系，以评估免疫激活、增殖、细胞因子分泌、凋亡及肿瘤细胞杀伤情况。
    2. 在 24 小时检测早期激活标志物和细胞因子分泌，在 48–72 小时通过流式细胞术、成像或活力检测评估细胞毒性、增殖及激活/耗竭标志物。
      注：可纳入较晚时间点（如第 5–7 天），以评估慢性激活、免疫耗竭或长期药物反应。
  10. 类器官的免疫荧光染色：
    1. 用 PBS 洗涤载玻片 5 分钟，并在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）溶液固定 20 分钟。固定后，用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。
      注：染色全程需保持类器官湿润。如需要，载玻片可在室温下置于 PBS 中保存最多 3 小时，但避免在 PBS 中过夜保存。
    2. 在室温下用含 0.1–0.5% Triton X-100 的 PBS 处理 15–20 分钟，以实现细胞内和核内染色，同时保持类器官结构完整。
      注：避免过度通透，以免破坏类器官结构。适当的通透处理可确保细胞质和核内染色均匀，同时保持形态完整性，便于成像。
    3. 用 1× IF 缓冲液洗涤两次，随后在 IF 缓冲液中加入 1–10% BSA（或同源血清）封闭 60–120 分钟，以减少非特异性染色。
      注：BSA 适用于一般封闭，但为提高信号特异性并减少非特异性结合，建议在特定标志物染色时使用同源血清。
    4. 洗涤三次（每次 5 分钟），然后在湿盒中，于 4 °C 下用 1% 血清封闭缓冲液稀释的一抗（10–50 µg/mL）孵育过夜。
      注：用封口膜覆盖载玻片以防止蒸发，并通过滴定优化一抗浓度，以实现特异性染色且背景最低。
    5. 用 1× IF 缓冲液洗涤 3 次，每次 5 分钟。
      注：洗涤条件应根据具体抗体染色进行优化。若同时使用多种一抗，则洗涤步骤应标准化。
    6. 在湿盒中，用荧光标记的二抗（1:200–1:500 稀释于 1% 血清封闭缓冲液）在 4 °C 下孵育过夜，或在室温避光孵育 2 小时。
      注：加入二抗后，所有后续操作均需在避光条件下进行，以防止荧光染料光漂白。
    7. 用 1× IF 缓冲液洗涤（2 次，每次 5 分钟），再用 PBS 洗涤 5 分钟。在避光条件下，用含 DAPI（1 µg/mL）和 AlexaFluor-594 标记抗体（20 µg/mL）的 5% 血清封闭缓冲液在室温下孵育 1 小时，随后用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
    8. 加入封片剂，盖上盖玻片，避免产生气泡。若使用含 DAPI 的封片剂，可省略 DAPI 染色步骤。对于载玻片扫描应用，建议使用硬封片剂。
    9. 在室温下干燥 1 小时，置于 –20 °C 保存，并使用共聚焦显微镜或载玻片扫描仪进行成像。

