评估细胞穿透肽在小鼠肺部的转导效率与细胞靶向性

摘要

本方案描述了一种整合性工作流程，用于评估穿膜肽的转导效率和细胞特异性，以靶向肺部的环化R11A肽（cR11A；KAPWHLSSQYSAT）为例。该工作流程结合了配对分选流式细胞术与单细胞RNA测序、AT2报告小鼠中的流式细胞术分析，以及共聚焦z轴层扫成像，以验证肽段与AT2细胞相关靶点的结合。

摘要

细胞穿透肽（CPPs）是一类短肽（5–30个氨基酸），能够穿过细胞膜并递送大分子货物，无需转染试剂。然而，其定义 体内 细胞选择性需在细胞类型水平上进行验证。本文介绍了一种整合性工作流程，用于评估经眼眶后静脉注射后，Cy5.5标记的环化细胞穿透肽cR11A在小鼠肺泡上皮Ⅱ型（AT2）细胞中的转导效率。注射后15分钟或60分钟处死小鼠并取肺组织，采用多种互补检测方法进行分析，包括配对分选的荧光激活细胞分选（FACS），分离Cy5.5⁺与Cy5.5⁻肺单细胞悬液，随后进行单细胞RNA测序，以及来自Sftpc-CreERT2小鼠的肺单细胞流式细胞术分析。^(+/−);LSL-GFP^(+/−) AT2 报告基因小鼠用于量化 GFP⁺/Cy5.5⁺ 事件，以及通过共聚焦 z 轴层扫成像肺冷冻切片，以确认 cR11A-Cy5.5 与 AT2 相关信号的共定位。该方案利用多种互补的检测方法，获得细胞类型特异性结合的一致性证据，并为评估穿膜肽的细胞特异性靶向性提供了可重复的实验框架，可根据不同靶器官进行相应修改。

引言

细胞穿膜肽（CPPs）是一类由5–30个氨基酸组成的短肽，能够穿越细胞膜，以完整且完全功能化的形式促进大分子货物进入细胞内，无需使用转染试剂。^1,2先前使用 体外 和 体内 噬菌体展示组合方法鉴定出一种12个氨基酸的心脏靶向肽（APWHLSSQYSRT），该肽可在短至5分钟内被心肌细胞特异性摄取^3,4为了研究其转导机制，进行了丙氨酸扫描，结果发现了两种意外表现出肺部富集的变异体 S7A 和 R11A（APWHLSSQYSAT）。 体内 因此被称为肺靶向肽（LTPs）⁵此外，N端添加赖氨酸并进行首尾环化，生成了一种环状形式的R11A（cR11A），其血清稳定性显著提高，细胞内摄取能力也明显优于线性对应物。⁵.

LTPs 有望将治疗药物精确递送至远端肺上皮细胞群，包括肺泡上皮 II 型（AT2）细胞。这些细胞对于维持表面活性物质稳态至关重要，并作为肺泡再生的前体细胞⁶。然而，LTPs 开发中的一个主要挑战在于对体内 细胞选择性的严格评估。仅依靠器官水平的生物分布分析无法区分真正的细胞转导信号与血管信号、细胞外滞留或吞噬清除效应，因此必须结合单细胞分辨率的检测手段进行补充⁷。为克服这一局限性，本实验流程整合了单细胞转录组学分型、基于报告基因的流式细胞术以及共聚焦 z 轴层扫成像，以在细胞类型水平上提供肽段靶向作用的证据，超越传统的器官水平荧光或生物分布读数^8,9。

本方案的总体目标是提供一种可重复、多读数的实验流程，用于验证 体内 远端肺中Cy5.5标记的cR11A的转导效率及细胞特异性，重点关注经眶后注射后AT2细胞中的表现。该方案通过互补且独立的检测手段定义与肽段相关的细胞身份，包括配对分选的荧光激活细胞分选（FACS）（Cy5.5⁺ 与 Cy5.5⁻）随后进行单细胞RNA测序以绘制与肽段相关细胞群体的图谱，以及在AT2报告基因肺中进行定量摄取评估 通过 流式细胞术及肺冷冻切片的共聚焦z轴层扫成像，以确认cR11A-Cy5.5与AT2细胞相关信号的共定位。该方案可轻松适用于其他肺靶向肽（LTPs）或递送载体，并可用于肺组织或其他器官系统，以评估正在开发的穿膜肽（CPPs）的细胞特异性。该方法特别适用于需要在细胞类型水平上验证CPP靶向性的研究应用 体内 而不仅仅是器官水平的累积评估。

