一种基于荧光的方法用于可视化肝癌细胞有丝分裂过程中脂滴与细胞器的动态变化

摘要

本方案利用同步化的肝癌细胞，可重复地观察有丝分裂过程中脂滴和细胞器的动态变化。

摘要

细胞内脂滴（LDs）在多种细胞类型中普遍存在。脂滴储存甘油三酯和胆固醇酯等中性脂质，在能量代谢、信号传导和应激反应中发挥重要作用。尽管脂滴已被公认为细胞内的细胞器，但其在细胞周期进程中的行为仍不明确。在有丝分裂过程中，包括线粒体和高尔基体在内的多种细胞器会发生显著的结构重塑并随后重新组装，这引发了一个问题：脂滴是否也经历依赖于细胞周期的变化？由于脂滴可作为能量来源和信号枢纽，阐明其在有丝分裂期间的动态变化尤为重要。为此，我们提出一种结合细胞周期同步化与荧光标记脂滴染色的技术方案，适用于肝癌细胞。通过使用依赖于周期蛋白依赖性激酶1抑制剂的方法，将细胞阻滞在G2/M期边界，随后释放进入细胞周期，并在特定时间点收集细胞。接着利用中性脂质染料对脂滴进行标记，并通过荧光显微镜观察。该方法为研究有丝分裂过程中脂滴的重新分布提供了可重复的实验途径，亦可广泛应用于细胞器生物学、代谢调控及癌细胞生理学的研究。

引言

细胞周期是一个高度协调的过程，可确保染色体DNA的精确复制和分离^1,2，在此过程中，细胞内细胞器发生动态重排³。细胞周期包括四个主要阶段：G1期、S期、G2期和M期^1,2。在有丝分裂过程中，复制后的染色体排列在双极纺锤体的赤道平面上，随后被分配到两个子细胞中⁴。线粒体和高尔基体等细胞器在有丝分裂期间经历广泛的重塑^5,6,7,8。这些细胞器在分配至两个子细胞之前会断裂成小囊泡，并在后续细胞周期进程中重新组装³。

脂滴（LDs）是一类含有中性脂质的细胞器，由中性脂质核心及外围的磷脂单层膜构成。脂滴与多种蛋白质相关联，广泛存在于多种类型的细胞中，包括增殖中的细胞^9,10。脂滴的蛋白质和脂质组成因细胞类型和组织类型的不同而有所差异¹¹。在这些相关蛋白中，perilipin（PLIN）家族已被广泛研究，其中PLIN2在肝细胞中具有稳定脂滴的作用^12,13。除了结构上的稳定功能外，PLIN家族蛋白还参与调控脂滴的动态变化及其与其他细胞组分的相互作用¹⁴。脂滴不仅作为三酰甘油和胆固醇酯的储存库，还在能量代谢¹⁵、信号通路¹⁶以及应激适应¹⁷中发挥枢纽作用。在病理状态下，例如代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH，此前称为NASH），脂滴的积累显著高于健康对照组^18,19，凸显了其在疾病生物学中的重要性。然而，尽管已有大量关于线粒体、内质网和高尔基体在有丝分裂过程中动态行为的研究，有关分裂细胞中脂滴空间定位的观察仍十分有限。我们采用本文所述方法，分析了有丝分裂过程中脂滴的定位情况。我们此前曾报道，脂滴表现出与其他细胞内细胞器不同的空间分布模式²⁰。

本文提供了一种详细的研究方案，用于分析肝癌细胞有丝分裂过程中脂滴（LDs）及其他细胞内细胞器的分布情况。该方法包括细胞周期同步化和荧光染色，可重复地可视化有丝分裂期间脂滴的动态变化。代表性结果表明，脂滴在间期与有丝分裂期之间的空间分布呈现细胞周期依赖性的变化，从而有助于对细胞分裂过程中脂滴定位进行比较分析。该方法可广泛应用于生理和病理条件下细胞器定位、动态行为及代谢调控的研究。

