小鼠舒张功能评估的多普勒超声心动图技术

摘要

本方案介绍了一种基于多普勒的经胸超声心动图方法，用于小鼠收缩功能及常规舒张功能指标的可重复性评估。

摘要

心力衰竭（HF）是一种以心脏功能受损为特征的重大全球健康负担。它可能由收缩功能下降或舒张期松弛异常引起，后者见于射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）。可靠的临床前模型和定量工具对于研究疾病机制及治疗干预至关重要。经胸超声心动图是一种非侵入性成像技术，广泛用于小鼠模型中心脏结构和功能的评估。本方案描述了一种在吸入麻醉下，使用高频（30–40 MHz）探头进行基于多普勒的高分辨率小鼠超声心动图检查的标准化方法。实验动物被置于温度可控的平台上，并持续监测心率、呼吸和体温，以确保生理状态稳定。该操作流程包括获取B型、M型、脉冲波多普勒、彩色多普勒和组织多普勒图像，以评估左心室结构、收缩功能以及常规舒张功能指标。离线分析采用多心动周期的盲法测量结果取平均值的方式进行。该方法可实现心脏功能的可重复性评估，适用于心血管疾病小鼠模型的纵向研究。

引言

心力衰竭（HF）影响全球超过6400万人，仍是导致发病和死亡的主要原因之一^1,2。临床上将心力衰竭分为射血分数降低的心力衰竭（HFrEF）、射血分数轻度降低的心力衰竭（HFmrEF）和射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）^3,4。HFpEF患病率不断上升，且缺乏靶向治疗手段，凸显了建立可靠的临床前模型和用于心脏表型分析的定量方法的重要性⁵。HFpEF的一个核心特征是舒张功能受损，这突显了在实验系统中评估心室舒张和充盈动态的可靠工具的重要性。

小鼠模型被广泛用于研究心血管疾病，包括压力超负荷、缺血性损伤和药物诱导模型，并且适用于基因修饰^6，7。在这些模型中，对心脏功能进行准确且可重复的评估至关重要^8，9。经胸超声心动图提供了一种无创、快速且可重复的方法，适用于多次重复测量，以记录疾病进程及其对潜在治疗干预的反应，同时能够在活体（in vivo）条件下评估心脏结构和功能¹⁰。该方法还有一个额外优势，即避免了研究人员或实验动物暴露于辐射，从而可能干扰实验结果。

本文的主要目标是提供一种标准化且可重复的方法，用于通过多普勒超声心动图评估小鼠左心室舒张功能。该方案结合了传统的二尖瓣血流测量和组织多普勒成像，以量化E/A比值和E/e′比值等参数，这些参数可作为心室松弛功能和充盈压的指标。通过在同一只动物中进行纵向评估，该技术有助于在临床前心力衰竭模型中研究疾病进展及治疗反应。

在小鼠研究中开发并广泛使用多普勒超声心动图的根本原因在于其能够弥合临床前模型与临床心脏病学之间的转化鸿沟。尽管有创血流动力学测量仍是金标准，但由于其终末性特点，无法用于系列纵向研究。多普勒超声心动图借鉴自临床实践，使研究人员能够以微创方式获取具有生理意义的舒张功能指标。高频率超声系统的进步进一步提高了空间和时间分辨率，从而能够准确捕捉小鼠快速的心动周期，实现定量分析¹¹。

其他技术（如心脏磁共振成像）成本高昂、耗时较长，且可及性有限，导致重复研究难以实施。压力-容积环分析虽被视为评估舒张功能的金标准，但具有侵入性，技术要求高，通常为终末性操作。相比之下，超声心动图在准确性与可行性之间提供了切实可行的平衡，成为小动物纵向表型分析中最易获取的检测手段。与新兴技术（如斑点追踪应变成像或左心房功能分析）相比，传统的基于多普勒的方法对专业技术要求较低，更易于在不同实验室间推广，从而提高研究结果的可重复性与可比性。因此，该方法为在小鼠模型（尤其是射血分数保留型心力衰竭或早期心脏功能障碍模型）中评估舒张功能提供了一种稳健、便捷且具有转化价值的技术路径^12，13。

