玉米减数细胞中的三维免疫定位

摘要

这种在雄性玉米减数细胞中的免疫定位方案在减数分裂期间保持细胞的三维完整性。它允许动态追踪保存的副甲醛固定材料中多达三种独立抗体的细胞内定位，此外还有用于染色DNA的DAPI。

摘要

在减数分裂前期I，染色体的物理结构在发育阶段间差异很大，幸运的是，这些阶段特异性结构允许正确识别这些经典减数分裂阶段，分别称为细丝（如“细丝”）、合子体（如“耦合丝”）、厚质（如“粗丝”）、双层酶（如“双丝”）和二动酶（如“排斥运动”）。对前期I中发生的若干细胞遗传现象（如重组、配对和突触）进行视觉分析，需要高度可靠的免疫定位技术。与传统的扩散和压碎技术抑制所有亚细胞和亚核信息不同，这里描述的三维保护程序允许关键减数分裂蛋白在其原生亚细胞位置位点（细胞质、核和亚核：常染色质、异染色质和核蛋白）中保存。因此，本方案描述了如何高效固定减数分裂花药，从花药中解剖并释放减数细胞，并同时对玉米雄性减数细胞中的三种关键蛋白进行免疫定位。

引言

减数分裂是调控模式植物和作物性状传递的关键过程;因此，能够一致且忠实地可视化蛋白质定位的简单显微镜方法，有助于理解这些性状如何更高效地传递。遗憾的是，减数细胞内蛋白质定位的可视化方式^因所用技术而有很大差异，^1,2。因此，该方案的目标是提供一种简单、可重复的方法，消除减数细胞观察过程中出现的伪影。例如，长期以来人们都认为观察减数分裂染色体是一个精细过程，可以通过简单的压碎或更破坏性的^{扩散技术来}实现。在拟南芥中，研究人员通常采用涂抹方法，利用卡诺伊定弦剂（乙醇和醋酸的3：1混合物）以及多种洗涤剂如Lipsol、Tween-20和TritonX-100，以及含有纤维素酶、果胶酶和细胞螺旋酶的酶混合物，以分解细胞，使其在小染色体上实现有效的免疫定位 ^1,2.这些技术将三维染色体构象转换为二维结构，从而在单幅图像中快速观察所有人工分散的染色体。经受这些严苛处理的染色体某些特征可能显现;然而，它们往往无法代表细胞和染色体在⁶体内的典型行为。通过二维扩散技术，在包括^{玉米7、8、9、10、11}在内的多种植物中，可以快速且广泛地检测到多达两种抗体。

尽管传统二维技术便利，但现在已承认某些现象对破坏性方法敏感，若细胞、细胞核或染色体在扩散或压碎过程中受损，则无法被观察到。例如，RAD50蛋白在细丝质阶段或着丝粒耦合（轻质细胞/接合细胞）期间从细胞质向细胞核的移动，仅在完整的3D减数细胞中被检测到¹²。这里，读者将获得一个详细的4天三维方案，利用固定在4%对甲醛中的花药，免疫定位玉米雄性减数细胞中的三种关键蛋白，从而保持其结构完整性。与类似的玉米3D免疫定位方法^{相比，我们}增加了实用笔记和研究者故障排除技巧。该方案将惠及对研究各种减数分裂过程（如突发体复合体对减数分裂重组控制）感兴趣的植物生物学家和育种者。