方案

本方案所需的储备溶液

1. 配制24% (w/v) 无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）溶液，溶于150 mM NaCl中。
2. 在无菌条件下，用DMSO配制10 mM RO-3306（一种选择性细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）抑制剂）储备液。
   注意：其他常用溶液，如NaOH、NaCl和磷酸盐缓冲盐水（PBS），均按照标准实验室操作配制。PBS的配制方法为：将2.6 g NaH₂PO₄·2H₂O、29 g Na₂HPO₄·12H₂O、80 g NaCl和2.0 g KCl溶于蒸馏水中，并定容至1 L。

2. 制备与牛血清白蛋白（BSA）结合的油酸

1. 将90 mg油酸置于50 mL烧杯中，加入2 mL乙醇（99.5%）使其溶解。
2. 向溶液中加入100 µL 5 N NaOH，搅拌至完全混合。
3. 在氮气流下蒸发乙醇。
4. 加入10 mL 150 mM NaCl，于60 °C孵育5分钟。
5. 将12.5 mL预冷至冰浴温度的24%（w/v）BSA储备溶液缓慢地逐滴加入油酸溶液（2.4）中，并在室温下持续轻轻搅拌10分钟，以实现逐步且均匀的混合。
6. 调节pH至7.4，并用150 mM NaCl定容至25 mL。油酸的终浓度为12.8 mM。
7. 在无菌条件下通过0.22 µm滤膜过滤溶液，分装后于4 °C保存可使用长达2周，或于-20 °C长期保存。

3. 细胞G2/M期边界同步化

1. 准备必要的对照组。
   1. 准备未经处理的异步细胞，不进行 RO-3306 处理，作为基线对照。
   2. 对于油酸处理条件，准备仅用油酸处理而未进行细胞周期同步的细胞，作为基线对照。
   3. 进行荧光染色时，对每种荧光染料分别进行单染对照，以验证信号特异性，并排除通道间的光谱重叠（补充图 1）。
   4. 使用顺序采集设置或适当的滤光片配置获取图像，以最大程度减少光谱重叠和通道串扰。
      ​注意：这些对照对于区分细胞周期依赖性变化与细胞器基础分布，以及验证荧光特异性至关重要。
2. 将 HuH7 细胞维持在添加了 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中，在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。
3. 将玻璃盖玻片放入 35 mm 培养皿中。每 35 mm 培养皿接种 2 × 10⁵ 个细胞，使用上述培养基，在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养。
4. 用 PBS 洗涤细胞两次，然后加入含有 9 µM RO-3306 和 0.5 mM 油酸的新鲜培养基进行孵育。
5. 在标准培养条件下孵育细胞 20 小时。

4. 去除同步化细胞中的RO-3306试剂以进入有丝分裂期

1. 用 PBS 洗涤细胞（步骤 3.4）三到五次。
2. 用新鲜培养基洗涤细胞一次。
3. 将细胞置于新鲜培养基中，在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 1 小时，以使其进入有丝分裂期。
   注意：去除 RO-3306 可使同步化的细胞从 G2/M 期边界进入有丝分裂期。洗去试剂后，大部分细胞约在 1 小时内进入有丝分裂期，此期间可通过细胞变圆和染色体凝集来识别有丝分裂细胞。观察有丝分裂特定阶段的最佳时间可能因细胞类型和培养条件不同而有所差异。

5. 有丝分裂细胞的样品制备

1. 在室温下用 PBS 中 4% 多聚甲醛固定细胞 10 分钟。
   注意：有丝分裂细胞容易从培养皿上脱落；固定前避免洗涤。
   备注：对于 PLIN3 染色，细胞使用 2% 多聚甲醛和 2% 戊二醛的混合液进行固定。
2. 在室温下用 PBS 中 0.1% (w/v) Triton X-100 对固定后的细胞透化处理 10 分钟。
3. 在室温下用 PBS 中 1% (w/v) BSA 封闭细胞 1 小时。

