肺纤维化雪貂模型中肺实质和气道重塑的定量微计算机断层扫描分析

摘要

本文介绍了一种利用微型计算机断层扫描（micro-CT）对雪貂模型中博来霉素诱导的肺纤维化特征进行定量评估的实验方案。该雪貂模型在理解肺纤维化机制及测试新疗法方面具有较强的转化研究潜力。

摘要

肺纤维化（PF）是一种慢性进行性肺部疾病，其特征是肺泡反复损伤，导致肺实质增厚、瘢痕形成以及呼吸功能受损。目前常用的啮齿类动物模型，尤其是使用博来霉素（BLEO）建立的模型，由于解剖学差异（例如缺乏呼吸性细支气管），在向人类特发性肺纤维化（IPF）转化方面的相关性有限。为克服这一局限性，我们建立了一种雪貂的肺纤维化大动物模型，因为雪貂具有与人类相似的呼吸性细支气管。将3月龄的野生型雪貂经气管灌注博来霉素（BLEO），在处理后8周处死并获取肺组织，用于显微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学评估。由于多排探测器CT（MDCT）在显示雪貂小气道时空间分辨率有限，因此对离体肺组织在受控气道压力（0 cmH₂O 和 25 cmH₂O）下进行ex vivo显微CT扫描，以模拟呼气和吸气状态。

显微CT成像揭示了正常雪貂肺组织与博来霉素（BLEO）处理后肺组织之间明显的结构差异。正常肺组织表现出低衰减信号并保持完整的结构架构，而BLEO处理后的肺组织则显示出明显增强的衰减信号，符合纤维化的特征。图像中可见人类纤维化肺部疾病的典型特征，包括蜂窝状改变伴囊性空腔、增厚的肺小叶间隔以及提示早期纤维化或炎症性改变的磨玻璃样密度影。通过定量显微CT分析发现，在施加的两种气道压力下，BLEO处理组雪貂肺组织的气道径向扩张程度、纵向拉伸程度以及容积变化均显著降低。此外，基于气道代数匹配的分析显示，在肉眼可见纤维化的区域，气道壁显著增厚。组织学评估（包括Masson三色染色）进一步证实了广泛的胶原沉积和纤维化病变。

本研究表明，经BLEO处理的雪貂会出现类似人类肺纤维化的影像学、力学及组织病理学特征。此外，微型CT可对纤维化分布、气道动态变化及肺容积改变进行高分辨率评估。这些发现凸显了雪貂作为转化模型在研究肺纤维化发病机制及评价新型治疗策略方面的潜力。

引言

肺纤维化（PF）是一种慢性进行性间质性肺疾病，其特征是肺泡反复损伤导致肺实质增厚、纤维化以及进行性呼吸功能障碍¹。肺纤维化可由多种因素诱发，包括药物、环境毒素、感染、潜在的自身免疫性疾病，或为特发性¹。尽管已开发出一些药物用于延缓疾病进展，尤其是针对特发性肺纤维化（IPF）患者，但肺纤维化仍无法治愈，诊断后的生存期仅为3至5年^1,2。在大多数情况下，唯一确定有效的治疗手段是肺移植；因此，迫切需要开发新的、更有效的治疗方案。

博来霉素是一种常用于人类恶性肿瘤治疗的药物；然而，其应用受到肺毒性的限制，这种肺毒性可迅速进展为肺纤维化³。在发现这一副作用后，博来霉素被用于科学研究，以建立肺纤维化的动物模型。小鼠常被用于此目的^4,5,6，博来霉素给药方式包括静脉注射和气管内滴注^7,8。尽管这些模型中确实会出现纤维化，但没有一种模型能完全再现人类肺纤维化所具有的全部典型特征⁸。啮齿类动物的肺纤维化模型未能反映晚期疾病的关键特征，包括蜂窝样囊肿的形成以及远端肺泡的细支气管化⁹。此外，研究显示，博来霉素诱导的肺损伤在给药后约28天开始在啮齿类动物中自发缓解¹⁰。另外，在这些模型中显示可抑制纤维化的任何药物均未在人类中产生同等效果，这限制了我们的治疗选择¹¹。