方案

注意：使用适当的个人防护装备和化学面罩处理甲醛和丙烯酰胺;两者都是有毒的（丙烯酰胺在聚合前也具有神经毒性）。研究中使用的所有材料均列于 材料表中。

1. 固定玉米花药以保持减数细胞的完整结构

1. 使用V13阶段的玉米植株，茎内仍有花序生长。在减数分裂花药固定的一周内，戴手套并轻轻按压肿块，判断茎是否足够柔软以适合切开。
   注意：该固定和免疫定位方案可用于玉米和拟 南芥 减数分裂花蕾（小于400微米）。但玉米的情况，取决于品种和季节（春季生长更快），参考近交品系B73从种植大约需要8周，而早花近交系A344只需6周。
2. 缓冲剂的准备。
   注意：化学固定前一天，准备以下工作溶液，仔细操作，并正确贴标签。
   1. 制备100毫升10x缓冲液A（BA）盐，加入4.53克PIPES（吡哌嗪-N，N′-bis（2-乙磺酸，最终浓度150 mM）、5.96 g KCl（最终浓度800 mM）、1.17 g NaCl（最终浓度200 mM）、0.74 g EDTA（最终浓度20 mM）、0.19 g EGTA（最终浓度5 mM）和90 mL H₂O， 先用 KOH 将 pH 调整到 6.8–7，然后将体积调整为 100 mL。
   2. 最后，使用一次性快速流无菌过滤器，PES孔径为0.45微米（保持在4°C但不要冷冻;可储存数月）。
   3. 准备：
      -50 mM管道（pH值调整为7，含KOH）。
      - 0.4 M浓度的精矿储备（先溶解于50 mM管中，用KOH调节pH至7,50 μL分量保持在-20°C）。
      - 0.4 M浓度的沙瓜咪定储备（溶解于50毫米管中，pH值调整至7并加KOH，冷冻125微升，温度为-20°C）。
      - 二硫代特醇（DTT）1 M库存（溶解于0.01 M醋酸钠中，pH值为5.2，冷冻100微升，-20°C）。
      - 山梨醇 2 M，保持在 4 °C 下。
3. 制备50毫升2x缓冲液A（BA），冰上，使用10毫升10x缓冲液A盐（保持在4°C），50微升精子（0.4米置于50 mM管中，pH调至7，含KOH），125微升生精（0.4 M置于50 mM管，pH调至7，含KOH）， 100微升DTT（1 M置于0.01 M醋酸钠中，pH值5.2）强烈涡旋以溶解;而且不要加热。
   1. 然后加入16毫升2M山梨醇。用无菌水将最终体积调整为50毫升。使用一次性快速流动无菌过滤器进行过滤器消毒，并在4°C下保存。
4. 准备一个由5到10张加湿纸巾放入塑料盒中的湿润室。确认盖子密封良好。清除多余的水分。
5. 然后，将以下物品放入托盘：湿气箱、剃须刀片、细镊子（事先用70%乙醇消毒）、一小瓶无菌水和遮蔽胶带。将托盘及其内容物带到步骤1.1检查的玉米植株。
6. 用剃刀片在花序高度割开凹凸不平的茎。主要的流苏枝条以及花序的侧枝可用于收获减数分裂花。
   注意：这些流苏枝条含有感兴趣的花蕾，用于采集减数分裂花药。每朵花有六个花药，通常使用三个较大的上部花药进行分析。花药的大致大小和颜色与每个减数分裂阶段相关。几乎透明的花药长约1毫米，位于瘦体阶段，半透明花药长1.5毫米，位于合子期，白色花药长2毫米，长>毫米的黄色花药可能含有减数细胞，包括二叶细胞、四分体和完成配子形成的花粉粒。需要注意的是，玉米遗传背景中另一种长度-阶段相关性可能有所不同，环境因素（如高温）可能加速减数分裂进展并改变这种关系。建议研究人员验证每种特定玉米基因型和生长条件的体型阶段相关性（通过乙酰菲碱压碎，见1.6）。
7. 用细镊子解剖并仔细收集花序的侧枝，并用湿润腔室的纸巾包裹。
   注意：经过一定练习，只需在茎上切一个3–4厘米的短线性切口即可拔出减数分裂流苏的枝条。你可以用标准遮蔽胶带将切口缠绕三到四圈，这样之后可以用剩余未解剖的花序收获同一株植物。组织会持续生长，之后可能用于授粉。
8. 保持腔室温度。仅使用含有减数分裂阶段带花药的花序枝条。确保用一半的湿毛巾覆盖树枝，但不要让它们浸入水中。
9. 毛巾干了再加湿。在花药解剖前关闭箱子，最好直到开始采集花药前30分钟。
10. 利用带有校准天平的双眼立体显微镜，将花药中的新鲜花药收集到2毫升1倍BA中，置于35毫米培养皿中，确保通过药药大小和颜色的代理准确识别减数分裂阶段。
    注意：为了准确确定采样花药中的减数细胞阶段，每个花瓣需快速分析三个同步花药中的一个，采用3：1乙醇-醋酸固定、乙酰萲染色和传统南瓜显微镜¹³。
11. 将4%甲醛固定剂用1x硼砂和0.0025%的Tween-20定配。
    注意：对于3毫升，添加750微升甲醛16%、750微升氢_2O、1.5毫升2次BA和7.5微升Tween-20,1%浓度。
12. 取出初始BA缓冲液，将3毫升新鲜固定液加入分阶段花药中，并在新的35毫米培养皿中固定45分钟，并用防腐膜密封以防止甲醛蒸发，然后将其放置在一个较大的培养皿上，置于旋转摇床上（设定为40–60转/分钟， 或0.2 × g）。在室温下做。花药应微微旋转以保持良好固定。它们通常漂浮在水面上。
13. 用3毫升1倍巴尔基尔冲洗，然后将样本转移到一个小型培养皿中，置于室温旋转摇床（40–60转/分钟）上，浸泡45分钟。
14. 用干净的镊子将花药转移到一个35毫米的小培养皿中，内含新鲜3毫升1X BA。用防腐剂密封培养皿。然后将小培养皿放入培养皿中，用铝箔覆盖以保持黑暗，并置于4°C直到使用。如果需要，你可以保存几个月。

