合成了一系列基于三唑和噁二唑的乙酰胺衍生物，并评价了其作为脲酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性。化合物8c表现出最强的脲酶抑制活性，而化合物9e对α-葡萄糖苷酶的抑制效果优于阿卡波糖。牛血清白蛋白（BSA）结合实验和in silico研究支持其类药特性，表明这两个化合物均为有前景的先导候选物。
本文内容
摘要
摘要
本研究探讨了新型基于1,2,4-三唑和1,3,4-噁二唑的乙酰胺衍生物作为脲酶和α-葡萄糖苷酶双重靶点抑制剂的治疗潜力，这两种酶分别与胃肠道疾病和2型糖尿病相关。采用整合方法，结合多步有机合成、体外生物学评价、分子对接、计算机辅助 ADME预测以及密度泛函理论（DFT）分析，以鉴定具有理想药代动力学性质的高效先导化合物。以苯甲酸为起始原料，成功合成了一系列含取代乙酰胺基团的1,2,4-三唑衍生物（8a–c）和1,3,4-噁二唑衍生物（9d–f）。所有化合物均表现出对两种靶酶的抑制活性。其中，化合物8c对脲酶的抑制作用最强（IC₅₀ = 6.14 ± 1.06 µM），而化合物9e对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高（IC₅₀ = 27.29 ± 0.41 µM），优于对照抑制剂阿卡波糖（IC₅₀ = 38.25 ± 0.12 µM）。计算分析结果支持实验发现：ADME预测显示这些化合物具有良好的类药性质，分子对接表明其具有较强的结合相互作用，其中化合物8a对α-葡萄糖苷酶的结合亲和力最高（−7.165 kcal/mol），化合物9e对脲酶的结合能力最强（−7.30 kcal/mol）。DFT计算进一步将生物活性与电子性质相关联，揭示了最活跃化合物8c（0.14831 a.u.）和9e（0.14302 a.u.）具有相对较小的HOMO–LUMO能隙。综上所述，这些结果表明化合物8c和9e是开发下一代脲酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂的有前景的先导骨架。
引言
杂环结构单元此前已在多种现有药物中报道，杂环化合物代表了一类用于治疗代谢性和感染性疾病的重要酶抑制剂1․ 在杂环化合物中，1,3,4-噁二唑是药物发现领域研究最为广泛的骨架之一 报道为 抗病毒、抗菌、抗癌、降压、神经保护、抗惊厥和抗结核药物2,3,4,5․ 类似地，1,2,4-三唑类衍生物也表现出 抗惊厥、抗菌、抗病毒、抗结核、抗糖尿病、抗炎、抗增殖、抗氧化、抗疟疾和脲酶 抑制活性6,7․ 含乙酰胺结构的化合物具有显著的药理活性，已被用作杂环化学中的合成中间体，以及降血糖、抗凝血和化学增敏剂，使其成为药物发现中颇具吸引力的先导结构。8,9․
人们已将大量努力投入到多靶点抑制剂的开发中 αα-葡萄糖苷酶和脲酶 αα-葡萄糖苷酶抑制可延缓碳水化合物的消化和葡萄糖的吸收，从而降低2型糖尿病患者的餐后血糖水平。目前的抑制剂如 阿卡波糖虽有效，但伴随胃肠道副作用，因此需要结构多样的抑制剂10,11․ 尿素酶分解 将尿素分解为 氨和二氧化碳․ 该反应使细菌能够 幽门螺杆菌，可导致溃疡并加重 使宿主更容易罹患胃癌‚ 在胃中存活，因此脲酶是抗溃疡药物研发的重要靶点․ 一个治疗目标是开发 两种酶的新抑制剂 酶9,12․
然而，尽管已有相关研究 关于1,2,4-三唑和1,3,4-噁二唑骨架的研究中，极少有报道涉及含硫醚基团的1,2,4-三唑和1,3,4-噁二唑乙酰胺衍生物作为双靶点抑制剂的研究 αα-葡萄糖苷酶和脲酶抑制剂13․ 在此背景下，其蛋白质结合行为及计算表征也受到较少关注․ 本文提出，将三唑或噁二唑结构单元与乙酰胺骨架融合 将取代乙酰胺片段引入同一分子骨架中，将获得具有可接受理化性质的满意酶抑制谱․
为验证该假设，合成了一系列基于1,2,4-三唑的乙酰胺衍生物（8a–c）和基于1,3,4-噁二唑的乙酰胺衍生物（9d–f），并评价其对α-葡萄糖苷酶和脲酶的抑制活性。采用荧光光谱法、结合常数测定和热力学分析，研究了其中活性最强的化合物（8a、8c和9e）与牛血清白蛋白（BSA）的结合相互作用。此外，通过分子对接、ADME预测和密度泛函理论（DFT）计算，进一步探究了这些化合物的结合模式、药代动力学性质及电子特性。
方案
所有试剂均为分析纯，未经进一步纯化即使用。反应进程通过硅胶薄层色谱（TLC）监测，采用 n正己烷/乙酸乙酯（7:3–6:4，v/v），在紫外光下观察斑点。除非另有说明，所有反应均在常温常压下进行。合成化合物通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征， 1H NMR，以及 13C NMR 谱学。该 1H 和 13C NMR 谱图分别在 CDCl₃ 中以 600 MHz 和 150 MHz 记录，化学位移以 ppm 表示，相对于溶剂残留信号进行校准。合成路线如图所示 图1所有合成化合物的完整理化表征数据均在文中提供。 补充文件 1.