4. 类器官的流式细胞术与细胞内染色方案

  1. 小心吸除类器官培养基，并用 1x PBS 轻柔洗涤类器官一次，以去除残留的培养基和血清蛋白。使用冷 PBS 或回收溶液将类器官从细胞外基质中释放出来，并轻轻吹打以破坏基质，同时尽量减少剪切应力。
  2. 将类器官悬液转移至离心管中，在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。将类器官沉淀重悬于 250–500 µL 的 0.05% TrypLE 溶液中进行酶解消化。在 37 °C 下孵育以有效消化细胞间连接。
    注意：每 5 分钟轻轻敲击并上下吹打混匀悬液，并在显微镜下观察，直至获得单细胞悬液且避免过度消化。
  3. 将细胞悬液通过 40 µm 细胞筛网以去除细胞团块。在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟，然后在不含 Ca2+ / Mg2+ 的缓冲液中重悬于 1x PBS 中。
  4. 计数细胞并将细胞浓度调整至约 1 x 106 个细胞/mL 的染色缓冲液中。加入 Fc 封闭剂（1:200）和活死染料（例如 Live/Dead Blue，1:1000–1:3000），以减少非特异性结合并区分活细胞与死细胞。
  5. 在室温避光条件下孵育 30 分钟，然后用 1x PBS 洗涤一次，再用染色缓冲液洗涤一次。
  6. 通过将每种抗体以其优化的工作稀释度加入染色缓冲液中，配制表面抗体混合液，并根据滴定后的 µL/测试值计算主混合液的总体积。
    注意：如果您的抗体组合中包含多种基于聚合物的荧光染料（例如 Brilliant Violet、Brilliant Ultraviolet 或 Brilliant Blue 染料），请在抗体混合液中加入 Brilliant Stain Buffer（BSB），以减少荧光染料之间的相互作用并提高信号分辨率。按照制造商说明添加 BSB（通常为 1x 最终浓度），轻柔混匀，并为所有样本配制主混合液（额外增加约 10% 体积）。避光保存并在使用前置于冰上。
  7. 加入抗体混合液，在室温避光条件下孵育 30–50 分钟。用染色缓冲液和不含 Ca2+/Mg2+ 的 PBS 洗涤，然后在 500 x g 下离心 5 分钟。通过将浓缩液与稀释液按比例稀释来配制工作用固定/透化溶液。例如，1 份浓缩液 : 3 份稀释液（配制成 1x 或指定工作浓度）。
  8. 加入固定/透化溶液以充分重悬细胞（每 100 万个细胞约 100–200 µL），在室温或 2–8 °C 条件下避光孵育 15–20 分钟。固定完成后，用 1x 透化缓冲液洗涤细胞，弃去上清液。至少重复洗涤一次（有时两次），以去除过量的固定剂。
  9. 在 1x 透化缓冲液中将荧光标记抗体稀释至优化浓度，配制胞内染色混合液。根据需要，将胞内抗体混合液加入已透化的细胞中，包括针对细胞因子、转录因子或磷酸化蛋白的抗体。
  10. 在室温避光条件下孵育 2 小时。
    注意：如有需要，孵育时间可缩短至制造商推荐的最短时间，或在 4 °C 避光条件下过夜孵育，不影响染色质量。
  11. 用 1x 透化缓冲液洗涤细胞两次，再用染色缓冲液洗涤一次，然后将沉淀重悬于 250–300 µL 染色缓冲液中。
  12. 将悬液通过 40 µm 滤网以获得单细胞悬液，并将样本置于冰上或 4 °C 保存，避光直至分析。避免染色样本长时间储存，染色后应尽快上机检测。
  13. 使用配备与所用荧光染料相匹配的激光器和滤光片的流式细胞仪。设置补偿对照，包括单染样本和荧光减一对照（FMO 控制）。
  14. 每个样本至少采集 50,000–100,000 个事件以确保统计分析的可靠性。使用 FlowJo、FCS Express 或等效软件进行数据分析。圈选活细胞和单细胞群体，分析表面及胞内标志物的表达。
    注意：通过系列稀释对每种荧光标记抗体进行滴定，以确定能够提供最强信号、最低背景和清晰群体分离的最佳浓度。