雪貂（Mustela putorius furo）因其呼吸系统解剖结构与人类高度相似，正越来越多地被用于呼吸系统生物医学研究¹²。此外，雪貂对多种感染人类的呼吸道病原体也具有易感性，包括呼吸道合胞病毒（RSV）和流感病毒，这进一步体现了其生理上的相似性¹²。在博来霉素诱导的雪貂肺纤维化模型中，可观察到细支气管化、纤维灶形成以及异常基底样细胞（KRT7⁺/KRT17⁺/KRT5^–/TP63⁺）的出现⁹。单次给予博来霉素即可在雪貂中诱导持续性肺纤维化，其限制性通气功能障碍及肺部纤维化异常可至少持续22周¹³。这一特征与广泛使用的博来霉素小鼠模型存在显著差异：在小鼠模型中，纤维化通常具有自限性，约28天后开始缓解，6至8周时已出现明显消退，提示雪貂模型可能更真实地模拟人类肺纤维化（PF）的慢性进行性特征。此外，由于雪貂在生理上与人类高度相似，近年来也被用于囊性纤维化研究——一种主要累及呼吸系统的全身性疾病¹⁴。因此，这些动物可能比以往的啮齿类模型更适合作为肺纤维化的研究模型。

本研究旨在建立一种更接近人类病情的肺纤维化动物模型。我们对家养雪貂进行了气管内注射博来霉素。8周后，这些雪貂表现出的影像学和组织学改变与人类肺纤维化患者所观察到的变化相似。

方案

所有动物实验均按照密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南和规定进行（动物实验方案批准编号：PROTO202300066）。动物护理和实验方案已获密歇根州立大学批准，并严格遵守机构关于科研中动物伦理使用的标准。

1. 雪貂支气管镜下博来霉素灌注

1. 选取年龄在3–4个月之间的雄性雪貂。此年龄段雄性雪貂的平均体重约为0.9–1.6 kg。将动物饲养在21 °C、相对湿度为40%–50%的环境中。
2. 使用精密蒸发器麻醉机向雪貂给予3%–5%的异氟烷气体。
3. 通过鼻罩覆盖雪貂的鼻部，持续以3%–5%浓度的异氟烷气体维持麻醉状态。
4. 当雪貂充分镇静并呈侧卧位时，使用外径为2.7 mm的支气管镜开始支气管镜检查。
5. 通过工作通道将博来霉素（2 U/kg体重）与生理盐水的混合液注入远端气管，以实现博来霉素的弥散分布。确保注入的总体积不超过1 mL。将雪貂放回各自的饲养笼中，并持续观察8周。
   注意：注入操作完成时间不应超过两分钟。
6. 使用精密蒸发器气体麻醉机给予异氟烷。以鼻罩覆盖雪貂鼻部，给予1%–5%异氟烷直至雪貂倒卧。持续暴露于气体中，直至确认明显的临床死亡。随后以90 mg/kg剂量静脉注射安乐死溶液，并持续监测生命体征直至确认死亡。
7. 在给药后8周处死动物，取出肺组织用于显微计算机断层扫描（micro-CT）及组织学评估。

2. 雪貂肺部的高分辨率显微CT成像

1. 通过下腔静脉切口切除多余组织和血液以去除血液，为成像准备离体肺组织。肺组织准备完成后应立即进行CT扫描。
2. 使用 micro-CT 系统获取断层扫描 micro-CT 图像，图像采集参数设置如下：90 keV， 88 µA，功率设置为 60 µm 铜和 500 µm 铝制X射线准直器滤光片，采用72 mm视野（FOV） 144 µm 各向同性图像分辨率。
3. 使用自动拼接程序，在18秒标准机架时间内共采集5幅图像，通过重叠、拼接并剔除重复切片，最终生成用于气道分析的拼接图像；由此获得的拼接图像视野（FOV）为直径68 mm的圆柱体，总拼接图像深度（z平面）为186 mm 144 µm 体素分辨率，可实现对整体的完整捕捉 离体 雪貂肺组织块
   1. 对每组重复此成像方案 离体 雪貂肺在0 cmH处₂O 和 25 cmH₂O₂肺动脉压力。
   2. 使用直接连接至肺部的压力监测系统，在成像过程中精确控制并维持气道压力。
   3. 将压力计连接至可调节的气流源，以持续调节肺内压力。
   4. 成像前，将系统设定至所需的压力水平（可选 0 cmH₂O 或 25 cmH₂O₂O）并使用稳定气流使肺膨胀。
   5. 成像过程中，使用压力计实时监测气道压力，并通过气流源补偿任何微小的压力波动。