方案

所有动物实验程序均经机构动物护理和使用委员会（IACUC：批准号 A00007272-23-R26）批准，并依照机构和国家指南进行。本研究共使用8只C57BL/6NJ对照小鼠。采用校准过的挥发性麻醉机实施异氟烷麻醉，并配备适当的废气清除系统以最大限度减少人员暴露。实验过程中持续监测动物心率和呼吸，以维持生理稳定并防止麻醉过量。使用加热平台防止低体温。研究者可选择使用直肠温度计监测动物深部体温。涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥。动物在麻醉期间始终有人看护，并持续监测直至完全清醒，其标志为恢复直立姿势以及在笼内正常活动（材料表）。

1. 动物准备

1. 成像前 24–48 小时使用脱毛膏去除胸部毛发，并用湿润纱布彻底清洁。
2. 确保胸区毛发完全清除，并在成像前等待皮肤刺激或发红完全消退。
3. 在麻醉诱导前，准备好成像系统、麻醉装置和监测设备。
4. 选择心脏成像预设模式，设置成像深度为 2–2.5 cm，帧率 ≥200 帧/秒，并调节增益以优化心肌的可视化效果。

2. 麻醉与生理监测

1. 使用2–3%异氟烷氧气混合气体诱导麻醉，并通过鼻罩将麻醉维持在1–1.5%。
2. 将小鼠仰卧置于温度可控的平台上，并将其四肢固定于心电图电极上。
3. 涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥。
4. 持续监测心率和呼吸频率。
5. 将心率维持在约450–500次/分钟，以确保多普勒E波和A波的分离。
   注意：心率过低（<400次/分钟）可能提示麻醉过深及负荷状态改变，而心率过高（>500次/分钟）可能导致E波与A波融合。应将生理参数维持在既能保持正常生理状态又能优化多普勒信号解读的范围内。建议将心率控制在约400–500次/分钟，以清晰分离二尖瓣血流E波和A波，提高舒张功能测量的准确性。该目标范围主要基于测量需求设定，而非严格的生理要求。心率低于400次/分钟可能反映麻醉较深及负荷条件改变，可能影响舒张功能指标；相反，心率超过550次/分钟可能导致E波和A波融合，降低可解读性。呼吸频率应维持在80–120次/分钟，体温维持在37 ± 0.5 °C。应逐步调整异氟烷浓度（±0.1–0.2%），以维持生理稳定。

3. 成像工作流程

1. B型超声成像
   1. 将探头沿胸骨放置，获取胸骨旁长轴切面图像。
   2. 采集多个心动周期内显示心腔结构和室壁运动的动态图像序列（连续视频记录）。
2. M型超声成像
   1. 将探头放置以获取乳头肌水平的胸骨旁短轴切面，在该切面中左心室呈环形（类似甜甜圈），两个乳头肌基底部位于4点钟和8点钟位置。
   2. 调整M型取样线，使其垂直于室间隔和左室后壁。
   3. 记录3–5个心动周期的图像，并保存用于分析。
3. 左心室流出道多普勒（LVOT Doppler）
   1. 启用彩色多普勒，以显示主动脉水平的血流情况。
   2. 调整多普勒声束，使其与左心室流出道内的血流方向平行。
   3. 记录3–5个心动周期的脉冲波多普勒信号。
4. 二尖瓣血流多普勒
   1. 获取心尖四腔心切面图像。
   2. 将脉冲多普勒取样容积置于二尖瓣瓣叶尖端处。
   3. 以200–300 mm/s的速度记录E波和A波。
5. 组织多普勒成像
   1. 将取样容积置于室间隔侧的二尖瓣环处。
   2. 在多个心动周期内记录舒张早期（e′）和舒张晚期（a′）的组织运动速度。

4. 恢复

1. 停止麻醉并清除超声耦合剂。
2. 将小鼠放入温暖的恢复笼中。
3. 监测至小鼠完全恢复自主活动能力后，再放回饲养环境。

5. 图像分析

1. 打开分析软件并加载动态图像序列。
2. 在舒张末期和收缩末期测量心室的尺寸。
3. 测量E波和A波速度，并计算E/A比值。
4. 测量e′速度，并计算E/e′比值。
5. 对3–5个心动周期的测量值取平均。