方案

所有动物实验均遵循梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南，并在协议编号 A00006842-22-R25 下获得批准。所有努力均旨在尽量减少动物痛苦，并确保符合相关的国家和机构法规的伦理操作。本方案所用的研究工具列于材料表中。

1. 动物

1. 使用来自杰克逊实验室（The Jackson Laboratory，品系编号 #000664）的成年雌雄混合C57BL/6J小鼠（6–8周龄）。
2. 对于AT2细胞特异性定量，使用Sftpc-CreERT2^(+/+) （Jax 品系 #028054）与 LSL-GFP 杂交^(+/+) （杰克逊实验室品系 #007906）以生成 Sftpc-CreERT2^(+/−)；LSL-GFP^(+/−) AT2报告基因小鼠
3. 个体通风笼具中的家鼠。确保所有动物实验方案均已获得机构动物护理和使用委员会的批准。
4. 在 Sftpc-CreERT2 小鼠中进行他莫昔芬诱导^(+/−)；LSL-GFP^(+/−) 小鼠。当小鼠≥6周龄时，给予每千克体重100 mg的他莫昔芬，溶于玉米油中 通过 连续7天给予3次灌胃给药。末次给药后至少2周再进行实验，以确保达到最大重组效率。

2. 试剂与仪器准备

1. 配制麻醉剂（氯胺酮/甲苯噻嗪工作混合液）。
   1.  配制5 mL工作液：氯胺酮（1 mL，50 mg/mL）、赛拉嗪（50 µ100 mg/mL 的 L 溶液（3.95 mL）和无菌生理盐水（3.95 mL）。
   2.  注射1 µ克/千克体重 通过。腹腔注射（最终剂量：10 mg/kg 氯胺酮和 1 mg/kg 赛拉嗪）。
2. 制备多肽（cR11A-Cy5.5）。
   1. 获取细胞穿膜肽（CPPs）的冻干粉末。将粉末于 −20 °C 保存。 °C，可保存长达2年，或以DMSO配制的储备液于−80℃保存 °在避光试管中于 -20°C 保存，最长可保存 6 个月。避免冻融循环，并尽量减少光照暴露。用 DMSO 配制 10 mM 的 cR11A-Cy5.5 储存液。
   2. 称量小鼠体重，计算剂量，并用无核酸酶水将储备液稀释至终浓度为1 mg/kg，终体积为100 μL。 µ每只小鼠 L
3. 制备消化缓冲液（现配；置于冰上）。
   1. 配制含有2 mg/mL Dispase II、0.1 mg/mL DNase I、DMEM/F12和1%（v/v）青霉素-链霉素的消化缓冲液。
   2. 每只小鼠使用 3 mL。
4. 配制非特异性蛋白酶洗涤缓冲液（置于冰上）。
   1. 含 0.05 mg/mL DNase I 和 1% (v/v) 青霉素-链霉素的 DMEM/F12
   2. 每只小鼠使用 10 mL。
5. 配制红细胞裂解缓冲液（置于冰上）。
   1. 稀释10× 裂解缓冲液至1× 用 PBS 洗涤。
   2. 每份样品使用 2 mL。
6. 配制灌注缓冲液。
   1. 使用预冷的 DMEM/F12（每只小鼠 10 mL）。
7. 配制洗涤缓冲液。
   1. 使用含 2% FBS 的 DMEM/F12 培养基。
8. 将离心机预冷至4 °C.