3. 图像处理与分割

1. 将重建的微计算机断层扫描（micro-CT）图像序列（以DICOM格式存储并已转换为神经影像信息学技术倡议（NIfTI）格式）导入气道分割流程。
2. 在微CT图像中，通过手动裁剪轴向切片的上端，排除导管及其他气管插入物，从而定义感兴趣区域（ROI）（参见 图1A).
3. 使用自动化的冻结-生长算法进行气道分割^15,16 如下所述的主要步骤。
   1. 在 ROI 内轴向图像切片的最上方将一个种子点置于气管内；创建一个与输入图像大小相同的空图像数组，用于表示初始的确定气道体积（CAV），并将所有体素赋值为“0”；通过将种子体素的值设为“1”将其加入 CAV。
   2. 设定初始保守的微计算机断层扫描（micro-CT）强度阈值 t = -1000 HU，用于气道管腔的分割。
   3. 创建一个与输入图像大小相同的空图像数组，用于表示禁阻体积（FV），并将所有体素初始化为“0”。
   4. 重复迭代分割，直至气道管腔分割收敛，收敛条件由以下两个标志之一定义：1）已检查完整个阈值范围（-1000 至 -600 HU）；或 2）在 CAV 图像中所有与“1”体素相邻的“0”体素均在 FV 图像中标记为“1”。
      1. 计算CAV中心线树¹⁷ 并识别末端分支的终点¹⁸.
      2. 对当前 t 值下的显微CT图像应用二值化阈值处理，并计算新的管腔连通体积¹⁸ 以CAV为种子点，在阈值化区域（体素值 ≤ t）内进行，同时排除FV。
      3. 针对每个CAV终点，计算新管腔体积内与之相关的体素，排除那些距离该终点比距离其他任何CAV终点更近的CAV。
      4. 通过大量相关体素检测CAV终点>150个体素，相当于0.5 mm³）作为新管腔容积中潜在的渗漏位点。
      5. 使用 Nadeem 等人定义的自动化标准确认潜在的管腔渗漏。¹⁵.
      6. 通过删除泄漏根部远端的子树体积，去除管腔体积中的任何泄漏，并在泄漏根部周围添加体素，以使用先前所述的算法增加FV¹⁵.
      7. 使用先前所述的算法，将去除泄漏后的管腔体积分配以更新冠状动脉血管（CAV）¹⁵.
      8. 将阈值 t 增加 '1'。
      9. 转至步骤 3.3.4。
4. 使用一种先前已验证的自动化算法，计算单体素厚度的气道中心线树¹⁷ 如下所述的主要步骤。
   1. 将分割后的气道树作为二值NIfTI图像输入。
   2. 采用以中轴优先的最小代价路径法计算初始气道中心线树¹⁷ 以下主要步骤中所述。
      1. 创建一个与输入图像尺寸相同的空骨架图像数组，所有体素赋值为“0”；将3.3.1步中自动获得的种子作为初始骨架体素，赋值为“1”。
      2. 创建一个与输入图像尺寸相同的空图像数组，所有体素均赋值为“0”，用于表示标记的气道体积图像。
      3. 确定未标记气道体积中距离当前骨架最远的体素，并使用前述算法计算连接该点到当前骨架的、以中心性为优先的最小代价路径¹⁷.
      4. 将生成的路径作为新的骨架分支添加到骨架图像数组中，并沿该分支应用局部尺度自适应扩张，以更新已标记气道的体积，具体方法如前所述。¹⁷.
      5. 重复步骤 3.4.2.3–3.4.2.4，直至充满标记的气道容积。
   3. 采用基于分支长度的局部尺度选择策略，去除虚假的拓扑分支，同时保留真实的气道中心线，方法如前所述¹⁷.
   4. 消除简单点¹⁹ 气道中心线中非分支末端的点（即相邻于多个中心线体素的点），以确保拓扑一致性并维持单个体素厚度的中心线。
5. 在0 cmH₂O压力下对雪貂肺部显微图像中的肺实质进行分割₂O.