苯甲酸乙酯（1）的合成
将苯甲酸（50 g，0.41 mol）置于500 mL圆底烧瓶中，加入无水乙醇（150 mL）。在持续磁力搅拌下，滴加浓硫酸（6 mL）作为催化剂。使用水冷凝器在78 °C下回流加热反应混合物4–6小时。通过薄层色谱（TLC）监测反应进程。反应完成后，将混合物冷却至室温，并用饱和碳酸钠水溶液中和至pH为7–8。将反应混合物转移至分液漏斗，收集有机层，用蒸馏水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。过滤后，苯甲酸乙酯（1）直接用于下一步反应，无需进一步纯化（图1）。
苯甲酰肼（2）的合成
将苯甲酸乙酯（1；0.41 mol）溶于无水乙醇（100 mL）中，在持续搅拌下加入水合肼（80%，25 mL，过量）。反应混合物在空气氛围下，使用水冷凝器回流加热至78 °C，反应4–5小时。通过薄层色谱（TLC）监测反应进程。反应完成后，过滤收集白色结晶沉淀物苯甲酰肼（2），用冷乙醇洗涤，在室温下干燥至恒重，并用于后续合成步骤（图1）。
5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-硫醇（3）的合成
将苯甲酰肼（2；10 g，0.073 mol）和氢氧化钾（4.12 g，0.073 mol）加入至一个250 mL的圆底烧瓶中，该烧瓶内含有乙醇（30 mL）。使用水冷凝器在78 °C下回流加热混合物10分钟。然后加入二硫化碳（CS₂；5 mL，0.083 mol），继续回流反应3–4小时。通过薄层色谱（TLC）监测反应进程。反应完成后，将反应混合物转移至蒸馏水中，并在持续搅拌下加热。逐滴加入稀盐酸直至pH达到5，此时化合物（3）析出沉淀（图1）。通过过滤收集沉淀，用冷蒸馏水充分洗涤，干燥至恒重后称重以确定产率。该化合物通过FTIR、1H NMR和13C NMR波谱法进行表征。
4,5-二苯基-4H-1,2,4-三唑-3-硫醇（4）的合成
苯甲酰肼（2；5 g，0.037 mol）和苯基异硫氰酸酯（4 mL，0.037 mol）置于配备水冷凝器的100 mL圆底烧瓶中。将反应混合物在回流条件下加热 78 °C 直至硫代半卡巴腙中间体完全形成，经薄层色谱（TLC）确认 n正己烷/乙酸乙酯（7:3，v/v）。随后加入溶于乙醇（20 mL）的氢氧化钾（2 g，0.036 mol），继续回流，直至薄层色谱（TLC）确认生成化合物（4）。将反应混合物转移至蒸馏水中，加热并持续搅拌，用稀盐酸酸化至pH 5，使化合物（4）析出。图1沉淀通过过滤收集，用冷蒸馏水充分洗涤，干燥至恒重，并通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行表征， 1H NMR，以及 13C NMR 谱学
溴乙酰胺中间体 7(a–f) 的合成
将每种取代苯胺衍生物 5(a–f)（1 当量）溶解于氯仿中，并置于冰浴中冷却，以使反应温度维持在 0–5 °C。在持续搅拌下，滴加溴乙酰溴（6，≥98%，1 当量）。反应过程中根据需要加入 18% 的碳酸钠水溶液，以中和反应生成的氢溴酸，使反应体系的 pH 值维持在 9 至 10 之间。溴乙酰溴加毕后，将反应混合物升至室温并继续搅拌，直至薄层色谱（TLC）显示原料完全消耗。生成的溴乙酰胺中间体 7(a–f) 通过过滤收集，用冷蒸馏水洗涤，干燥至恒重，无需进一步纯化，直接用于后续合成步骤（图 1）。
基于三唑的乙酰胺衍生物 8(a–c) 的合成
将三唑衍生物（4；0.5 g，0.002 mol）溶于50 mL圆底烧瓶中的N,N-二甲基甲酰胺（10 mL）中。加入相应的溴乙酰胺中间体（7a、7b或7c；0.002 mol，1当量），持续搅拌，随后加入氢化钠（0.05 g，0.002 mol）以促进S-烷基化反应。反应混合物在室温下搅拌24–48小时，通过薄层色谱（TLC）监测反应进程。反应完成后，将反应混合物倒入冰水中以诱导沉淀析出。沉淀物通过过滤收集，用冷水充分洗涤，干燥后采用FTIR、1H NMR和13C NMR波谱法进行表征（图1）。
基于噁二唑的乙酰胺衍生物 9(d–f) 的合成
将噁二唑衍生物（3；0.5 g，0.002 mol）溶于50 mL圆底烧瓶中的N,N-二甲基甲酰胺（10 mL）中。加入相应的溴乙酰胺中间体7d、7e或7f（0.002 mol，1当量），随后加入氢化钠（0.05 g，0.002 mol）以促进S-烷基化反应。反应混合物在室温下搅拌24–48小时，通过薄层色谱（TLC）监测反应进程。反应完成后，将混合物倒入冰水中以析出产物。析出的沉淀通过过滤收集，用冷水充分洗涤，干燥后通过FTIR、1H NMR和13C NMR波谱进行表征（图1）。
α-葡萄糖苷酶抑制活性测定
通过将50 µL待测样品溶液与100 µL磷酸盐缓冲液（pH 6.8）配制的α-葡萄糖苷酶溶液（0.35 U/mL）混合，测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。反应混合物在37 °C孵育10分钟后，加入100 µL 1.5 mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷作为底物。继续在37 °C孵育20分钟后，加入1 mL 1 M碳酸钠（Na₂CO₃）终止反应。在400 nm处测定吸光度14。以阿卡波糖作为阳性对照；不含待测化合物的反应体系作为阴性对照，不含酶的反应体系作为空白对照。
所有实验均设置三个重复，结果以均值 ± 标准差（SD）表示。α-葡萄糖苷酶活性的抑制率通过以下公式(1)14计算：