3. 经眶后注射cR11A-Cy5.5

1. 使用氯胺酮/赛拉嗪工作液对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏后无肢体回缩反应确认麻醉效果充分。
2. 注射100 µcR11A-Cy5.5（1 mg/kg）的L 通过 使用胰岛素注射器进行眶后静脉注射。
3. 启动计时器，将小鼠置于加热垫上，在适当监测下维持15或60分钟。

4. 肺组织的收获与灌注

1. 根据批准的方案对小鼠实施安乐死（例如，二氧化碳吸入后行颈椎脱位）。将小鼠置于仰卧位，并用70%乙醇喷洒胸部。
2. 打开胸腔以暴露心脏和肺脏。
3. 在右心房做一切口，以便灌注期间引流。
4. 将连接有10 mL注射器（内含冰冻DMEM/F12）的26 G针头插入右心室。在整个灌注过程中保持右心房切口开放以利于引流。
5. 手动缓慢而稳定地在约1–2分钟内注入10 mL DMEM/F12，无需使用注射泵。注射过程中保持低压，避免肺组织明显过度膨胀或心室壁渗漏。持续灌注直至肺组织变为均匀苍白。

5. 肺组织灌注与消化

1. 用20G静脉导管插管气管，并用3-0丝线缝合固定。注入1 mL消化缓冲液 通过 1 mL 注射器用于膨胀肺部。
2. 将肺组织作为一个完整的整体解剖下来，并立即转移至预冷的、置于冰上的100 mm培养皿中。
3. 分离肺叶并转移至含有2 mL冷消化缓冲液的15 mL圆锥形离心管中（每管一肺）。
4. 4°C 下孵育 °在旋转摇床（10–15 rpm）上于4°C孵育20小时。
   注：参见 Janas PP. 等人。¹⁰ 有关详细方法学。

6. 组织解离

1. 放置一个100 µ将m细胞筛置于50 mL锥形管上，并用1 mL非特异性蛋白酶酶洗缓冲液预润湿。
2. 将肺组织转移至滤网中，并使用无菌注射器推杆轻轻解离。
3. 用10 mL非特异性蛋白酶洗涤缓冲液冲洗。
4. 以130 × g离心 × 4℃下离心15分钟，转速为g °C.
5. 将沉淀重悬于 2 mL 1× 室温下用红细胞裂解缓冲液处理90秒。
6. 用10 mL洗涤缓冲液淬灭裂解。
7. 通过40 μm滤膜过滤 µm 细胞筛过滤，并用洗涤缓冲液冲洗。
8. 300 × g 离心 × g. 4℃下离心5分钟 °C.
9. 将细胞重悬于 500–1,000 µL PBS + 2% FBS（≥1 × 10⁶ 细胞/毫升
10. 通过35 µm 滤器帽放入 FACS 管中。
    注：参见 Konishi S. 等人¹¹ 有关详细方法学。

7. 配对分选组流式细胞分选

1. 使用流式细胞仪进行分选。
2. 以PBS注射小鼠的肺组织作为阴性对照，设定Cy5.5门控范围。
3. 应用标准门控策略：排除碎片、单细胞群体以及Cy5.5⁺细胞。
4. 将Cy5.5⁺和Cy5.5⁻细胞群分别分选至不同的试管中。

8. 单细胞RNA测序样本制备

1. 将分选后的样品置于冰上保存。
2. 300 × g 离心 × g. 4℃下离心5分钟 °C，并重悬于500 µL 缓冲液
3. 仅在细胞存活率≥80%时继续实验。
4. 根据需要制备文库并进行测序。

9. AT2 报告小鼠中的流式细胞术

1. 制备肺单细胞悬液，方法如所述 第5–6节
2. 使用可固定的活/死细胞染料（1:1000）染色30分钟（避光）。
3. 洗涤并在 300 × g 离心 × g. 4℃下离心5分钟 °C.
4. 过滤后将样品置于冰上保存。
5. 在流式细胞仪上获取数据。
6. 进行设门以识别细胞，选择单细胞，排除死细胞，并定义GFP和Cy5.5群体。
   1. 定量分析GFP⁺/Cy5.5⁺ GFP事件所占的百分比⁺ 细胞

10. 固定与冷冻保护

1. 用1 mL 4%多聚甲醛灌注肺部并结扎气管。
2. 在4℃下用10 mL 4% PFA固定过夜 °C.
3. 用 PBS 洗涤（3 次）×).
4. 在15%蔗糖溶液中过夜孵育。
5. 转移至30%蔗糖溶液中约48小时。