   1. 使用 ITK-SNAP 中嵌入的计算算法和图形界面，在每第五个冠状图像切片上手动勾画肺实质²⁰.
      注意：在25 cmH₂O气道压下，肺实质与周围背景之间的微计算机断层扫描（micro-CT）强度对比₂肺部膨胀状态不足，导致无法可靠地分割肺容积。
   2. 应用图像插值技术，对中间图像切片进行肺实质的分割生成。
   3. 执行二次质量控制审查，以确保实质分割在轴向和矢状方向上的结构连续性。
   4. 使用基于局部尺度的管腔体积扩张法排除肺实质中的气道管腔和管壁区域，然后将扩张后的体积从肺实质中减去。
6. 量化气道的力学指标²¹.
   1. 通过测量吸气相（25 cmH₂O）与呼气相（5 cmH₂O）之间空间匹配的气道管腔横截面积（CSA）变化，量化个体气道随呼吸相关的径向扩张。₂O 气压）和呼气（0 cmH₂计算气道分支处的径向扩张（在肺容积未膨胀时） b，用以下符号表示 Δ_空气-R(b），作为：
          (1)
      其中，CSA_内侧(b）和 CSA_实验(b) 表示吸气相和呼气相肺容积时的气道管腔横截面积。横截面积在 b 采用径向线追踪法和局部自适应半高法，在分支的中央一半区域进行计算 b²².
   2. 按如下方法量化与呼吸相关的单个气道的纵向拉伸：
          (2)
      其中 L_胰岛素(b）和 L_实验(b表示气道分支的测地路径长度 b 分别在吸气和呼气肺容积下。支气管分支的测地路径长度通过从隆突沿中心线追踪至该分支远端终点来计算²¹.
7. 量化基于强度的肺实质测量指标。
   1. 通过生成健康与纤维化雪貂肺实质的微计算机断层扫描（micro-CT）强度分布的空间可视化图像 "透视三维容积渲染" 在气道树的背景下显示肺实质体积。通过微计算机断层扫描（micro-CT）强度定义的透明度映射并结合颜色编码，实现透视效果。将相同的透明度映射和颜色编码尺度应用于健康与纤维化雪貂肺组织。以下步骤用于生成具有透视效果的三维体积渲染图像。
      1. 使用 3D Slicer²³ 打开气道分割的三维（3D）NIfTI图像（0 cmH处）₂O膨胀作为一种 "分割".
      2. 使用以下方法生成三维气道结构模型 分割 模块。选择气道容积作为输入，并在 表征 标签，点击 创建 在……之下 封闭表面 选项
      3. 将肺实质分离后的微计算机断层扫描（micro-CT）强度图像导入 3D Slicer 中 体积在此图像中，肺部体素保留了原始的微计算机断层扫描（micro-CT）强度值，而所有非肺部体素均被赋值为 -2000 HU。
      4. 使用以下方法为肺实质强度配置颜色和透明度映射 体积渲染 模块。将-1500 HU、-600 HU、0 HU和1500 HU的强度值分别映射为黑色、绿色、黄色和红色，对应的不透明度分别为0、0.15、0.3和1。
   2. 利用本研究开发的算法，通过分析微计算机断层扫描（micro-CT）成像中观察到的强度分布，估算肺实质内病变组织所占比例。该方法假设健康肺实质区域的强度值服从高斯分布；而纤维化区域由于其特征性的较高强度，会扭曲观测直方图右侧的高斯分布形态。请按以下步骤完成此项任务。
      1. 在步骤 3.7.1.3 中，对分离的肺实质图像计算直方图，灰度范围为 -1500 HU 至 500 HU，共 50 个区间。
      2. 将目标高斯分布的均值计算为直方图的众数，并利用直方图中众数左侧的强度值推导标准差参数。
      3. 将纤维化组织体积量化为观察到的直方图右侧超出预期高斯分布曲线的面积，该高斯分布曲线由步骤 3.7.2.2 中获得的均值和标准差参数定义。
      4. 将病变组织比例计算为纤维化组织体积与代表实质区域体积的总直方图计数的比值。