结果

本方案可获取高质量的小鼠超声心动图图像，用于可靠评估小鼠心脏结构与功能。稳定的麻醉、体位摆放及生理监测对于获得一致的成像结果至关重要(图1)。B型成像可清晰显示心脏解剖结构。心尖四腔观可用于评估所有心腔(图2A–B)，而胸骨旁长轴观可明确左心室结构，并作为测量的参考切面(图3A–B)。在乳头肌水平进行M型成像可准确测量左心室腔内径及室壁厚度，包括LVID、LVAW和LVPW(图4A–B)，有助于评估心脏大小及收缩功能。多普勒成像可清晰显示二尖瓣血流的E波与A波，用于计算E/A比值(图5)，而组织多普勒可获得可测量的E′和A′速度，用于E/e′比值的评估(图6)。维持理想的心率及探头对齐对于避免波形融合并确保测量准确性至关重要。

图1小鼠经胸超声心动图检查的麻醉与体位摆放 (A成像装置示意图，显示温度控制平台、麻醉输送系统、心电图电极连接以及超声探头定位装置。系统布局可实现成像过程中稳定的生理监测和探头的精确操控。 (B带集成心电图电极和异氟烷输送鼻罩的成像平台特写，旨在将小鼠固定于标准化仰卧位，同时维持麻醉状态。 (C麻醉后的小鼠仰卧于成像平台上，四肢用医用胶带固定在心电图电极上。鼻罩输送吸入用异氟烷（1.0–1.5%维持浓度），胸部保持平直，以确保最佳图像采集和稳定的心脏监测。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 2：心尖四腔切面 B 型超声心动图图像。（A） 代表性灰阶 B 型超声图像，显示单个成像平面内全部四个心腔：左心房、左心室、右心房和右心室。 （B）标注图像，突出显示主要解剖结构。 超声探头置于左侧胸壁外侧，并向头侧倾斜对准心尖，以获得最佳可视化效果。请点击此处查看此图的高清版本。

图 3：胸骨旁长轴 B 模式成像。（A）代表性胸骨旁长轴 B 模式图像，显示心脏解剖结构，包括左心室腔、室间隔和后壁。（B）用于心脏尺寸定量分析的高分辨率图像。该切面用于评估整体心脏结构，并为后续成像模式提供引导。请点击此处查看该图的放大版本。

图4乳头肌水平的M型超声成像。 (A) 乳头肌可见的室中段胸骨旁短轴切面。B) 对应的 M 型超声心动图轨迹，取样线光标垂直于室间隔和左室后壁。 (CM型超声图像结合软件辅助分析，系统可自动识别并在心壁沿线上绘制标记线，进而计算心动周期中的左心室内径（LVID）、左心室后壁厚度（LVPW）和左心室前壁厚度（LVAW）等参数。缩写：LVID = 左心室内径（室间隔与后壁之间的距离）；LVPW = 左心室后壁厚度；LVAW = 左心室前壁厚度；ECG = 心电图。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 5：实验装置与多普勒信号概览。（A）实验准备示意图，显示将小型动物模型置于平台上，超声探头放置于胸区以进行心脏成像。（B）典型的彩色多普勒图，显示局部血流信号的强度与方向。（C）脉冲波多普勒追踪图，展示取样容积的位置，以及典型的脉冲波多普勒波形，显示早期（E）与心房期（A）充盈速度。图中同时标示了IVRT与IVCT，并配有同步心电图（ECG）以关联心动周期。缩写：IVRT = 等容舒张时间；IVCT = 等容收缩时间 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：心肌运动的组织多普勒成像。组织多普勒记录显示了来自心肌壁的心肌速度模式，其中可识别出早期（E′）和心房期（A′）成分。波形图与同步心电图（ECG）一同显示，以关联电活动与机械活动。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案为基于多普勒的经胸超声心动图在小鼠中的应用提供了标准化且可重复的方法，能够全面评估心脏结构、收缩功能以及常规舒张功能指标。结合使用B型、M型和多普勒成像，可在心血管疾病临床前模型中对心室尺寸、收缩功能及充盈动力学进行可靠定量分析¹⁴。