11. 包埋与冷冻切片

1. 用OCT包埋剂准备冷冻模具，将肺组织置于其中并用OCT包埋。
2. 使用液氮冷冻，于˗80 °C保存。
3. 平衡后切片至10 µm厚度，载玻片室温晾干过夜。

12. 成像与分析

1. 用 PBS 洗涤切片（3 次）×).
2. 用含DAPI的封片剂封片。
3. 获取共聚焦z轴层扫图像。
4. 使用适当的成像设置。
5. 进行三维重建。
6. 使用一致的阈值量化共定位。
   可选方法：
   这些可选方法未包含在代表性工作流程中，但可加以整合，以实现CD45阳性细胞的耗竭或分析⁺ 免疫细胞群体，该群体占肺细胞的很大比例¹².
   注意： 使用 CD45⁺ 在分析非免疫性肺细胞群体时，由于这些步骤会去除或分离免疫细胞的摄取信号并改变样本的细胞组成，因此可能导致细胞耗竭或排除。CD45染色也可用于分析CD45⁺ 免疫细胞群分别处理。

13. 耗竭 CD45⁺ 细胞群体

1. 组织解离后（步骤 6），使用与磁珠偶联的 CD45 抗体（Miltenyi Biotech 130-052-301）或与 Cy5.5、GFP 及活/死染料兼容的荧光染料偶联的 CD45 抗体（例如 CD45-BV605，BioLegend #103140），在 4°C 避光条件下染色 20 分钟。
2. 若采用 CD45 磁珠耗竭法，请按照制造商说明使用谱系耗竭（LD）柱（Miltenyi Biotech 130-042-901），并进行磁性细胞分选（MACS）（Miltenyi Biotech）。随后进行配对组分 FACS 分选（步骤 7）。
3. 若使用荧光标记抗体进行 CD45 耗竭，首先用洗涤缓冲液洗涤细胞悬液以去除过量抗体，然后进入步骤 7。在设定门控以排除双联体和碎片（步骤 7.3）后，增加一个门控以排除 CD45⁺ 细胞群，随后进入 步骤 7.4。

14. 在流式细胞术中分析 CD45⁺ 细胞群体

1. 在步骤 9.3 之后，使用与 Cy5.5、GFP 及活/死染料兼容的荧光标记 CD45 抗体进行染色，例如 CD45-BV605（BioLegend #103140），在 4°C 避光孵育 20 分钟。
2. 用洗涤缓冲液洗涤细胞悬液，以去除未结合的抗体。然后继续进行步骤 9.4。在设定门控以排除双联体和碎片（步骤 9.6）后，在进一步设门确定 GFP⁺ 和 Cy5.5⁺ 细胞群之前，增加一个门控以排除 CD45⁺ 细胞群¹²。

结果

成功应用本方案应通过三种互补的检测方法获得一致的证据：配对分数单细胞RNA测序（scRNA-seq）、基于报告基因的流式细胞术以及共聚焦z轴层扫成像。

在配对分选的单细胞RNA测序分析中，经全身给予cR11A-Cy5.5后，分别回收Cy5.5⁻和Cy5.5⁺肺组织单细胞组分并进行独立分析。UMAP可视化鉴定了主要的肺细胞群体，包括免疫、内皮、上皮和间充质细胞群（图1A，B）。尽管免疫细胞在两个分选组分中均占主导地位，但Cy5.5⁺组分显示出非免疫细胞群的相对富集，包括上皮细胞（图1C）。上皮细胞亚群分析显示，与Cy5.5⁻组分相比，Cy5.5⁺组分中AT2细胞的比例更高，而AT1细胞在两组分中均处于较低水平（图1D）。这些结果表明，配对分选的单细胞RNA测序能够识别出cR11A-Cy5.5阳性肺细胞组分中AT2细胞的富集现象。

采用流式细胞术定量报告基因定义的AT2细胞内cR11A-Cy5.5信号。代表性设门策略包括根据FSC-A/SSC-A选择总细胞、连续两次单细胞设门、活细胞设门以及最终的GFP设门 对照 Cy5.5 分析（图2A–E）。在对照样本中，GFP⁺/Cy5.5⁺ 事件极少，由此确定了背景荧光阈值。在给予 cR11A-Cy5.5 后，在此代表性数据集中，GFP⁺/Cy5.5⁺ AT2 报告基因阳性事件在注射后15分钟上升至7.99%，在60分钟时为7.41%（图2E这些结果支持在AT2报告基因阳性细胞中检测到可识别的cR11A-Cy5.5信号 体内.