(1)
其中，As 表示待测样品溶液的吸光度，Ab 表示试剂空白（不含α-葡萄糖苷酶）的吸光度，A0 表示阴性对照（不含样品）的吸光度。IC50 值通过测试浓度范围为 3.125 至 100 µM 的化合物获得，并使用标准作图软件进行非线性回归分析。
脲酶抑制实验
采用改良的贝尔泰洛特法测定脲酶抑制活性。反应混合物包含300 µL待测样品溶液、200 µL刀豆脲酶溶液和200 µL 25 mM尿素。将混合物于37 °C水浴中孵育30分钟。孵育结束后，加入500 µL显色溶液（含10 g/L苯酚和50 g/L亚硝基铁氰化钠），随后加入500 µL第二种溶液（含5% (v/v) 次氯酸钠和5 g/L氢氧化钠）。然后将反应混合物再孵育15–30分钟，以完成显色反应。
以试剂空白为对照，在 625 nm 处测定溶液的吸光度15。以硫脲作为阳性对照，不含受试化合物的反应混合物作为阴性对照，不含脲酶的混合物作为空白对照。所有实验均设三个重复（n = 3），结果以均值 ± 标准差（S.D.）表示。抑制率按以下数学公式（2）15 计算：
(2)
其中 A0 对照组（不含抑制剂）的吸光度 As 为测试样品（含抑制剂）的吸光度。通过作图及非线性回归分析确定IC50 使用标准数据绘图软件进行数值处理。
BSA 结合实验
采用荧光猝灭光谱法研究了牛血清白蛋白（BSA）与合成化合物之间的结合相互作用。用20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.4）配制10 µM的BSA储备溶液。在每次滴定实验中，将1.0 mL BSA溶液与2.0 mL磷酸盐缓冲液混合于石英比色皿中。通过逐步加入5 µL的待测化合物溶液（甲醇中浓度为1.5 mM）进行滴定。在295 nm激发波长下，记录300–400 nm波长范围内的荧光发射光谱，最大发射峰位于约336 nm处。荧光测量使用配备标准荧光采集软件的荧光分光光度计进行，激发和发射狭缝宽度分别设置为10 nm和2.5 nm。为了确定结合反应的热力学参数，包括吉布斯自由能（ΔG）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS），在298 K、308 K和313 K下重复进行滴定实验。
为了研究荧光猝灭机制，使用 Stern-Volmer 方程（公式 3）对实验数据进行分析16：
![荧光猝灭方程，Fo/F = 1 + Kqτ0[Q]，KSV[Q]，光谱学研究中使用的公式。](/files/ftp_upload/71216/71216eq3.jpg "figure-protocol-3")
(3)
其中 F0 以及 F 分别代表不存在和存在猝灭剂时BSA的荧光强度； Kq 是双分子猝灭速率常数； τ0 是在无猝灭剂存在时BSA的平均寿命； KSV 是 Stern-Volmer 猝灭常数；以及 [Q] 是淬灭剂的浓度。结合常数（Kb）以及结合位点的数量（n随后通过按照公式（4）绘制双对数图来确定16:
![配体结合分析方程，显示 log(F₀-F/F) = log Kᵦ + n log[Q]。](/files/ftp_upload/71216/71216eq4.jpg "figure-protocol-4")
(4)
此外，利用式（5）和式（6）所示的范特霍夫（Van't Hoff）方程和吉布斯-亥姆霍兹（Gibbs-Helmholtz）关系，计算了表征结合相互作用的标准吉布斯自由能变化（ΔG°）、标准焓变（ΔH°）和标准熵变（ΔS°）17：
ΔG∘ = -RT ln Kb （5）
(6)
其中 R 为通用气体常数，T 为开尔文单位的绝对温度。
分子对接
所有分子建模和对接模拟均使用 Schrödinger 套件（Maestro 界面）完成，其中对接采用 Glide 模块进行。α-葡萄糖苷酶（PDB ID: 5NN8）和脲酶（PDB ID: 4H9M）的晶体结构从 RCSB 蛋白质数据库中获取。使用蛋白准备向导对蛋白结构进行预处理，包括去除共结晶配体、水分子和非必需杂原子，补全缺失的残基和环区，分配正确的键级，并添加极性氢原子。使用 Epik 模块在生理 pH（7.0 ± 2.0）下确定质子化状态和互变异构体状态。随后，采用 OPLS 力场对预处理后的蛋白结构进行限制性能量最小化，以消除空间位阻冲突。
使用 LigPrep 模块制备了化合物 3、4、8(a–c) 和 9(d–f) 以及参考抑制剂阿卡波糖和硫脲的二维结构。在生理 pH 条件下对键级、立体化学和离子化状态进行了优化，并采用 OPLS 力场对所得的三维配体构象进行能量最小化。
使用受体网格生成工具生成受体网格，将网格盒的中心置于共结晶的天然配体上以定义活性位点。两种蛋白的网格盒尺寸均设置为 25 × 25 × 25 Å。脲酶网格的中心坐标为 x = −38.76，y = −44.14，z = 66.88，而α-葡萄糖苷酶网格的中心坐标为 x = 21.14，y = −7.56，z = 24.37。
采用 Glide 的高精度（XP）模式并结合柔性配体采样进行对接计算。对每个配体生成多个结合构象，选择 Glide 对接评分最低的构象用于后续分析。通过将共结晶配体重新对接至其相应的受体网格中，验证了对接方案的可靠性。均方根偏差（RMSD）值 ≤2.0 Å 表明该对接方案具有良好的可靠性和可重复性。
使用 PyMOL（版本 3.1）对对接复合物的结合构象进行可视化18使用 Discovery Studio Visualizer 分析蛋白质-配体相互作用，包括氢键、疏水接触和静电相互作用。19.