在小鼠超声心动图检查中，吸入性麻醉对心血管生理的影响是一个关键考虑因素。异氟烷已知会降低心率、改变前负荷和后负荷，并调节心肌收缩力，这些因素均可能影响多普勒法测得的舒张功能指标¹⁵。因此，谨慎使用麻醉剂并维持稳定的生理状态对于确保测量结果的可重复性和可解释性至关重要。对心率、体温和呼吸频率进行标准化，可减少变异性，提高不同实验组之间的可比性¹⁶。

传统的多普勒衍生指标，包括二尖瓣血流（E/A）和组织多普勒衍生的E/e′，广泛用于舒张功能的评估，当遵循标准化采集协议时，通常具有良好的可重复性¹⁷。通过在多个心动周期中取测量值的平均值，并以盲法方式进行分析，可进一步提高可重复性，从而减少观察者间和观察者内的变异。在纵向研究中，保持探头位置和成像平面的一致性对于提高测试-重测的可靠性也至关重要¹⁸。

在成像过程中维持适当的心率对于小鼠尤为重要，因为小鼠具有较高的固有心率。较低的心率通常与更深的麻醉状态相关，可能导致负荷条件改变，从而影响心室充盈模式。相反，过高的心率可能导致E波和A波融合，限制对舒张期指标的准确解读。因此，将心率维持在一个既能保持生理相关性又能实现多普勒信号分离的范围内，对于准确评估至关重要¹⁹。

尽管本方案主要关注基于多普勒的传统舒张功能指标，但并未纳入近年来文献中日益受到重视的更先进的超声心动图技术。心肌应变和应变率成像、左心房功能评估（包括储器相、充盈相和增压泵相）以及左心室解旋功能的评价，可为心肌松弛性和顺应性提供额外的机制性见解¹⁹。然而，这些技术需要特殊的图像采集方案、更高的时间分辨率以及专用的后期处理工具，因此超出了本工作流程的范围。当需要更详细的舒张功能表型分析时，应将这些方法视为互补的技术手段¹⁶。

除了超声心动图外，其他技术如心脏磁共振成像（MRI）和有创性压力-容积环分析也可提供对心脏功能的补充性评估。MRI具有高空间分辨率和精确的容积测量能力，而压力-容积分析则可提供血流动力学的金标准数据。然而，这些方法受限于成本高、有创性以及在纵向研究中的适用性较低。相比之下，经胸超声心动图仍是一种快速、无创且广泛可及的技术，适用于对小鼠模型进行系列心脏功能评估²⁰。

总体而言，当密切注意生理监测和标准化成像技术时，该方案能够获得高质量且可重复的小鼠超声心动图数据。结合结构、收缩功能及常规舒张功能的测量指标，使该方法非常适合用于临床前心血管研究中针对心脏生理、疾病进展及治疗干预的纵向研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脱毛膏	Nair®	N/A	成像前脱毛
加热垫	VetEquip（或同等产品）	N/A	维持体温（约37℃） °C)
高频超声系统	FUJIFILM VisualSonics	Vevo F2（或同等型号）	带有心脏预设功能的小动物成像系统
成像平台	VisualSonics	集成平台	心电图和  呼吸监测
诱导室 &和鼻锥	VetEquip（或同等产品）	N/A	气体麻醉给药
异氟烷蒸发器	VetEquip（或同等产品）	经典麻醉系统（或同等设备）	麻醉输送系统
线性阵列换能器（30-40 MHz）	VisualSonics	MS550D	用于小鼠心脏成像的高频探头
眼科润滑剂	通用型（例如，Refresh PM/等效产品）	N/A	防止角膜干燥
手术胶带	3M（或同等产品）	微孔手术胶带	固定肢体以进行心电图检查
超声耦合剂	帕克实验室	Aquasonic 100（或同等产品）	声学耦合
Vevo LAB 软件	VisualSonics	版本依赖性	图像采集与分析