共聚焦z轴层扫成像可对肺组织切片中与多肽相关的荧光信号进行空间定位验证。实验中设置了无报告分子的对照组以评估背景荧光，结果显示GFP和Cy5.5通道的信号极低。在cR11A-Cy5.5处理的AT2报告细胞肺组织中，Cy5.5荧光信号出现在GFP⁺ AT2报告阳性细胞附近，Imaris软件生成的共定位通道显示GFP与Cy5.5信号存在重叠（图3A）。代表性Imaris共定位分析显示，在给药后15分钟和60分钟时，GFP⁺ AT2细胞区域内GFP与Cy5.5信号的共定位比例分别为89.6%和86.8%（图3B）。

次优结果可能包括对照样本中较高的背景Cy5.5荧光、上皮细胞回收率低、细胞活力差，或GFP⁺/Cy5.5⁺事件分离不明显。这些问题通常提示灌注不完全、组织损伤过度、补偿不足或成像阈值不一致。

图1：配对组分单细胞RNA测序揭示cR11A-Cy5.5阳性肺组织组分中肺泡上皮细胞的富集。 在经眼后静脉注射cR11A-Cy5.5后，将肺组织单细胞悬液分选为Cy5.5⁻和Cy5.5⁺两个组分，并对每个组分进行单细胞RNA测序分析。（A）UMAP图展示了来自一只代表性小鼠的匹配组分中的细胞类型聚类。（B）UMAP叠加图显示了Cy5.5⁻和Cy5.5⁺细胞的分布情况。（A）和（B）中标记的圆形区域表示用于上皮细胞亚群分析的重点上皮细胞区室。（C）免疫细胞群体在两个组分中均占主导地位，占比均超过80%。与Cy5.5⁻组分相比，Cy5.5⁺组分中含有更高比例的内皮细胞、上皮细胞和间充质细胞群体，表明cR11A被这些细胞群体摄取。（D）在上皮细胞群体中，AT2细胞在Cy5.5⁺组分中的比例显著高于Cy5.5⁻组分，而AT1细胞在两个组分中均处于较低水平。请点击此处查看该图的放大版本。

图2流式细胞术验证AT2报告小鼠肺组织中cR11A-Cy5.5的摄取 AT2 报告基因小鼠给予 cR11A-Cy5.5 通过 眶后静脉注射，分别在注射后15分钟或60分钟采集肺组织用于单细胞制备。图中显示了PBS对照（Ctrl）和cR11A-Cy5.5处理样本的代表性设门策略：（A) 细胞通过FSC-A/SSC-A进行选选，(B, C) 通过基于散射光的双态排除法对单细胞进行门控，(D活细胞通过活性染料排除法鉴定，且（EGFP（AT2 报告基因） 与 使用Cy5.5对GFP⁺/Cy5.5⁺事件进行定量分析。在此代表性数据集中，在给予cR11A-Cy5.5后15分钟和60分钟时，GFP⁺/Cy5.5⁺的AT2事件均约为8%。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图3共聚焦成像及Imaris共定位分析cR11A-Cy5.5在AT2报告基因小鼠肺组织中的摄取 (A) 分别展示了非报告基因对照（Ctrl）和注射 cR11A-Cy5.5 后 15 分钟或 60 分钟收获的 AT2 报告基因小鼠肺组织冷冻切片的共聚焦 z 轴层扫成像代表性视野。GFP 信号（绿色）标记 AT2 细胞，cR11A-Cy5.5 荧光（红色）表示与肽相关的信号。“Coloc”图显示由 Imaris 软件判定为共定位的像素或对象（黄色），合并图像展示了两个通道之间的空间重叠。设置非报告基因对照以评估 GFP 和 Cy5.5 通道中的背景荧光。BGFP⁺ AT2 区室内的共定位定量分析显示，在15分钟和60分钟时，分别有89.6%和86.8%的GFP信号与cR11A-Cy5.5共定位。这些数据表明，在两个时间点GFP⁺ AT2细胞均表现出显著的信号重叠，支持cR11A对AT2区室的优先结合。 体内 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本方案通过多种独立的检测方法，在互补的分辨率下识别靶向特定细胞群体的肽段：转录组水平定位（配对组别单细胞RNA测序）、基于事件的定量检测（报告基因流式细胞术）以及空间定位验证（共聚焦z轴层扫成像）。这些方法共同减少了在器官水平上基于荧光或整体生物分布研究中常见的模糊性问题，例如血管荧光干扰或细胞外滞留，以及无法将与肽段相关的信号归因于特定肺部细胞群体的问题⁷。