密度泛函理论（DFT）分析
所有密度泛函理论（DFT）计算均使用 Gaussian 09 完成，优化后的分子几何结构和前线分子轨道通过 GaussView 5 进行可视化。合成的基于三唑和噁二唑的乙酰胺衍生物 8(a–c) 和 9(d–f) 在水相中采用 Becke 三参数 Lee–Yang–Parr（B3LYP）杂化泛函结合 6-311+G(d,p) 基组20 进行了几何优化。溶剂效应通过类导体可极化连续介质模型（CPCM）21 加以考虑。随后在同一理论水平下进行振动频率计算，以确认所有优化结构均对应于势能面上的真实局部极小值，即无虚频存在。
为了理解所合成化合物的电子跃迁和动力学稳定性，计算了最高占据分子轨道（EHOMO）和最低未占据分子轨道（ELUMO）的能量。通过确定每种衍生物的前线分子轨道能隙（ΔE = ELUMO - EHOMO），评估其化学反应活性和动力学稳定性，能隙越小，反应活性越高。
此外，利用以下标准操作公式22，基于前线轨道能级计算了全局化学反应性描述符，包括化学硬度（η）、软度（S）、化学势（μ）、电负性（X）以及亲电性指数（w）：
(7)
(8)
(9)
(10)
通过系统比较该系列化合物的计算电子性质和全局描述符，建立结构-活性关系（SARs），以反映其观察到的α-葡萄糖苷酶和脲酶抑制特征。
此外，使用 VESTA 生成并可视化分子静电势（MESP）图，以描绘优化后分子骨架上的电荷分布。MESP 表面可用于识别亲电区域（缺电子，利于亲核攻击）和亲核区域（富电子，利于亲电攻击）。这种静电势分布最终与分子对接模拟中观察到的特定非共价结合相互作用（如氢键和静电接触）相关联。
ADME 分析
为了评估所合成的三唑和噁二唑基乙酰胺衍生物 8(a–c) 和 9(d–f) 的类药性及生物药剂学性质，进行了in silico吸收、分布、代谢和排泄（ADME）分析。所有合成化合物的简化分子输入线性系统（SMILES）表示，连同参考抑制剂阿卡波糖和硫脲，均使用分子模拟软件包生成，并提交至SwissADME网络服务器23。
计算的理化参数包括分子量（MW）、脂溶性（logP）、拓扑极性表面积（TPSA）、氢键供体数量（HBD）、氢键受体数量（HBA）以及可旋转键数量（RB）。
通过预测化合物的胃肠道（GI）吸收和血脑屏障（BBB）通透性来评估其药代动力学性质。此外，还评估了这些化合物是否符合利平斯基五规则及其他公认的类药性标准，以估算其口服生物利用度。最后，计算了每个化合物的合成可及性（SA）评分，评分范围为1（易于合成）至10（极难合成）。将所合成化合物预测的ADME和类药性特征谱与参考抑制剂进行比较，以评价其作为药物研发先导候选物的潜力。
结果
合成化合物的化学性质与表征
目标三唑和噁二唑类乙酰胺衍生物根据图1所示的合成路线进行合成。目标化合物以白色至黄色晶体形式获得，产率良好至优异（69%–87%）。通过薄层色谱（TLC）、熔点测定和波谱分析确认了其纯度。用于确认所合成化合物特征官能团的代表性核磁共振（NMR）谱图见图2。谱图中显示出酰胺羰基（C=O）、N–H、C=N、C–S以及芳香族C–H官能团对应的预期吸收峰，表明目标衍生物成功合成。
典型的1H NMR 谱图见图3。谱图中显示出酰胺NH质子、芳香质子、亚甲基连接链以及甲基取代基的特征共振峰，与所提出的结构一致。典型的13C NMR 谱图见图4。观测到的碳共振峰证实了合成衍生物中应存在的羰基碳、芳香碳、亚甲基碳和杂环碳的存在。代表性化合物包括8a（87%产率）、8c（约80%–85%产率）和9e（69%产率）。所有合成化合物的完整理化表征数据及NMR谱图详见补充文件1。
α-葡萄糖苷酶抑制
合成化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性总结于表1中。所有化合物均在不同程度上抑制α-葡萄糖苷酶。其中化合物9e的抑制活性最强，其IC50值为27.29 ± 0.41 µM，其次为化合物8a（33.15 ± 0.07 µM）和化合物8c（40.93 ± 0.59 µM）。化合物8b、9d和9f的抑制作用相对较弱，其IC50值分别为108.19 ± 0.18 µM、108.10 ± 0.03 µM和94.44 ± 0.25 µM。化合物9e的抑制效力强于参照抑制剂阿卡波糖（IC50 = 38.25 ± 0.12 µM），而化合物8a的活性与之相当。浓度依赖性抑制曲线见图5。
脲酶抑制潜力
合成化合物的脲酶抑制活性总结于表1中。化合物8c表现出最强的脲酶抑制活性，其IC50值为6.14 ± 1.06 µM，其次为化合物9e（8.14 ± 0.71 µM）和8a（12.25 ± 0.42 µM）。这些化合物的抑制活性强于参照抑制剂硫脲（IC50 = 21.25 ± 0.15 µM）。化合物8b、9d和9f活性较低，其IC50值介于82.15至103.05 µM之间。相应的浓度依赖性抑制曲线见图5。
BSA 结合
荧光猝灭参数总结于表2中。对于化合物8a和9e，Stern–Volmer常数（Ksv）随温度升高而增大，而猝灭速率常数（Kq）超过了最大扩散控制极限（2 × 1010 M⁻1 s⁻1），表明其猝灭机制为静态与动态猝灭的混合机制。相比之下，化合物8c的Ksv值随温度升高而降低，同时Kq值仍高于扩散控制极限，表明其主要为静态猝灭。热力学分析显示，化合物8a的ΔH和ΔS均为负值，提示结合过程中以氢键和范德华相互作用为主；而化合物8c和9e的ΔH和ΔS均为正值，表明疏水相互作用是主要的驱动力。在298 K下进行的结合亲和力分析表明，化合物8a具有最高的结合常数（Kb = 3.92 × 105 M⁻1），其次为化合物8c（1.54 × 104 M⁻1）和化合物9e（6.78 × 101 M⁻1）。荧光光谱图和Stern–Volmer图分别见图6、图7、图8、图9、图10和图11。
对接分析
分子对接结果总结于表3中。通过将共结晶配体重新对接至其相应的结合位点来验证对接方案，所得RMSD值均≤2.0 Å，从而证实了对接方案的可靠性（补充图1）。
根据生物活性和对接评分，选择化合物 8a、8c 和 9e 进行详细的相互作用分析。图 12A–D 展示了这些化合物在 α-葡萄糖苷酶活性位点内的代表性对接构象。化合物 8a 的对接评分最高（−7.165 kcal/mol），其次为化合物 8c（−6.80 kcal/mol）和 9e。这些化合物与关键催化残基（包括 D282、D404、D616、R600、S523 和 H674）形成了氢键相互作用。
尿素酶活性位点内的代表性对接构象如图所示 图12E–H化合物8c与A636、Q635和R439形成了氢键，而化合物9e则与E493、D494、H593、R609及A636形成了广泛的氢键网络。化合物8a也表现出与催化位点残基的有利相互作用。总体而言，分子对接分析结果支持了实验所得的抑制活性数据。
DFT 研究
计算得到的量子化学描述符总结于表4中。参考化合物的前线分子轨道分布及分子静电势图显示在图13中，而合成化合物对应的分析结果则展示在图14和图15中。