结果

在五只雪貂中，分别对一只健康雪貂和一只纤维化雪貂的切除肺组织在0 cmH₂O和25 cmH₂O的控制气道压力下，使用显微CT扫描仪成像，以分别模拟呼气和吸气 状态下的肺膨胀。

图1 展示了显微CT图像图像处理流程的中间结果图1A) 的 离体 雪貂肺在 0 cmH₂O 时的状况₂无压力。 图1B 展示在迭代过程中对一只充气至0 cmH₂O的雪貂离体肺部微CT图像进行气道树体积分割的中间结果及相应的阈值参数₂O. 图1B 展示了FG算法通过在后期迭代中放宽参数，有效捕捉更小气道的能力。 图1C 展示了气道中心线树在剪枝虚假分支前后的检测结果。

观察发现，超过第五代后，纤维化肺中检测到的气道数量明显少于健康肺中相应代数的气道数量（图2A）。具体而言，在健康肺中第五代之后检测到161条气道分支，而在纤维化肺的相应代数中仅检测到91条气道。总体而言，与健康肺相比，纤维化肺中的气道壁更厚（图2B）。计算分析显示，在肉眼可见纤维化的区域，气道壁厚度经管腔直径归一化后，显著高于健康肺中相应匹配区域。

纤维化肺组织显示出小而壁厚的囊性气腔，符合蜂窝状改变的表现，同时伴有小叶间隔增厚以及磨玻璃样密度影区域。磨玻璃样密度影是指肺部区域由于肺组织增厚及气腔部分填充，导致在CT图像上呈现模糊的灰白色外观。观察发现，纤维化肺组织的肺实质CT密度值更高，对应于纤维化区域。图3A展示了分割后的肺实质体积与分割后的气道树共同呈现的“透视三维容积渲染”图像。纤维化雪貂肺组织肺实质的显微CT密度值（-502 ± 238 HU）显著高于健康雪貂肺组织（-588 ± 167 HU）（p < 0.001）。区域性密度升高分析（图3B）显示，纤维化肺组织中有27.8%的肺实质体积表现为CT密度升高（直方图中紫色区域所示），而健康肺组织中仅有1.24%的肺实质体积出现密度升高。

通过比较正常与病变肺组织的气道力学特性，可以直观展示健康雪貂与纤维化雪貂肺组织在各级气道分支中气道呼吸力学生物标志物的分布情况（图4）。在健康雪貂肺组织中观察到的气道径向扩张率为66.8% ± 9.8%，显著高于纤维化雪貂肺组织中的32.4% ± 7.6%（p < 0.001）。健康雪貂肺组织的气道纵向拉伸率为35.7% ± 5.3%，也显著高于纤维化肺组织的16.0% ± 4.9%（p < 0.001）。

代表性 CT 图像采用微型 CT 扫描仪在两种不同气道压力（0 cmH₂O）下获取₂O 和 25 cmH₂O₂每只肺的氧合指数（O） 图5 说明正常（图5B，C）以及BLEO处理的雪貂肺组织（图5E，F）。在正常肺组织中，CT 扫描显示典型的肺部结构，呈低衰减，且无纤维化迹象 (图 5B，C）。相比之下，经BLEO处理的雪貂肺部表现出显著的病理变化，包括肺部密度增高，提示组织纤维化（图5E，F）。此外，可见明显的蜂窝状改变，其特征为囊性空腔和增厚的肺小叶间隔（图5E，F）。磨玻璃样影（GGO），代表炎症区域或早期纤维化改变，在博来霉素（BLEO）处理的肺组织中亦可见到。图5E，F).