多个步骤需要特别注意。灌注质量会显著影响背景荧光以及后续分选效果；充分的灌注表现为所有肺叶呈现均匀的象牙白色，而灌注不完全可能导致非靶向区域的Cy5.5信号升高。在组织解离过程中，采用长时间低温消化（4 °C，20 小时）而非常规消化条件（37 °C，1–2 小时），以保护上皮细胞群体并提高脆弱细胞（尤其是肺泡上皮Ⅰ型（AT1）细胞）的回收率¹⁰。由于AT1细胞具有大而薄的形态特征，对机械性消化极为敏感，因此在分离过程中容易丢失。除标准实验室操作（包括一致的消化条件、补偿设置、设门策略和阈值设定）外，三维共定位分析有助于判断肽信号是否与AT2报告基因信号重叠，而不仅仅依赖二维荧光重叠进行判断¹³。

在进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）或流式细胞术定量之前，可考虑加入CD45⁺免疫细胞耗竭步骤。免疫细胞在肺部细胞群体中占比较大，并可能在对异物颗粒的典型免疫应答过程中摄取穿膜肽（CPPs）。为了更准确地定量非免疫细胞群体（包括内皮细胞、上皮细胞和间充质细胞）中的CPP摄取情况，耗竭CD45⁺细胞可能有助于提高检测灵敏度。该步骤可通过分选前使用磁珠法耗竭CD45⁺细胞，或在流式细胞术分析过程中排除CD45⁺细胞来实现¹²。然而，该修饰应选择性使用，因其会去除免疫细胞的摄取信息，并改变待分析样本的细胞组成。

应考虑本实验流程的若干局限性。Cy5.5 荧光可识别与多肽相关的信号，但其本身无法区分内化多肽与细胞膜结合或细胞周信号。配对组分的单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）也受到组织解离、细胞回收率、分选阈值以及每种肺细胞群体相对丰度的影响。因此，某些稀有细胞群体（如基底细胞或离子细胞）可能被低估或遗漏。报告基因小鼠的流式细胞术可提供更可靠的细胞类型鉴定，但需要合适的报告基因小鼠品系或经过验证的抗体组合。此外，在成像实验中，使用报告基因小鼠设置溶剂对照组有助于更准确地界定 GFP⁺ AT2 细胞内的背景共定位信号。因此，结果解读应基于单细胞 RNA 测序、流式细胞术和共聚焦成像等多种方法的一致性证据，而非依赖单一检测结果。