在所合成的化合物中，9e 的 HOMO–LUMO 能隙最小（0.14302 a.u.），其次为 8c（0.14831 a.u.）和 8a（0.15788 a.u.）。分子静电势图揭示了可能参与分子间相互作用的富电子区与缺电子区。计算得到的全局反应性描述符，包括电离能、电子亲和能、电负性、化学势、硬度、软度及亲电性指数，均已列于 表49系列化合物相较于相应的8系列衍生物表现出更小的HOMO–LUMO能隙和更高的亲电性。
ADME 分析
预测的药代动力学性质总结于表5中。所有合成化合物均满足主要的类药性标准。9系列衍生物未出现利平斯基规则违规情况，而8系列的每种化合物均出现一项违规。所有化合物均被预测具有高胃肠道吸收率、无血脑屏障通透性，以及可接受的氢键供体和受体数量。生物利用度评分 consistently 被预测为0.55。合成可及性评分介于5.70至6.39之间，表明合成复杂度中等。
数据可用性：
本研究期间生成的数据集和辅助材料已存入Zenodo知识库，可通过https://doi.org/10.5281/zenodo.21238952公开获取。
图 1： 基于三唑和噁二唑的乙酰胺衍生物的合成路线。 反应示意图展示了中间体及最终化合物 8(a–c) 和 9(d–f) 的合成过程。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2： 化合物 8a 的核磁共振谱。 （A）化合物 8a 的1H NMR 谱。（B）化合物 8a 的13C NMR 谱。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：化合物8c的核磁共振谱图。（A）化合物8c的1H NMR谱图。（B）化合物8c的13C NMR谱图。请点击此处查看该图的高清版本。
图 4：化合物 9e 的核磁共振谱图。（A）化合物 9e 的1H NMR 谱图。（B）化合物 9e 的13C NMR 谱图。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：合成化合物对α-葡萄糖苷酶和脲酶的抑制活性。（A）化合物3、4、8(a–c)和9(d–f)对α-葡萄糖苷酶和脲酶的抑制百分率，分别与参考抑制剂阿卡波糖和硫脲进行比较。（B）上述化合物对α-葡萄糖苷酶和脲酶的IC50 值。数据以均值±标准差表示（n = 3）。统计学显著性相对于相应的参考抑制剂确定（p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，p < 0.0001；ns = 无显著性差异）。请点击此处查看此图的放大版本。
图 6：化合物 8a 对牛血清白蛋白（BSA）的荧光猝灭分析。（A）在 298 K 下，随着化合物 8a 逐步加入，BSA（3.33 × 10⁻6 M）的荧光发射光谱。（B）在 298、308 和 313 K 下获得的 Stern-Volmer 图。（C）log[(F₀ − F)/F] 与 log Q 的双对数图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 7：化合物 8b 对牛血清白蛋白（BSA）的荧光猝灭分析。（A）在 298 K 下，随着化合物 8b 逐步加入，BSA（3.33 × 10⁻6 M）的荧光发射光谱。（B）在 298、308 和 313 K 下获得的 Stern–Volmer 图。（C）log[(F₀ − F)/F] 对 log Q 的双对数图。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 8：化合物 8c 对牛血清白蛋白（BSA）的荧光猝灭分析。（A）在 298 K 下，逐步加入化合物 8c 后 BSA（3.33 × 10⁻6 M）的荧光发射光谱。（B）在 298、308 和 313 K 下获得的 Stern-Volmer 图。（C）log[(F₀ − F)/F] 对 log Q 的双对数图。请点击此处查看此图的放大版本。
图9：化合物9d对牛血清白蛋白（BSA）的荧光猝灭分析。（A）在298 K下，逐步加入化合物9d后BSA（3.33 × 10⁻6 M）的荧光发射光谱。（B）在298、308和313 K下获得的Stern-Volmer图。（C）log[(F₀ − F)/F] 对 log Q 的双对数图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图10：化合物9e对牛血清白蛋白（BSA）的荧光猝灭分析。（A）在298 K下，逐步加入化合物9e后BSA（3.33 × 10⁻6 M）的荧光发射光谱。（B）在298、308和313 K下获得的Stern–Volmer图。（C）log[(F₀ − F)/F] 对 log Q 的双对数图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 11：化合物 9f 对牛血清白蛋白（BSA）的荧光猝灭分析。（A）在 298 K 下，随着逐步加入化合物 9f 后 BSA（3.33 × 10⁻6 M）的荧光发射光谱。（B）在 298、308 和 313 K 下获得的 Stern-Volmer 图。（C）log[(F₀ − F)/F] 对 log[Q] 的双对数图。请点击此处查看此图的高清版本。
图 12：参考抑制剂及选定合成化合物在α-葡萄糖苷酶和脲酶活性位点中的结合模式。 （A）阿卡波糖在α-葡萄糖苷酶活性位点中的结合构象。（B）化合物 8a 的结合构象。（C）化合物 8c 的结合构象。（D）化合物 9e 的结合构象。（E）硫脲在脲酶活性位点中的结合构象。（F）化合物 8a 的结合构象。（G）化合物 8c 的结合构象。（H）化合物 9e 的结合构象。氢键以黄色虚线表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 13：参考抑制剂的前线分子轨道与分子静电势（MEP）图谱。 （A）阿卡波糖。（B）硫脲。图中展示了最高占据分子轨道（HOMO）、最低未占据分子轨道（LUMO）以及 MEP 表面。请点击此处查看该图的放大版本。
图14：三唑类衍生物的前线分子轨道与分子静电势（MEP）图。（A）化合物 8a。（B）化合物 8b。（C）化合物 8c。每种化合物的 HOMO、LUMO 和 MEP 表面图均已展示。请点击此处查看该图的高清版本。
图 15：噁二唑衍生物的前线分子轨道与分子静电势（MEP）图。 （A）化合物 9d。（B）化合物 9e。（C）化合物 9f。每种化合物的 HOMO、LUMO 和 MEP 表面均被展示。请点击此处查看该图的放大版本。
| 代码 | 脲酶 | α-葡萄糖苷酶 | ||
| 在 0.5 mM 时的抑制率 (%) | IC50 (µM) | 在 0.5 mM 时的抑制率 (%) | IC50 (µM) | |
| 3 | 67.54 ± 1.03 | 41.51 ± 0.01 | 63.09 ± 0.25 | 79.12 ± 0.43 |
| 4 | 62.51 ± 0.42 | 45.14 ± 0.14 | 65.26 ± 0.55 | 70.28 ± 0.42 |