组织学分析（图6）证实，博来霉素处理的雪貂肺组织出现明显的组织重塑和纤维化。苏木精-伊红（HE）染色显示，正常肺组织中肺泡结构保持完整（图6A、C），而纤维化肺组织则表现出广泛的结构扭曲、细胞密度增加、气道壁增厚以及显著的纤维化病灶（图6B、D）。Masson三色染色进一步显示，正常肺组织的气道和实质区域胶原沉积极少（图6E、G），而纤维化肺组织在气道（图6F）和肺实质区域（图6H）均出现明显的胶原大量积聚。定量图像分析（图6I、J）证实，与正常对照组相比，纤维化肺组织在气道和肺实质区域的胶原阳性面积均显著增加（P < 0.0001），表明存在广泛的细胞外基质沉积和进行性组织重塑。

图 1：CT 图像处理与分割。（A）在微型 CT 图像中选择感兴趣区域（ROI）。通过手动选择裁剪边界，以排除用于膨胀离体雪貂肺组织的管路及其他气管插入物。（B）使用“冻结-生长”（freeze-and-grow, FG）算法对在 0 cmH₂O 条件下膨胀的离体雪貂肺微型 CT 图像进行气道树分割的中间结果。（C）在对 0 cmH₂O 条件下获取的微型 CT 图像气道分割结果进行虚假骨架分支剪枝处理前后，中心线检测结果的对比。请点击此处查看此图的高清版本。

图2：气道树生成的计算分析。（A）在健康肺与纤维化肺中检测到的气道数量。（B）健康肺与纤维化肺中气道壁厚度的差异。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：彩色编码的显微CT强度可视化。（A）在0 cmH2O充气状态下，健康与纤维化雪貂肺实质中彩色编码的显微CT强度分布的透视三维可视化图像。（B）健康与纤维化雪貂肺的显微CT强度直方图，其中以紫色标记的直方图区域表示基于高斯模型分析得出的CT强度升高区域。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：健康与纤维化雪貂肺的气道呼吸力学生物标志物。 对于每个生物标志物，（A 显示气道径向扩张，B 显示气道纵向拉伸），采用归一化的颜色编码方案，范围覆盖 μ_x ± 3σ_x ，其中均值（μ_x）和标准差（σ_x）是基于健康雪貂肺中所有支气管分支计算得出的。定量比较结果详见正文。请点击此处查看该图的放大版本。

图5： 显微CT成像显示博来霉素诱导的雪貂纤维化肺组织出现广泛的结构重塑及通气肺容积的显著减少。 （A–F）在25 cm H₂O充气压力下获取的代表性显微CT图像，对比了健康对照组雪貂（A–C）与博来霉素处理的纤维化雪貂（D–F）。三维（3D）容积重建图像（A、D）显示，健康肺组织具有完整的肺结构和均匀扩张（A），而纤维化肺组织（D）则表现为肺扩张减少及明显的实质结构扭曲。横断面（B、E）和冠状面（C、F）CT切片进一步突出了两组之间的差异。健康肺组织显示均匀通气的肺实质、正常的气道分支及较低的组织密度（B、C）。相比之下，纤维化肺组织表现出广泛的双侧胸膜下及以肺底为主的磨玻璃样密度增高影、肺实质密度增加、结构扭曲以及符合蜂窝样重塑特征的囊性气腔扩大（红色箭头）（E、F）。黄色虚线标示肺组织边界。这些影像学发现表明，雪貂经博来霉素暴露后出现严重的纤维化重塑及功能性通气肺容积的显著下降。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：BLEO诱导的雪貂肺纤维化的验证。（A–H）代表性明场苏木精-伊红（HE）染色切片显示正常肺组织（A、C）与纤维化肺组织（B、D）之间的差异。低倍镜下HE图像显示正常肺组织肺泡结构保持完整（A），而纤维化肺组织则出现广泛的组织重塑和纤维化病灶（B）。高倍镜下HE图像进一步显示正常肺组织肺泡结构正常（C），而纤维化肺组织细胞密度增加、气道壁增厚及结构扭曲（D）。雪貂肺组织切片Masson三色染色的代表性明场图像显示，正常肺气道（E）和肺实质（G）中胶原沉积极少，而纤维化肺气道（F）和肺实质（H）中胶原沉积（蓝色）增加。(I、J) 胶原阳性面积定量分析显示，与正常肺组织相比，纤维化肺组织在气道区域（I）和肺实质（J）中的胶原沉积显著增加。****P < 0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究描述了一种结合在雪貂中进行气管内博来霉素给药与高分辨率成像的实验方案 离体 微型计算机断层扫描（micro-CT）用于表征肺纤维化的结构与力学特征。micro-CT 能够检测小至 0.2 mm 的小气道，并可测量容积、气道壁厚度、密度及形态学参数。组织密度增加、容积减少以及区域异质性与组织病理学结果高度一致。本研究的主要目标是验证该技术的可行性，并证明这一大动物模型结合先进影像分析方法，能够捕捉到与人类肺纤维化相似的影像学、气道及组织病理学特征。该实验方案中多个步骤对于结果的可重复性与可解释性至关重要。首先，经支气管镜引导的气管内博来霉素灌注可实现肺部的弥散性暴露，同时最大限度减少近端气道药物积聚，从而克服小动物模型中已知的局限性。^4,7,11这种方法可能减少区域损伤分布的变异性，这在气道分支更为复杂的较大肺脏中尤为重要。其次，选择灌注后8周作为观察时间点，有利于观察已建立的纤维化而非急性炎症。在小鼠模型中，博来霉素诱导的纤维化常随时间部分消退，从而限制了其转化研究的相关性^4,8,11相比之下，本研究中的雪貂肺部表现出持续存在的影像学和组织学纤维化特征。