5. 基于Annexin V的细胞凋亡流式细胞术分析：

  1. 必要对照与试剂：
    1. 未染色对照：用于建立细胞自发荧光的基线，从而区分真实阳性信号与背景信号。
    2. 单染对照：需为面板中每种荧光染料设置，以实现准确的补偿（常规流式细胞术）或光谱解混（光谱流式细胞术）。这些对照确保各通道间信号的准确分离。
    3. 荧光减一对照（FMO 对照）：对于微弱或过渡性群体的设门至关重要，有助于避免对弱阳性事件的高估。
    4. 凋亡阳性对照：使用经人为诱导凋亡的样本（如经星形孢菌素处理的细胞），以验证该检测方法能够可靠地识别凋亡事件。
    5. 同型对照：对于 Annexin V 本身无实际意义，因其结合依赖于磷脂特异性而非抗体介导。但若需检测其他表面标记物抗体，可相应加入同型对照。
      注意：使用含有钙离子的 Annexin V 结合缓冲液，因 Annexin V 的结合依赖于钙离子；应采用商用或经验证的等效缓冲液。
    6. 使用膜不通透性活力染料（如 PI、7-AAD、DAPI 或可固定死细胞染料）以区分早期凋亡细胞与晚期凋亡/坏死细胞。应选择与流式细胞仪激光器及固定条件兼容的染料。
  2. 染色步骤：
    1. 通过在 500 × g 条件下离心 5 分钟收集共培养细胞。小心吸除并弃去上清液，以去除培养基和悬浮碎片。用冷染色缓冲液（如含 1–2% FBS 的 PBS）洗涤细胞两次，以降低背景染色并去除干扰蛋白。
    2. 若需检测谱系或亚群标记物（如 PBMCs 中的 CD8，或肿瘤细胞中的癌症干细胞标记物 Lgr5），将细胞与抗体混合液在室温下轻柔振荡孵育 30–45 分钟，并避光。此阶段的表面染色可保持抗原完整性，并实现特定区室的分析。
    3. 洗涤细胞两次：先用冷染色缓冲液去除未结合抗体，再用 Annexin V 结合缓冲液（如 BioLegend 货号 422201）置换，以确保钙离子供应。将细胞浓度调整至约 1 × 106 个细胞/mL 的结合缓冲液中。
    4. 每份样本取 100 µL 细胞悬液，加入 5 µL 荧光标记的 Annexin V 试剂。所选荧光染料应与面板中其他染料在光谱上兼容。
    5. 使用 PI、7-AAD 或 DAPI 等活力染料进行复染。对于 PI 和 DAPI，最佳稀释比例通常为 1:1000 至 1:60,000，具体取决于仪器和激光强度，需通过实验确定。若后续需固定处理，建议使用可固定型活力染料。
    6. 轻轻吹打重悬细胞，并在室温避光条件下孵育 20–40 分钟。最佳孵育时间应通过实验确定，因过长孵育可能导致非特异性结合或假阳性增加。
    7. 向每孔加入 200 µL Annexin V 结合缓冲液（若样本浓度较高，最少不少于 100 µL）。此体积可满足流式细胞术检测需求，并在采集过程中维持缓冲条件。应尽快在已校准的流式细胞仪上获取数据，确保电压设置已优化，以清晰分辨阴性和阳性群体。
  3. 推荐设门策略：
    1. 利用前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）图排除微小碎片和大颗粒聚集体，仅保留完整细胞。应用 FSC-A 与 FSC-H（或 FSC-W）设门去除双联体和聚集体，确保仅分析单细胞。
    2. 根据活力染料信号，适当排除强阳性的死细胞。或可将该染料纳入 Annexin V 分析的四象限图中。利用表面标记物区分 PBMCs（如 CD45+）与肿瘤细胞（如 EpCAM+ 或其他肿瘤特异性标记物），从而实现不同区室中凋亡的特异性定量。
    3. 在各已设门的区室内，绘制 Annexin V 与活力染料的散点图，以识别四类细胞群：a) Annexin V− / 染料− = 活细胞；b) Annexin V+ / 染料− = 早期凋亡细胞；c) Annexin V+ / 染料+ = 晚期凋亡或坏死细胞；d) Annexin V− / 染料+ = 原发性坏死细胞或干扰信号（需谨慎解读）。
    4. 进一步将 PBMCs 划分为不同亚群（如 CD4 T 细胞、CD8 T 细胞、NK 细胞、单核细胞），以分析特定免疫细胞群体中的凋亡特征。