6. 染色脂滴及其他细胞器

1. 使用精细镊子小心地从培养皿中取出玻璃盖玻片，并将其细胞面朝上放置于湿润 chamber 中，以防止干燥。
   注意：所有后续染色步骤均需在湿润且避光的环境中进行，以保护荧光信号。
2. 用 PBS 洗涤细胞两次，并在室温下用 PBS 稀释的一抗孵育 1 小时。
3. 用 PBS 洗涤细胞两次，并在室温下用 PBS 稀释的二抗孵育 1 小时。
4. 用 PBS 洗涤细胞两次，并在室温下用中性脂质荧光染料染色 10 分钟。
   注意：选择具有不同光谱特性的染料，以便实现灵活的多色成像，并最大程度减少与其他细胞器标记物之间的光谱重叠。
5. 用 PBS 洗涤细胞两次，然后在室温下用 DNA 结合型荧光染料（DAPI：激发波长 350–410 nm；发射波长 420–450 nm）按 1:1,000 的比例稀释于 PBS 中染核 5 分钟。
6. 用 PBS 洗涤细胞两次，然后使用抗淬灭封片剂将盖玻片封固于载玻片上，以在成像过程中保持荧光稳定性。
7. 用透明指甲油密封盖玻片边缘，以防止成像过程中样品干燥或移动。
   注意：由于荧光信号会逐渐衰减，建议在染色后 1 周内完成图像采集。

7. 细胞内细胞器及其亚细胞定位的观察

1. 使用宽场荧光显微镜获取荧光图像，以快速筛选多个细胞，并选择具有代表性的间期和有丝分裂期细胞；采用低激发强度和快速采集设置，以尽量减少光漂白。
2. 对所选细胞在适当放大倍数下进行成像，用于荧光染色分析。
   注：间期细胞通常表现出一个完整且位于细胞质中央的单个细胞核。相比之下，有丝分裂期细胞则显示染色体凝集并排列在双极纺锤体的赤道平面上。这些形态学特征可作为区分间期和有丝分裂期细胞的视觉判据。
3. 利用适用于中性脂质荧光染料和DNA结合型荧光染料的适当滤光片组，通过宽场荧光显微镜观察脂滴（LDs）和细胞核形态。
   注：应根据所用显微镜系统的具体规格选择相应的滤光片组。
4. 为实现更高分辨率的验证，使用配备高数值孔径物镜（例如60×，NA ≥1.2）的共聚焦显微镜采集荧光图像。采用适当的激发激光和发射滤光片设置，检测中性脂质荧光染料和DNA结合型荧光染料的荧光信号。使用常用图像采集与分析软件处理图像。
   注：根据显微镜系统不同，可选用水镜或油镜物镜。浸没介质的选择应遵循制造商的建议及实验目的。宽场荧光显微镜适用于间期与有丝分裂期细胞中脂滴分布的常规观察与比较，而当需要更高空间分辨率时，推荐使用共聚焦显微镜。

8. 脂滴数量和大小的定量分析

1. 在所有条件下，使用相同的成像设置获取细胞的荧光图像。
2. 使用图像分析软件打开所获取的图像。
3. 设置适当的阈值以识别脂滴，并进行颗粒分析以定量脂滴数量和面积。
   注意：为了准确比较脂滴数量和面积，成像参数应在所有条件下保持一致。

结果

使用 RO-3306 将肝癌细胞同步于 G2/M 期交界处

为了研究有丝分裂过程中细胞内细胞器的动态变化，使用了一种选择性CDK1抑制剂RO-3306，将细胞同步在G2/M期交界处^20,21。当细胞用CDK1抑制剂处理20小时后，再在新鲜培养基中继续培养1小时，超过50%的细胞被同步在G2/M期交界处（图1）。通过去除RO-3306，细胞被允许进入细胞周期。在洗去试剂前，HuH7细胞呈现类似上皮细胞的形态（图2）。洗去RO-3306后1小时，处于有丝分裂期的细胞呈现圆形形态，并部分从培养皿上脱离，便于在后续分析中进行识别（图2）。