2. 将玉米减数细胞嵌入聚丙烯酰胺夹心垫中

第一天：3D幻灯片准备

1. 通过混合等量（1：1）丙烯酰胺和2倍巴胺液，制备2毫升丙烯酰胺溶液。在加入亚硫酸钠（NaS）和过硫酸铵（APS）之前，先在真空下将丙烯酰胺溶液脱气5–10分钟。
2. 将丙烯酰胺和2杯BA 1：1比例混合物分装，方法是将100微升液体移液到1.5毫升管中。
   你准备的管子数量取决于你准备的载玻片数量。
3. 做1毫升，1次巴尔。
4. 将2厘米×2厘米的防腐剂片覆盖在培养皿上，然后放入解剖显微镜下。将50微升含花药的BA溶液移液到对石膏上。用剪刀修剪移液器尖端，以便更方便地送液。
   1. 移液器将25微升BA溶液移液到其他地方的对剂膜上。
5. 用镊子固定花药，用手术刀切开花药尖端，轻轻挤出减数细胞。用移液器轻柔地将减数细胞转移到25微升BA滴剂中，轻轻混合。
6. 将减数细胞混合物中的10微升移液器移至单独的盖层。
7. 迅速将5微升20%（0.2g/1mL）NaS和5微升20%（0.2g/1mL）APS移液器移入1.5mL管，内含丙烯酰胺/2x缓冲液A。
8. 迅速将上述混合物5微升移液器移至盖玻片上，与减数细胞混合。在上面放一个聚L-赖氨酸盖盖，但要旋转45度。只使用一张聚L-赖氨酸封面（无论是商业获得的，还是将盖片浸泡在聚L-赖氨酸溶液中，置于新的干净培养皿边缘几分钟后晾干）有助于聚合后释放完整的垫片。盖片会迅速从溶液中取出并晾干后再使用。对于超分辨率显微镜，^{必须使用具有}标准厚度（≤170 nm）的高性能盖片。
9. 请在30–50分钟内不要触碰盖片，以便样品在室温下完全聚合（更快的聚合过程会缩短焊盘干燥时间，导致最终质量不理想）。
10. 每张你想准备的幻灯片重复步骤“2.6–2.9”。
11. 用剃刀片小心地分离所有盖片。将所有盖片朝上放置于聚丙烯酰胺垫（或大部分垫板）上，置于6孔板中。
12. 用棉片和2毫升1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）一起清洗每张盖片10分钟。重复一次洗涤，室温下总洗涤时间为20分钟。
13. 通过混合49.4毫升PBS 1x、100微升EDTA 0.5 M和500微升Triton，制备50毫升。
14. 用垫片冲洗每张盖片，浸泡在1毫升1倍PBS中，补充1 mM EDTA和1% Triton，室温下浸泡2小时。
15. 准备一批新鲜的阻断缓冲液，含1xPBS、1mM EDTA、0.1%Tween-20和3% BSA（每片1毫升）。对于50毫升阻断缓冲液，混合44毫升PBS 1x、100微升EDTA 0.5 M、5毫升1%Tween-20溶液和1.5克BSA。BSA作为阻断剂而优于驴血清，因为它有助于在使用多种一级和二级抗体时减少非特异性信号。