6. 类器官共培养中T细胞监测的ELISPOT实验（3天）：

  1. 第0天，清洗预先包被的PVDF膜96孔板并进行活化。根据ELISpot试剂盒说明书，将板在4 °C下储存24小时，用于检测目标抗体/细胞因子。
  2. 第1天，
    1. 按照第3.5节所述方法将类器官制备成单细胞悬液。在室温下以500 × g 离心5分钟，然后重悬于CTL培养基（随CTL ELISpot试剂盒提供）。解冻冻存的外周血单个核细胞（PBMCs），或使用新鲜分离的PBMCs。在室温下以500 × g 离心5分钟。
    2. 将PBMCs重悬于试剂盒提供的培养基中。按5:1的比例轻轻混合类器官单细胞与PBMCs进行共培养。每孔加入200 µL共培养混合液至预活化的96孔检测板中。轻敲板体以混匀。在37 °C下孵育4小时。4小时后，轻柔地从孵育箱中取出检测板，并向指定孔中加入处理因素，同时设置适当的阳性与阴性对照。
      注意：必须优化类器官与PBMCs的比例，以获得最佳的细胞因子斑点发育效果和扫描结果。
  3. 第2天，
    1. 经过24小时孵育后，按照试剂盒生产商的染色方案进行操作。设置单色和双色对照，以检测并比较分泌特定标志物的细胞数量。不同染色的孵育时间可能不同，应定期监测斑点发育情况。按照生产商说明对板进行扫描。绘制并比较分泌的免疫斑点数量。
      注意：根据实验设计及目标标志物的不同，细胞接种数量与斑点数量之间的关系可反映细胞因子/抗体在单色或双色检测中的表达情况。

7. 使用 Annexin V NIR 和活细胞成像进行实时凋亡检测（3 天）：

结合自动化的活细胞成像，Annexin V NIR 可实现对药物反应和细胞毒性分析中凋亡性细胞死亡的实时、高通量监测。

  1. 第0天，将类器官制成单细胞悬液。用GFP细胞示踪剂对细胞进行染色。将染色后的单细胞接种于 100 µL 每孔加入完全培养基。静置培养，使细胞贴壁并形成细胞簇。
    注意：使用96孔U型底超低吸附板。典型起始密度（需根据实验调整）：每孔5,000个细胞、每孔10,000个细胞。设置未处理阴性对照孔、溶剂对照孔以及所有实验处理组（每组设三复孔或更多）。
  2. 第1天，解冻冻存的外周血单个核细胞（PBMCs）或使用新鲜分离的PBMCs。将PBMCs在500 x g 室温下孵育5分钟。将PBMC重悬于添加了IL-2的扩增培养基中，并置于培养箱中孵育。
  3. 第2天，用黄色细胞示踪染料对PBMCs进行染色。染色后，将PBMCs重悬于RPMI培养基中。轻柔地从培养板中移除类器官培养基。以1:5的比例，将类器官单细胞与PBMCs轻轻混合进行共培养。添加 200 µL 将含有 PBMCs 的 RPMI 培养基加入共培养混合物的每孔中。轻轻敲击培养板，随后将其放入培养箱中。
    注意: 避免扰动培养孔底部的类器官单细胞。
  4. 孵育 2–4 小时于 37 °C孵育4小时后，轻轻从培养箱中取出培养板。
  5. 准备药物孔，设置适当的阳性和阴性对照。将冻干的Annexin V NIR试剂重悬于 100 µL 完全培养基或PBS，轻轻混匀。配制含Annexin V NIR的2倍处理培养基，其浓度为最终工作浓度的两倍（例如，若最终稀释比例为1:200，则按1:100配制），并确保培养基中含有≥1 mM Ca2⁺.
  6. 向孔中加入1:200稀释的Annexin V NIR。将培养板置于活细胞成像培养箱中，继续培养48–72小时。
    注意：类器官与外周血单个核细胞（PBMC）的比例必须优化，以确保充分的细胞间相互作用并获得可测量的凋亡反应。
  7. 活细胞成像与分析
    1. 使用 4x 或 10x 物镜，在近红外（NIR）通道采集 Annexin V NIR 的图像（若进行多重检测，可同时采集其他通道）。根据处理时间，每 4–6 小时扫描一次培养板，持续 24–72 小时。
    2. 使用活细胞成像软件（如 IncuCyte CX3）。对于基础定量分析，可通过近红外（NIR）通道使用总面积或对象计数；对于单细胞动力学分析，使用“单细胞”或“对象分析”模块。若进行多重检测（如 Cell tracer yellow 与 GFP），请参考光谱解混说明。

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结果

首先，我们采用标准化流程从多名患者的样本中建立了肿瘤类器官（图1）。这些患者来源的类器官（PDO）通常需要约2周时间进行建系，之后可进行扩增和传代以用于进一步研究。需要注意的是，不同组织来源的类器官在建系时间和成球效率上存在差异。例如，某些组织需要更长时间才能形成类器官，而某些类器官则需要更长时间才能达到适宜传代的汇合度。可根据具体情况调整类器官培养基中的添加成分。