| 8a | 95.22 ± 1.55 | 12.25 ± 0.42 | 95.01 ± 0.57 | 33.15±0.07 |
| 8b | 62.64 ± 1.01 | 82.15 ±1.48 | 38.02 ± 1.71 | 108.19 ± 0.18 |
| 8c | 99.39 ± 0.27 | 06.14 ± 1.06 | 90.51 ± 0.01 | 40.93 ± 0.59 |
| 9d | 47.51 ± 1.01 | 103.05 ± 0.54 | 39.08 ± 0.25 | 108.10 ± 0.03 |
| 9e | 98.57 ± 0.04 | 08.14 ± 0.71 | 91.55 ± 0.34 | 27.29 ± 0.41 |
| 9f | 58.07 ± 1.68 | 85.15 ± 0.12 | 43.15 ± 0.42 | 94.44 ± 0.25 |
| Thiourea | 96.24 ± 0.16 | 21.25 ± 0.15 | - | - |
| Acarbose | - | - | 92.23 ± 0.14 | 38.25 ± 0.12 |
表1：合成化合物对α-葡萄糖苷酶和脲酶的抑制活性。 化合物8(a–c)和9(d–f)与参照抑制剂阿卡波糖和硫脲相比的IC50值及抑制百分比。数据表示为均值±标准差（n = 3）。缩写：IC50 = 半数最大抑制浓度；SD = 标准差。
| 化合物 | 298K | 308K | 313K | ||||||
| N | Kb (M-1) | ΔG | ΔH | ΔS (J/mol.K) | N | Kb (M-1) | N | Kb (M-1) | |
| (kJ/mol) | (kJ/mol) | ||||||||
| 8a | 1.28 | 3.92 x105 | -32.55 | -218.28 | -623.24 | 1.12 | 6.49 x104 | 0.85 | 4.33 x103 |
| 8b | 1.31 | 6.49 x105 | -34.24 | -306.6 | -913.96 | 1.1 | 6.95 x104 | 0.66 | 1.07 x103 |
| 9d | 1.47 | 2.41 x106 | -36.32 | -204.1 | -563.01 | 1.17 | 1.44 x105 | 1.04 | 4.84 x104 |
| 9e | 0.62 | 6.78 x101 | -10.32 | 243.16 | 850.61 | 0.81 | 1.32 x103 | 0.91 | 7.93 x103 |
| 9f | 1.11 | 4.69 x104 | -26.35 | 178.13 | 686.21 | 1.26 | 2.99 x105 | 1.41 | 1.67 x106 |
| 8c | 0.91 | 1.54 x104 | -23.98 | 341.31 | 1225.82 | 1.36 | 1.53 x105 | 1.6 | 1.10 x107 |
表2：选定化合物与牛血清白蛋白（BSA）相互作用的结合常数及热力学参数。 化合物8a、8c和9e在298、308和313 K温度下测定的结合常数（Kb）、结合位点数（n）、Stern-Volmer 淬灭常数（Ksv）、双分子淬灭速率常数（Kq）、吉布斯自由能（ΔG）、焓变（ΔH）和熵变（ΔS）。缩写：BSA = bovine serum albumin；Kb = binding constant；n = number of binding sites；Ksv = Stern–Volmer quenching constant；Kq = bimolecular quenching rate constant；ΔG = Gibbs free energy；ΔH = enthalpy change；ΔS = entropy change。
| 化合物 | α-葡萄糖苷酶 (kcal/mol) | 脲酶 (kcal/mol) |
| Acarbose | −6.90 | - |
| Thiourea | - | −5.80 |
| 3 | −4.35 | −4.50 |
| 4 | −4.10 | −4.30 |
| 8a | −7.165 | −7.624 |
| 8b | −5.20 | −5.45 |
| 8c | −6.80 | −7.10 |
| 9d | −5.10 | −5.35 |
| 9e | −6.70 | −7.30 |
| 9f | −5.00 | −5.25 |
表3：合成化合物对α-葡萄糖苷酶和脲酶的分子对接得分。 化合物8(a–c)和9(d–f)以及参考抑制剂阿卡波糖和硫脲对α-葡萄糖苷酶和脲酶的对接得分（kcal/mol）。缩写：kcal/mol = 千卡每摩尔。
| 配体 | 偶极矩（德拜） | 同源 | LUMO | 能量 | 电离 | 电子亲和能（eV） | 电泳- 负性 χ (eV) | 电泳- 化学势 μ (eV) | 硬度 η (eV) | 柔软度 | 电泳- 亲性 |
| (任意单位) | (任意单位) | 能隙（ΔE间隙) | 电势（eV） | S (eV) | ω (eV) | ||||||
| 阿卡波糖 | 8.1124 | -0.1597 | -0.0336 | 0.12612 | 4.345 | 0.913 | 2.629 | -2.629 | 1.716 | 0.291 | 2.015 |
| 硫脲 | 7.619 | -0.2193 | -0.0179 | 0.20135 | 5.967 | 0.488 | 3.228 | -3.228 | 2.739 | 0.182 | 1.903 |
| 8a | 8.8025 | -0.2044 | -0.0466 | 0.15788 | 5.566 | 1.266 | 3.416 | -3.416 | 2.15 | 0.233 | 2.71 |
| 8b | 8.2451 | -0.2033 | -0.0467 | 0.15659 | 5.534 | 1.27 | 3.402 | -3.402 | 2.132 | 0.234 | 2.72 |
| 8c | 8.319 | -0.2039 | -0.0555 | 0.14831 | 5.55 | 1.511 | 3.53 | -3.53 | 2.02 | 0.247 | 3.08 |
| 9d | 3.8264 | -0.2065 | -0.0621 | 0.14432 | 5.619 | 1.691 | 3.655 | -3.655 | 1.964 | 0.255 | 3.4 |
| 9e | 4.0969 | -0.2052 | -0.0621 | 0.14302 | 5.584 | 1.691 | 3.637 | -3.637 | 1.947 | 0.257 | 3.4 |
| 9f | 4.298 | -0.2059 | -0.0627 | 0.14324 | 5.604 | 1.704 | 3.654 | -3.654 | 1.95 | 0.256 | 3.42 |