3. 免疫定位

1. 在所需稀释点下，使用阻断缓冲液制备一级抗体。根据原版抗体在一起使用时产生不同信号的能力来组合它们。它们应来自不同的生物体，如兔子、大鼠、豚鼠或鸡，这些生物体可以通过特定的荧光标记二级抗体识别。避免使用驴或山羊抗体，因为它们是作为二级抗体使用。我们建议使用单一种二级抗体（例如 图1中所示的实验中的山羊）。
2. 将50微升稀释的原抗加入每个盖片中心并垫片。
   在井间加水以减缓蒸发。把盘子放进一个带盖的塑料箱里。过夜离开。

第二天：洗涤

3. 准备500毫升洗涤缓冲液（1xPBS + 0.1% Tween-20 + 1 mM EDTA）。
4. 用移液器抽吸，将隔夜溶液从井中抽出。
5. 用垫子快速用1毫升洗涤液清洗每个盖片两次，然后从井中取出。
6. 再用移液器吸取1毫升，每张盖片带垫子，静置室温1小时。
   再重复7次。（共8小时）
7. 最终清洗后，在井间加水，盖好板子，放在潮湿的腔室中过夜。

第3天：二次抗体、洗涤剂和载玻片安装

8. 通过在阻断缓冲液中以1：50的比例稀释二级抗体来制备。
   吸入洗涤液。用移液器将50微升稀释的二级抗体滴入每个垫子中心。
   注意：每种二级抗体应与发射波长不重叠的不同荧光染料配合使用。例如，一种二级抗体应标记为AlexaFluor488（绿色），下一种用AlexaFluor555（橙色），第三种用AlexaFluor647（远红色），后者可与DAPI（461 nM激发，蓝色）结合。其他荧光染料，如DyLight（由Dyomics GmbH生产），也可用。此外，所有这些二级抗体不应与原一抗体混合物中使用的其他物种发生交叉反应。例如，抗兔二级抗体应交叉适配，选择性地识别兔子抗体，不识别大鼠或豚鼠抗体。所有二级抗体也是如此。在进行共免疫定位时，应使用设计良好的实验来同时验证所有这些要求。
9. 在两口井之间加水，在湿气室放置一块盘子，并在室温下放置2小时。
10. 从井中抽取溶液。
11. 每孔使用1毫升进行四次洗涤，每次1小时，室温下（共4小时）。
12. 用1毫升1xPBS在室温下清洗每个井10分钟，然后重复两次。（总时长30分钟）
13. 将DAPI稀释于1xPBS中。
14. 将最终浓度为1 μg/mL的DAPI（溶于水的DAPI粉末）染色，在室温下浸泡30分钟，然后放入500 μL/孔。
15. 将ProLong™ Gold防褪色剂从4°C冷冻柜取出，让它解冻并达到室温。
16. 在室温下，1毫升/孔用1毫升，用1xPBS洗涤30分钟。再做两次。（总时长1小时30分钟）
17. 去除最后的洗涤液。
18. 然后在每个垫子中间滴两滴ProLong™ Gold防褪色剂。
19. 在每张载玻片上安装盖片，标记每片载玻片，用细镊子将盖片从井中提起，然后缓慢放置到载玻片上。用细镊子慢慢放下第二个盖套套到第一个套子上。用吸尘器去除盖玻片边缘多余的甘油。用两层指甲油封住盖片边缘。
20. 如果切片未立即用荧光显微镜检查。将它们存放在-20°C的冷冻室中，避免光线，等待观察。之后，将玻片在室温下水平放在暗处放置1小时，以防止凝结。

第4天：显微镜观察

21. 在合适的激发波长和滤光片下观察滑动。标准共軛焦显微镜已足够，但建议使用60倍物镜，利用每0.2微米的z堆栈实现整个细胞的三维成像，并使用Applied Precision SoftWoRx^® 软件进行顺序图像采集和解卷积处理。