控制性肺膨胀在 离体 成像代表了另一个关键要素。在标准化气道压力（0 cmH₂O 和 25 cmH₂O）下进行成像，可量化气道的径向扩张和纵向拉伸，从而减少肺容积和顺应性差异带来的混杂影响。这些通过自动化、逐代匹配算法获得的气道力学生物标志物，为气道功能障碍提供了客观的评估指标，而此类指标仅靠传统组织学方法难以准确评估。^15,21.

若干方案改良措施可进一步增强实验的稳健性。博来霉素的给药剂量可进行滴定，或以重复低剂量方式给药，以更好地模拟慢性上皮损伤，而慢性上皮损伤是当前肺纤维化发病机制研究范式中的核心环节。^1,3分段灌注策略可实现动物体内纤维化区域与相对正常区域之间的比较。从成像角度而言，必须严格标准化气道压力、固定条件和温度，以尽量减少组织在处理过程中的形变 离体 扫描。严重的纤维化可能导致气道闭塞和组织密度升高，从而影响自动气道分割的准确性；因此，自适应阈值分割和人工质量控制仍是自动化流程中不可或缺的辅助手段。¹⁵.

该方法存在若干局限性。最显著的是，接受微型计算机断层扫描（micro-CT）成像的动物数量较少，限制了统计推断能力，因此研究结果应视为描述性发现。本研究设计为一项初步研究，旨在确定利用定量微型计算机断层扫描对博来霉素诱导的雪貂肺纤维化模型进行表征的可行性。未来需要开展更大样本量的研究，以验证这些发现并提高统计效能。然而，现有描述已显示出影像生物标志物和测量指标方面明显的差异。

此外，尽管博来霉素诱导的纤维化模型被广泛使用，但它仍属于一种由毒素驱动的损伤模型，无法完全模拟特发性肺纤维化的多因素病因，包括衰老、遗传易感性和环境暴露^3,6,11。成像在离体（ex vivo）条件下进行，因此无法直接评估气体交换、血管因素以及疾病的纵向进展。尽管如此，离体（ex vivo）微计算机断层扫描（micro-CT）具有更高的空间分辨率，能够对雪貂的小气道进行详细的三维分析，而这种分析目前尚无法通过临床多排探测器CT实现。