表4：合成化合物的密度泛函理论（DFT）描述符。 化合物8(a–c)和9(d–f)的计算量子化学描述符，以及参考化合物阿卡波糖和硫脲，包括HOMO和LUMO能量、HOMO–LUMO能隙（ΔE）、电离势（IP）、电子亲和能（EA）、电负性（χ）、化学势（µ）、化学硬度（η）、化学软度（S）、偶极矩（D）和亲电性指数（ω）。缩写：DFT = 密度泛函理论；HOMO = 最高占据分子轨道；LUMO = 最低未占据分子轨道；ΔE = HOMO–LUMO能隙；IP = 电离势；EA = 电子亲和能；χ = 电负性；µ = 化学势；η = 化学硬度；S = 化学软度；D = 偶极矩；ω = 亲电性指数。
| 化合物 | HA | RB | HBA | HBD | TPSA (Ų) | iLOGP | Consensus LogP | 胃肠道吸收 | 血脑屏障通透性 | Lipinski 违反项 | 生物利用度评分 | 合成可及性评分 |
| 8a | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.86 | 4.41 | 4.71 | 高 | 否 | 1 | 0.55 | 6.32 |
| 8b | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.06 | 4.41 | 4.62 | 高 | 否 | 1 | 0.55 | 6.34 |
| 8c | 30 | 7 | 5 | 4 | 84.26 | 4.41 | 4.11 | 高 | 否 | 1 | 0.55 | 6.39 |
| 9d | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.95 | 3.08 | 2.75 | 高 | 否 | 0 | 0.55 | 5.71 |
| 9e | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.82 | 3.08 | 2.27 | 高 | 否 | 0 | 0.55 | 5.7 |
| 9f | 24 | 6 | 5 | 4 | 90.85 | 3.08 | 2.77 | 高 | 否 | 0 | 0.55 | 5.73 |
表5：合成化合物的预测吸收、分布、代谢和排泄（ADME）性质。 化合物8(a–c)和9(d–f)的预测理化性质、药代动力学性质及类药性性质通过SwissADME网络服务器生成。缩写：ADME = 吸收、分布、代谢和排泄；MW = 分子量；LogP = 辛醇/水分配系数；TPSA = 拓扑极性表面积；RB = 可旋转键；HBA = 氢键受体；HBD = 氢键供体；GI = 胃肠道；BBB = 血脑屏障；SA = 合成可及性。
补充图1：通过原生配体重新对接进行对接验证。 (Aα-葡萄糖苷酶（PDB ID: 5NN8）活性位点内共结晶配体（参考构象）与重新对接的阿卡波糖在结合位点的重叠，显示其结合构象高度一致。 (B硫脲在脲酶活性位点中的结合构象（PDB ID: 4H9M），用于脲酶体系对接验证，显示催化口袋内关键相互作用得以保留。请点击此处下载该文件。
补充文件1：化合物3、4、8(a–c)和9(d–f)的理化表征数据及完整的1H和13C核磁共振谱图。请点击此处下载该文件。
讨论
本研究合成了一系列基于三唑和噁二唑的乙酰胺衍生物，并对其结构、生物学、计算及药代动力学性质进行了评价。通过高分辨质谱（HRMS）、元素分析、1H NMR 和 13C NMR 进行光谱表征，确认了目标分子的成功合成。观测到的化学位移、耦合模式及碳共振信号与所提出的结构一致。特征性的酰胺 NH 信号、亚甲基共振信号、芳香质子分布以及季碳信号进一步证实了取代乙酰胺基团已成功引入三唑和噁二唑骨架中。这些衍生物普遍获得较高的合成产率，表明该合成路线高效，且提示这些杂环骨架易于进行进一步的结构修饰。
取代基模式对脲酶抑制活性具有明显影响。带有2,6-二甲基取代基的化合物8c表现出最高的脲酶抑制活性，其次为化合物8a（2,3-二甲基）和9e（2,5-二甲基），表明这些分子是颇具前景的先导候选物。在α-葡萄糖苷酶抑制方面也观察到类似趋势，其中化合物9e表现出最强的抑制作用，而化合物8a和8c也显示出显著的活性。由于化合物8a与8c仅在芳环上甲基取代基的位置不同，而化合物9e在取代模式和杂环骨架结构上均有所不同，这些结果提示，在该系列化合物中，甲基取代模式和骨架结构均对生物活性有贡献。化合物8c的较高活性可能反映了其在酶活性位点内更优的取向，而化合物9e的强活性则提示了噁二唑骨架与2,5-二甲基取代模式的协同作用。这些观察结果与先前报道一致，即苯基取代所产生的空间位阻效应可影响基于三唑和噁二唑的酶抑制剂与活性位点的结合24,25,26,27。然而，要建立明确的构效关系，仍需对更大系列的区域异构体衍生物进行评估。
通过荧光猝灭和热力学分析研究最活跃化合物与牛血清白蛋白（BSA）之间的相互作用表明，化合物 8a 和 9e 遵循混合静态/动态猝灭机制，而化合物 8c 主要表现为静态猝灭。热力学参数显示，化合物 8a 与 BSA 的结合主要由氢键和范德华力驱动，而化合物 8c 和 9e 的结合则以疏水相互作用为主。化合物 8a 对 BSA 具有最强的亲和力，其结合常数为 3.92 × 105 M⁻1，且结合的吉布斯自由能为有利的负值。这些结果表明可形成稳定的蛋白-配体复合物，并提示在生理条件下可能存在白蛋白介导的转运潜力。
实验结果进一步得到了分子对接研究的支持，表明化合物8a、8c和9e在α-葡萄糖苷酶和脲酶的活性位点内均采取了有利的结合构象。这些化合物与关键残基形成了氢键，其中在α-葡萄糖苷酶中包括D282、A284、D404、R600、D616和H674，在脲酶中包括A636、Q635、R439和A440。此前已有文献报道，结构类似的酶抑制剂可产生相似的相互作用。28,29对接评分与实验活性之间的最大差异出现在化合物 8a 上，该化合物对 α-葡萄糖苷酶表现出最有利的对接评分（−7.165 kcal/mol），而化合物 9e 表现出最大的差异 体外 抑制效力（IC50 = 27.29 µM）。这一差异并不意外，因为对接评分仅在相对刚性的蛋白质结构中估算配体结合，未考虑配体溶解度、构象柔性、去溶剂化、蛋白质动力学或其他影响实验测得IC值的溶液相效应等因素。50 因此，预测结合亲和力与实测生物活性之间的差异是分子对接方法本身公认的局限性，而非计算结果与实验结果之间的矛盾。总体而言，对接分析与酶抑制实验数据一致表明，化合物8a、8c和9e是该系列中最具有潜力的衍生物。
通过前线分子轨道（FMO）和分子静电势（MEP）分析，进一步研究了活性最强化合物的电子性质。HOMO–LUMO能隙较小的化合物通常表现出更高的电子反应活性，这与先前对结构相关的三唑和噁二唑类衍生物进行的DFT研究结果一致30。在所合成的化合物中，8a、8c和9e表现出相对较小的HOMO–LUMO能隙，表明其具有良好的电子转移特性。它们的MEP图谱显示出明显的富电子区和缺电子区，其中化合物8c和9e表现出尤为显著的亲核区域，这可能有助于其与酶的有利相互作用及生物活性。全局反应性描述符进一步支持了实验与计算结果。化合物9e表现出理想的电离势、电子亲和能、柔软度及亲电性指数的组合，而化合物8a和8c则显示出相对较高的柔软度值，与其较强的抑制活性相符。9系列化合物（尤其是9e）所表现出的更高亲电性和柔软度，可能有助于其与催化残基产生更强的相互作用，并增强其生物活性。