接下来，我们采用本文所述方案（图2）建立类器官-T细胞共培养体系。按照前述方法分离患者外周血中的外周血单个核细胞（PBMCs），并进行扩增。应优化肿瘤细胞与淋巴细胞的比例，因为超出该范围的比例可能导致不同的结果。较低的比例可能限制类器官与T细胞之间的相互作用程度。

为了评估共培养系统的功能，我们对类器官和共培养体系进行了并行的免疫荧光成像，以比较 Ki67 和裂解型caspase-3 的表达情况，分别作为增殖和凋亡的生物标志物（

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讨论

本方案描述了一种从我们的生物样本库中可操作且可重复地生成类器官（PDO）和扩增T细胞的方法。同时详细描述了针对携带不同突变的患者样本所建立的结直肠癌类器官（PDO CRC）共培养体系及其相应的治疗方案。所得结果展示了治疗干预对共培养模型的影响。

本文所述的类器官共培养系统为体外模拟复杂的生物学相互作用提供了一个稳健且可调节的平台。通过将外周血单个核细胞（PBMCs）与匹配的患者来源类器官整合，该方案相较于传统的二维细胞培养，能更真实地再现类器官的信号动态和功能异质性。与早期可重复性较低或存活率有限的方法不同，本方法优化了培养条件，可在目标时间点内同时维持类器官的完整性与T细胞活性20,21。该方案的一个关键优势在于其灵活性，可应用于多种类器官类型，包括肠道、肝脏和肺模型，并支持与多种免疫细胞进行共培养13,14,

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披露

C.K. 报告了以下利益披露，均与本稿件无关：Loki Therapeutics（研究资助）、Teiko（顾问）、Seattle Genetics（顾问）、Insights Driven Research（顾问）、BMS（顾问）、Guardant Health（顾问）、OMNI Oncology（顾问）、Exelixis（顾问）、Nuvectis Pharma（顾问、药物）、Real CME（讲酬）。C.K. 与 N.T. 是于2025年1月17日提交的美国临时专利申请63/746,435的共同发明人，该申请与本稿件无关。其余作者无任何利益披露需要报告。

致谢

本工作由蒙特菲奥里爱因斯坦综合癌症中心CCSG（P30CA013330）资助。我们感谢Hillary Guzik、Rotem Alon、Jinghang Zhang、Swathi Swaminathan和Jacky Chuen提供的技术协助。流式细胞术研究在阿尔伯特·爱因斯坦医学院流式细胞术核心设施使用由美国国立卫生研究院资助的Cytek Aurora分析仪（1S10OD026833-01）完成。共聚焦成像在阿尔伯特·爱因斯坦医学院分析成像设施使用由美国国立卫生研究院资助的Leica STELLARIS 8显微镜（1S10OD034397-01）完成。E.N.、W.E.和C.K.的研究得到了美国国立卫生研究院资助项目T32CA200561、R01CA248536、R42CA287679和K12CA279871的支持。资助方未参与本稿件的撰写。