该工作流程具有模块化特点，可适用于其他荧光染料、报告小鼠品系、给药方案或组织采集时间点。对于开发更多细胞或器官特异性穿膜肽（CPP）的研究，可对配对分组单细胞RNA测序（scRNA-seq）设计进行修改后应用于其他器官（如肝脏、肾脏或脑组织）。本方案提供了一种高效方法，可在同一只动物的单一器官内比较与肽相关的细胞群体，从而提高结果的可解释性并减少个体间差异。未来应用包括筛选更多穿膜肽、测试穿膜肽-货物偶联物、比较线性与环状肽的设计，以及将该工作流程应用于组织结构或靶细胞丰度发生改变的疾病模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗小鼠 CD45-BV605 抗体	BioLegend	103140	用于鉴定或排除 CD45+ 细胞
C57BL/6J 小鼠	The Jackson Laboratory	品系 #000664	用于实验的野生型小鼠
小鼠 CD45 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-301	用于磁性去除 CD45+ 细胞
细胞计数仪	Invitrogen	Countess 3; AMQAX2000	自动细胞计数
CO2 培养箱	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i; TSH160IDS	细胞培养
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 980; 1872-551	用于获取 z-stack 图像
cR11A-Cy5.5 肽	Mayo Clinic 蛋白质组学核心	定制合成；无目录号	荧光标记的细胞穿透肽，用于体内递送
冷冻切片机	Leica Biosystems	Leica CM1950	用于组织切片
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693-1G	用于肺组织消化的酶
DMEM/F12	Gibco	11330-032	细胞解离和洗涤缓冲液
DNase I	Roche	10104159001	减少 DNA 介导的细胞聚集
FACS 细胞分选仪	BD Biosciences	BD FACSAria II，4 激光系统	用于分选 Cy5.5+ 和 Cy5.5- 细胞
FBS	Gibco	A52567-01	添加至缓冲液以提高细胞活力
FlowJo 软件	FlowJo	版本 10.10.0	流式细胞术数据分析
GraphPad Prism 软件	GraphPad Software	版本 10	统计分析与绘图
Imaris 软件	Oxford Instruments	版本 9.9.1	三维可视化与共定位分析
恒温振荡培养摇床	Thermo Scientific	Solaris; 01-258-086	用于组织消化
氯胺酮	WestWard (Hikma)	NDC 0143-9508-01
LD 柱	Miltenyi Biotec	130-042-901	用于磁性细胞分离（MACS）
LD 柱	Miltenyi Biotec	130-042-901
活/死可固定黄色死细胞染色试剂盒	Invitrogen	L34968	用于流式细胞术中的活力染色
活/死可固定黄色死细胞染色试剂盒	Invitrogen	L34968
LSL-GFP 报告小鼠	The Jackson Laboratory	品系 #007906	Cre 诱导型 GFP 报告小鼠品系
LSL-GFP 报告小鼠	The Jackson Laboratory	品系 #007906
微量离心机	Eppendorf	EPP-5427R	样品离心
微量离心机	Eppendorf	EPP-5427R
含 DAPI 的封片剂	Abcam	AB104139	成像时的核复染剂
含 DAPI 的封片剂	Abcam	AB104139
无核酸酶水	Qiagen	175034992
口服灌胃针	Braintree Scientific	N-PK 020
PBS	Gibco	10010-023	通用洗涤缓冲液
PBS	Gibco	10010-023
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	防止细菌污染
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
冷冻离心机	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R	在受控温度下进行细胞沉淀
冷冻离心机	Thermo Scientific	ST16R; TSST16R
生理盐水	Baxter	2F7124
Sftpc-CreERT2 小鼠	The Jackson Laboratory	品系 #028054	AT2 细胞特异性的可诱导 Cre 品系
Sftpc-CreERT2 小鼠	The Jackson Laboratory	品系 #028054
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 报告小鼠	实验室内部繁育	通过将 Sftpc-CreERT2(+/+) 小鼠与 LSL-GFP(+/+) 小鼠杂交获得	用于 AT2 细胞特异性的 GFP 标记
Sftpc-CreERT2(+/−);LSL-GFP(+/−) AT2 报告小鼠	实验室内部繁育	通过将 Sftpc-CreERT2(+/+) 小鼠与 LSL-GFP(+/+) 小鼠杂交获得
丝线缝合线	Look	SP117
单细胞 RNA 测序服务	Mayo Clinic 基因组分析核心	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services	文库构建与测序
单细胞 RNA 测序服务	Mayo Clinic 基因组分析核心	https://www.mayo.edu/research/core-resources/genome-analysis-core/services
他莫昔芬	Sigma-Aldrich	T5648
水浴培养箱	Fisherbrand	Isotemp GPD 28	温度控制培养
水浴培养箱	Fisherbrand	Isotemp GPD 28
赛拉嗪（Rompun）	Dechra	NADA #047-956