尽管存在这些局限性，该方案相较于现有模型仍具有多项优势。雪貂的呼吸性细支气管和气道分支模式比啮齿类动物更接近人类，因此特别适用于研究以气道为中心的纤维化特征^6,12。结合与人类相关的气道解剖结构和基于显微CT的定量成像技术，可同时评估肺实质密度、气道壁厚度、气道丢失以及气道力学功能受损情况。这些特征反映了人类纤维化肺疾病中观察到的影像学表现，包括蜂窝样改变、小叶间隔增厚和区域异质性^1,2。

高分辨率计算机断层扫描（HRCT）是临床实践中用于特发性肺纤维化（IPF）诊断及长期监测的核心影像学手段。HRCT基于与微型计算机断层扫描（micro-CT）相似的原理，经过优化可在最大程度降低患者辐射暴露的同时，有效检出肺实质异常²⁴。重要的是，HRCT技术的进步已显著提高诊断准确性，当出现典型影像学特征时，通常无需再进行外科肺活检即可确诊IPF²⁵。IPF典型的影像学表现，包括肺结构扭曲、牵拉性支气管扩张、蜂窝样改变以及囊性含气腔隙，均可通过HRCT在患者中识别。与这些临床观察一致，我们的雪貂模型也表现出可通过micro-CT检测到的气道扭曲和囊性含气腔隙形成，提供了一种在影像表型上与人类疾病高度相似的动物模型。

除了高分辨率计算机断层扫描（HRCT）外，支气管内光学相干断层扫描（EB-OCT）也已成为评估特发性肺纤维化（IPF）的一种有价值的影像学方法²⁶EB-OCT 是一种微创技术，利用光波生成外周肺部的高分辨率三维图像 体内 通过标准支气管镜²⁶与高分辨率CT（HRCT）类似，腔内支气管光学相干断层扫描（EB-OCT）在无需手术活检的情况下识别纤维化重塑方面已显示出良好前景。雪貂模型能够形成可通过CT成像检测到的结构异常，这表明该模型也可能非常适合用于未来新兴临床影像技术（如EB-OCT）的评估。

重要的是，许多在啮齿类动物模型中可减轻纤维化的疗法在人类中未能显示出类似的疗效¹¹。本文所述的方法可能有助于弥合这一转化鸿沟，提供能够反映结构与功能的敏感性、空间分辨的成像生物标志物。此类生物标志物可用于评估治疗反应，不仅限于整体胶原负荷，还可捕捉气道力学或肺实质重塑的区域性改善。

综上所述，本研究建立了一种在雪貂中建模肺纤维化并利用显微CT定量评估疾病相关结构和力学变化的可行方案。尽管尚属初步研究，该方法凸显了将大型动物模型与先进影像分析技术相结合的潜力，有助于提高转化相关性、加深对肺纤维化机制的理解，并支持对新型治疗策略的临床前评估。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 鲁尔锁式注射器	BD	309628
10 mL 鲁尔锁式注射器	BD	303134
24 G ´ 3/4" Exel safelet 导管	EXELINT INTERNATIONAL CO.	26751
3 mL 鲁尔锁式注射器	BD	309657
30 mL 鲁尔锁式注射器	BD	302832
5 mL 鲁尔锁式 注射器	BD	309647
BD Precision glide 针头 18 G ´ 1 1/1"	BD	305196
BD Precision glide 针头 20 G ´ 1"	BD	305175
BD Precision glide 针头 23 G ´ 1"	BD	305145
Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS -/-)	Gibco	14190250
带套囊的气管插管导管及供氧导管	Caphstion	2.0MM
无套囊气管插管，2.0	Teleflex	5-10404
Ethicon Permahand 蚕丝缝合线，2-0 规格，无针，18"，每盒36根，A185H	Fisher Scientific	50-209-2809
Invitrogen RNAlater RNA 稳定保存液	Fisher Scientific	AM7021
异氟烷	Covetrus	11695-6777-2
润滑性 PM 软膏	AACE Pharmaceuticals	71406-124-35	眼用软膏
MADgic 700 雾化器	Teleflex	MAD700
压力计，专业空气压力测量仪	Leaton	T168
啮齿类动物呼吸机，型号 683	Harvard Apparatus, Inc.	55-3438
无菌生理盐水，0.9%	CellPro	DS0329
兽用脉搏血氧仪	uPM60V	UVMI