对化合物 8(a–c) 和 9(d–f) 进行的in silico ADME 分析预测其具有良好的药代动力学特性，包括高胃肠道吸收率、可接受的类药性以及满意的口服生物利用度。在评估的参数范围内未发现主要的 ADME 缺陷。综合来看，in vitro 生物学数据、BSA 结合分析、分子对接、DFT 计算以及in silico ADME 预测结果均支持进一步研究这些基于三唑和噁二唑的乙酰胺衍生物作为双重脲酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力。
综上所述，这些研究结果表明化合物 8a、8c 和 9e 是开发靶向脲酶和 α-葡萄糖苷酶的三唑类和噁二唑类乙酰胺衍生物的有前景的先导候选物。综合光谱学、生物学、BSA 结合、分子对接、DFT 及 ADME 数据为后续研究奠定了坚实基础。未来的研究应包括分子动力学模拟以评估蛋白–配体随时间推移的稳定性，酶动力学研究以确定抑制机制，以及将 BSA 结合分析扩展至其余衍生物。最后，还需开展 in vivo 研究，以验证这些有前景的 in vitro 和 in silico 结果，并进一步评估该类化合物的治疗潜力。
披露
作者声明不存在利益冲突
致谢
作者谨向沙特阿拉伯阿勒拜大学临床药学系表示感谢。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-萘胺 | Merck | 106148 | 用于制备取代类似物的芳香胺 |
| 2,5-二甲基苯胺 | Sigma-Aldrich | D146706 | 用于合成取代衍生物的芳香胺 |
| 3,4-二甲基苯胺 | Alfa Aesar | A15416 | 用于制备结构类似物的芳香胺 |
| 苯甲酸 | Sigma-Aldrich | 242381 | 合成苯甲酰肼中间体的起始原料 |
| 溴乙酰溴 | Sigma-Aldrich | B17601 | 用于合成溴乙酰胺中间体的亲电试剂 |
| 二硫化碳 | Sigma-Aldrich | 289116 | 环化生成噁二唑环体系的关键试剂 |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | C2432 | 用于萃取和纯化过程的溶剂 |
| 二甲基甲酰胺（DMF） | Sigma-Aldrich | 227056 | 用于衍生化和取代反应的极性非质子溶剂 |
| 二苯胺 | Sigma-Aldrich | D23802 | 用于合成衍生物化合物的芳香胺 |
| Epik (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (软件) | 用于在 pH 7.0 条件下生成配体电离状态；RRID: N/A |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | 酯化反应和酰肼形成的反应溶剂 |
| 乙酸乙酯 | Sigma-Aldrich | 270989 | TLC 分析和萃取中的极性流动相组分 |
| Gaussian 09, Revision D.01 (Gaussian 09W) | Gaussian, Inc. | N/A (软件) | 用于 DFT 计算（HOMO-LUMO、MESP、全局反应性描述符）的软件；RRID:SCR_014897 |
| GaussView 5 | Gaussian, Inc., Wallingford, CT, USA | N/A (软件) | 用于优化结构和轨道能级的可视化；RRID: N/A |
| Glide (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (软件) | 用于受体网格生成和高精度（XP）分子对接的对接软件；RRID:SCR_000187 |
| GraphPad Prism, 版本 9 | GraphPad Software, Boston, MA, USA | N/A (软件) | 用于 IC50 回归分析及酶抑制数据的统计评估；RRID:SCR_002798 |
| 肼 | Sigma-Aldrich | 225819 | 用于将酯转化为苯甲酰肼的试剂 |
| L(+)-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G3126 | 用于生物学评价研究的试剂 |
| LigPrep (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (软件) | 用于配体结构优化和三维构象体生成；RRID:SCR_016746 |
| 氢化锂 | Sigma-Aldrich | 201049 | 用于取代反应中巯基活化的催化剂 |
| Maestro (v13.2, Schrödinger Release 2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (软件) | 用于蛋白质/配体结构准备和可视化的分子建模套件；RRID:SCR_016748 |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860 | 用于纯化和生物学检测样品制备的溶剂 |
| 正己烷 | Merck | 104391 | TLC 分析中的非极性流动相组分 |
| OPLS-2005 / OPLS-AA | Schrödinger, LLC | N/A (力场) | 用于蛋白质和配体结构能量最小化的力场；RRID: N/A |
| 苯基异硫氰酸酯 | Merck | 807028 | 用于合成三唑衍生物的试剂 |
| Protein Preparation Wizard (2022-1) | Schrödinger, LLC | N/A (软件) | 用于对接前受体结构的精修；RRID:SCR_016749 |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 221465 | 用于调节 pH 值和反应中和的碱 |
| 硫酸 | BDH | 10276 | 回流条件下酯化步骤中使用的酸催化剂 |
| 三甲胺 | Riedel-de Haen | 22129 | 合成取代衍生物过程中使用的有机碱 |
| VESTA, 版本 3.5.8 | Momma & Izumi (开发者)；免费分发 | N/A (软件) | 用于分子静电势（MESP）和 HOMO-LUMO 表面图的可视化；RRID: N/A |
参考文献
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