我们还感谢Ruth L.和David S. Gottesman干细胞与再生医学研究所对MM、NS和NT的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学品、试剂与抗体
不含维生素A的B27补充剂 GIBCO C12587-010
B27添加剂 GIBCO 17504-044 
N-乙酰半胱氨酸 Sigma-Aldrich A9165-5G 
烟酰胺 Sigma-Aldrich N0636 
人重组 EGF Peprotech AF-100-15 
N2Gibco17502001
A83-01 Tocris2939
SB202190 Cayman Chemicals 10010399
前列腺素 E2 Cayman Chemicals 14010-1 
Y-27632 Sigma-Aldrich Y-0503 
II 型胶原酶 Sigma-Aldrich C6885 
透明质酸酶 IV 型 Sigma-Aldrich H3506 
高级DMEM-F12 GIBCO 12634-028 
青霉素/链霉素 GIBCO 15070063
超谷氨酰胺 I 型 Lonza BE17-605E 
HEPES GIBCO 15630-056 
TrypLE Express GIBCO 12604-013 
无细胞培养冻存液 GIBCO 12648-010 
RPMI 1640 GIBCO 11875093
人血清，来源于人男性AB型血浆 Sigma-Aldrich H3667 
Benzonase 默克 70746-3 
人重组干扰素γ Peprotech 300-02 
中性蛋白酶II型 Sigma-Aldrich D4693 
细胞回收溶液 Corning 354253
Invivogen PrimocinInvivogen ANTPM1NC9141851
重组人IL-2（大肠杆菌表达，无载体蛋白）Biolegend791906
重组人IL-7（大肠杆菌表达，无载体蛋白）Biolegend569706
重组人 IL-15（无载体）Biolegend570306
PE/Cyanine5 抗人 CD107a（LAMP-1）Biolegend328656
Brilliant Violet 711™ 抗人 CD137（4-1BB）Biolegend309832
Pacific Blue™ 抗人 CD8a 抗体Biolegend300928
抗人CD3-APC/Cy7Biolegend317342
抗人 CD4PerCP/Cyanine5.5 抗人 CD4Biolegend980810
Alexa Fluor® 647 抗人/小鼠颗粒酶 BBiolegend515406
抗人 CD56-PE/Cy7Biolegend985912
PE/Dazzle™ 594 抗人 IFN-γ 抗体Biolegend506530
PE 抗人 CD274（B7-H1，PD-L1）Biolegend393608
纯化的抗人CD28抗体Biolegend302901
Brilliant Violet 510™ 抗人 CD45 抗体Biolegend304036
小鼠抗人 CD326（EpCAM）（PE/Cy7 标记）Biolegend324222
抗-Ki67Abcamab15580
NucView® 488 Caspase-3 活细胞检测试剂盒Biotium30029
FITC Annexin V 凋亡检测试剂盒（含 PI）Biolegend640914
PE/Cyanine7 Annexin VBiolegend640950
Incucyte® Annexin V 近红外染料赛多利斯4768
活/死™ 可固定蓝色死细胞染色试剂盒（适用于紫外激发）InvitrogenL23105
细胞示踪远黄色赛默飞世尔科技C34567
细胞示踪深红赛默飞世尔科技C34564
绿色 CMFDAMedChem ExpressHY-126561 
人源 TruStain FcX™ （Fc受体阻断液）Biolegend422302
Brilliant Stain 缓冲液BD 生物科学563794
BD Pharmingen™ BSA 染色缓冲液BD 生物科学554657
补偿微珠Biolegends424602
康宁® 杜尔贝科’不含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液Corning20-031-CM
康宁® 杜尔贝科’含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液Corning20-030-CV
抗人PD1抗体（nivolumab）Merus/SelleckchemA2002
二甲基亚砜Fisher ScientificBP231-100 
DMEM杰内西25-500
EDTA缓冲液Invitrogen15575020
FBSVWR97068-075
PBS杰内西25-507
多聚甲醛（PFA）赛默飞世尔科技化学试剂0473779L
固定/通透溶液试剂盒BD554714
人胃泌素 IMilliporeG9145-.1MG
GLUTAMAX IFisher Scientific35050061
CD3/CD28 共刺激因子混合物 STEMCELL Technologies 10971
ImmunoCult 扩增培养基STEMCELL Technologies 10981
含DAPI的ProLong Diamond抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP36962
Triton X-100赛默飞世尔科技化学品215680025
0.4% 台盼蓝溶液Gibco15250061
Tween-20TCI AmericaT0543500G
仪器设备
流式细胞仪/流式细胞术核心Cytek（无锡）生物科学型号 N7-0021
流式细胞仪/辛格实验室InvitrogenATTUNE NXT（型号：4486517）
共聚焦显微镜LeicaSTELLARIS 8
活细胞分析系统赛多利斯Incucyte CX3

参考文献

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结肠肿瘤类器官T细胞共培养流式细胞术ELISpot实验活细胞成像肿瘤杀伤实验免疫检查点抑制剂caspase-3染色颗粒酶B分泌肿瘤增殖标志物

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