有丝分裂细胞的保存及细胞器可视化固定条件

讨论

有丝分裂过程中脂滴（LDs）的重新分布表明，其定位并非随机，而是与细胞骨架的重组和细胞周期进程相协调。特别是，脂滴被排除在纺锤体区域之外，可能反映了有丝分裂纺锤体组装所施加的空间限制，或维持细胞分裂期间细胞器分离的主动运输机制。在本研究中，我们提供了一种简单且可重复的方法，用于制备有丝分裂细胞以进行免疫荧光染色，同时在细胞分裂过程中可视化脂滴。为了可视化脂滴，我们使用了两种光谱不同的中性脂质染料（绿色和红色荧光）。除了这些染料已被证实的应用外，选择它们还基于其光谱特性，可灵活地与其他荧光标记物组合使用。具体而言，这些染料可在绿色或红色通道中标记脂滴，同时在多色成像实验中最大限度地减少与其他细胞器标记物的光谱重叠。

该方法有两个关键特征值得注意。首先，通过将细胞周期同步于G2/M边界并随后释放细胞周期，可使大量细胞在短时间内进入有丝分裂期。由于有丝分裂细胞在异步生长的细胞群体中仅占很小比例（图1），若不同步化，直接观察有丝分裂细胞及其细胞内结构本质上效率很低。本方法有助于高效地观察有丝分裂细胞以及细胞周期依赖性的细胞内结构变...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶/EDTA	和光	201-16945	细胞解离
10 cm 培养皿	康宁	430167	细胞培养
35 mm 组织培养皿	IWAKI	3000-035	细胞培养
6 cm 组织培养皿	IWAKI	3010-060	细胞培养
抗PLIN2（ADRP）抗体	Proteintech	15294-1-AP	脂滴标记物
抗PLIN3（TIP47）抗体	Proteintech	10694-1-AP	脂滴标记物
抗-α-tubulin 抗体	Sigma-Aldrich	T6199	有丝分裂纺锤体标记物
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	中性脂质染色
瓶顶滤器（0.22 μm)	NEST	WNB343001	OA的无菌过滤–BSA 溶液
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A8022	封闭剂
透明指甲油	市售的	不适用	封片
共聚焦显微镜	Olympus	FV1200	高分辨率成像
DAPI	Dojindo	340-07971	细胞核染色
D-PBS（–)	和光	049-29793	细胞培养
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM）	和光	041-30081	细胞培养基
乙醇（99.5%）	和光	057-00456	油酸溶剂
脂肪酸–游离 BSA	Sigma-Aldrich	A7030	油酸载体蛋白
胎牛血清	Gibco	10270-106	培养基添加剂
荧光二抗（Alexa Fluor–偶联的	市售的	不适用	免疫荧光用物种特异性二抗
FV10-ASW 软件	Olympus	不适用	图像采集与处理
玻璃盖玻片（φ15 mm	Matsunami	2-176-03	用于显微镜观察的细胞接种
载玻片	Matsunami	SFF-001	用于固定盖玻片的载玻片
戊二醛（25% 溶液）	和光	073-00536	PLIN3的替代固定方法
HuH7 细胞	JCRB细胞库	JCRB0403	人肝癌细胞系
LipidTOX 红色中性脂质染料	Invitrogen	H34476	替代性脂滴染色剂
氮气（N₂）2)	市售的	不适用	乙醇蒸发
油酸	Sigma-Aldrich	O1383	用于油酸的制备–BSA偶联物
4% 多聚甲醛（PBS 配制）	Nacalai Tesque	09154-85	固定
青霉素–链霉素	Gibco	15140-122	抗生素
磷酸盐缓冲液（×10)	不适用	不适用	可替换为任意供应商的产品
RO-3306	Sigma-Aldrich	SML0569	CDK1抑制剂用于G2/M期同步化
SlowFade Diamond 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	S36963	封片剂
氯化钠（NaCl）	和光	191-01665	150 mM NaCl 溶液的配制
氢氧化钠（NaOH）	和光	080-01061	用于油酸的皂化反应
Tali 细胞分析载玻片	赛默飞世尔科技	T10794	用于细胞周期分析
Tali 图像流式细胞仪	赛默飞世尔科技	不适用	用于细胞周期分析
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	细胞通透化
宽场荧光显微镜	KEYENCE	BZ-9000	有丝分裂细胞的快速筛选