结果

利用该方法，我们可以同时观察玉米中三种关键减数分裂蛋白的定位模式（见图1）。减数分裂蛋白ABSENCE OF FIRST DIVISION 1（AFD1）是减数分裂内聚蛋白复合体中α-Kleisin REC8亚基的同源蛋白。ASY1（ASY1）是关键的轴向元素，而ZYPPER1（ZYP1）是突触复合体¹⁵的横向元素。DAPI染色显示细胞核和染色质染色清晰，有助于识别减数分裂亚段，同时也显示质体和线粒体DNA的原生细胞质染色较淡（图1A和C，DAPI 通道第二列箭头）。同样，该协议不仅允许AFD1、ASY1和ZYP1在染色体上定位，还能在细质前期的细胞质中定位（见图1A）。在后期阶段，信号集中在染色体上，但在完全突触前，细胞质中仍保留大量ZYP1...

讨论

该方案相比其他方案具有关键优势，能够保留减数分裂染色体蛋白加载的重要三维数据。这些特征无法通过常规^{展开技术保持1,2}。然而，该方案存在两个局限性：相比于一天内进行的常规传播技术，速度较慢且技术要求较高。相比之下，我们的方案需要四天的工作，主要因为需要大量清洗步骤和过夜潜伏一级和二级抗体，若缩短这些时间，会损失良好的信号与背景比。

在技术层面，相较于之前的3D协议8^、12、15的改进，依赖于能够同时可视化三种蛋白质，而不仅仅是两种。如图1所示，非特异性被克服，因为每种蛋白质都有独特的图像特征。然而，这一结果依赖于对不同物种中单个抗体及其原始设计的先前分析，以...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL microtubes Axygen	康宁	MCT-150-C
15 mL Falcon管	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon管	Thermo Fisher Scientific	339652
6孔板Falcon聚苯乙烯微板	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
60%乙酸	Thermo Fisher Scientific	A38-212
丙烯酰胺30% 和双丙烯酰胺溶液，29:1	Biorad	1610157
铝箔	Reynolds	U07211R0
过硫酸铵(APS)	默克	A3678
双目立体显微镜	NA	NA
牛血清白蛋白(BSA)	默克	A9418
DAPI	默克	D9542
DelltaVision显微镜	奥林巴斯	NA
蒸馏水	NA	NA
带0.45微米孔径PES滤芯的一次性过滤器单元	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
FST Dumont SS细镊子	Fine Science Tools	11200-33
山羊(IgG H+L)高度交叉吸附的抗大鼠标记AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
山羊(IgG H+L)高度交叉吸附的抗兔标记AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
山羊(IgG H+L)高度交叉吸附的抗豚鼠标记AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
手套	默克	Z412392
种植室/温室/或实验室	NA	NA
DTT	默克	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
3M胶带	Fisher Scientific	19-047-259
玉米种子	NA
显微镜22 x 22 mm-1,5玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-542-B
显微镜22 x 22 mm-H盖玻片	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
显微镜玻片	Fisher Scientific	22-230-900
显微镜玻片盒	Fisher Scientific,	03-448-9
P20、P200、P1000微移液器	默克	CLS4069
NaCl	默克	S7653
指甲油	电子显微镜科学	72180
纸巾	默克	Z188956
Parafilm	默克	P7668
16%甲醛溶液	电子显微镜级	15710
PBS	默克	P4474
带盖的塑料盒	Tupperware	NA
聚-L-赖氨酸	默克	P4707
初级抗体(大鼠抗ZmAFD1，兔抗ZmASY1，豚鼠抗ZmZYP1)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
培养皿(D x H: 35 mm x 10 mm)	康宁	351008
常规尺寸培养皿	默克	P5731
PIPES	默克	P1851
(0.5-10 uL)无菌移液器吸头	默克/康宁	AXYT300
(200 uL)无菌移液器吸头	默克/康宁	AXYT200Y
(1000 uL)无菌移液器吸头	默克/康宁	AXYT1000BRS
单刃剃须刀刀片	Fisher Scientific	12-640
摇床	NA	NA
精胺	默克	85590
精丁	默克	S2626
山梨醇	默克	S8143
Tween-20	默克	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
超纯丙烯酰胺	Invitrogen	15512023
真空泵