维生素C辅助的芬顿氧化增强氧化杀伤能力 幽门螺杆菌体外实验

摘要

本研究探讨维生素C如何调节芬顿反应的动力学行为 体外 条件。化学染料探针和细菌检测表明，可控的维生素C给药会改变反应的氧化行为，并与增强的抗菌活性相关 幽门螺杆菌 在简化的模型系统中。

摘要

幽门螺杆菌 感染仍是全球主要的健康负担，而抗生素耐药性的日益普遍凸显了开发替代性抗菌策略的迫切需求。本研究探讨了维生素C给药是否能够调节芬顿氧化反应，并增强针对细菌的氧化性抗菌活性 H. pylori 在特定酸性条件下 体外 条件。采用酸性橙7脱色作为间接化学检测方法，以及对香豆酸荧光法作为相对指标来评估羟基自由基相关产物在添加维生素C的铁-过氧化氢反应中的生成情况，以评价氧化活性。抗菌效果通过将标准化的 H. pylori 在pH为3的含尿素盐水中，将悬液与过氧化氢和亚铁离子共同孵育，同时逐步添加或不添加维生素C，随后进行菌落形成单位计数。维生素C的添加改变了氧化反应的读数，并与较常规芬顿反应更显著的活菌减少相关。使用去铁胺和硫脲进行的挽救实验减弱了抗菌活性，支持抗菌作用与铁介导及自由基相关的氧化过程相关的假说。活/死荧光染色和扫描电子显微镜提供了与菌落形成单位（CFU）计数结果一致的定性可视化观察。综上所述，这些发现表明，可控的维生素C给药可调节基于芬顿的氧化反应，并增强对细菌的抗菌活性 H. pylori 在简化的酸性条件下 体外 模型

引言

H. pylori 是一种革兰氏阴性螺旋状细菌，属于Helicobacter属。人群健康研究表明，该菌在不同地理区域、性别和年龄人群中感染率均较高，全球感染率约为50%¹。国际癌症研究机构（IARC）已将H. pylori列为1类致癌物，强调其与胃癌及黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤的密切关联。目前，H. pylori感染的临床管理主要依赖药物治疗方案。研究最为广泛的药物包括质子泵抑制剂（PPIs），可抑制胃酸分泌；铋剂化合物，可增强抗生素疗效；以及阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑等抗生素。然而，单药治疗已被证明不足以实现彻底根除，因此临床上广泛采用联合治疗方案，即通常所说的三联疗法。该方案通常包含一种PPI、克拉霉素以及阿莫西林或甲硝唑中的一种，疗程约为两周³。随着耐药性H. pylori菌株的日益普遍，三联疗法的疗效已显著下降，促使四联疗法的推广应用，即联合使用PPI、铋剂和两种抗生素³。尽管如此，这些治疗方案仍从根本上依赖抗生素，而抗生素耐药性仍是临床管理中的主要挑战^4,5。因此，探索不依赖抗生素的替代性抗菌策略正受到越来越多的关注。

除了其直接的病理作....

方案

伦理声明
本研究是一项 体外 本研究为细菌学研究，未涉及人类受试者、动物实验或患者来源材料。因此，无需获得机构审查委员会批准和动物伦理审批。

维生素C辅助Fenton体系中AO7降解的评价
为了评估维生素C对Fenton反应可观测氧化行为的影响，采用酸性橙7（AO7）的降解作为氧化活性的间接化学检测指标。该检测方法不特异性地定量单个活性氧物种。配制100 mL浓度为5 mg/L的AO7溶液，并将溶液pH值调节至3。加入H₂O₂和FeSO₄，使其终浓度分别为2.2 mM和0.055 mM。维生素C可在反应启动时一次性加入，或采用三步分次添加的方式加入。在剂量-反应实验中，使用的Vc:Fe²⁺摩尔比分别为0、0.12、0.24、0.48、2、4、6和8，当FeSO₄浓度为0.055 mM时，对应的维生素C终浓度分别为0、0.0066、0.0132、0.0264、0.110、0.220、0.330和0.440 mM。在三步添加条件下，将相同总量的维生素C均分为三等份，并在反应启动后的3、5和7分钟时各加入一份。例如，在Vc:Fe²⁺比为0.48时，每份添加的维生素C浓度为0.0088 mM，最终总浓度为0.0264 mM。

在避光条件下持续搅拌反应溶液10分钟，同时保持温度低....

结果

维生素C辅助芬顿体系中AO7降解效果的评价
使用酸性橙7（AO7）降解作为化学探针，研究维生素C在酸性条件下对芬顿反应可观察氧化行为的影响。在不添加维生素C的情况下，传统芬顿体系在10分钟反应时间内仅导致部分AO7降解。当引入维生素C后，染料降解程度增加，且其效果依赖于维生素C与Fe²⁺之间的摩尔比。在维生素C与Fe²⁺的摩尔比较低时²⁺ 比例下，与无维生素C条件相比，AO7降解率提高。在Vc:Fe比例约为73.5%时，观察到最大降解效率。²⁺比值为0.24，而在不添加维生素C的条件下，降解率约为51.7%。进一步提高维生素C浓度并未带来降解效率的进一步提升，反而伴随降解效率的逐渐降低。

随后在保持维生素C总量不变的前提下，评估了一种逐步递增的维生素C给药策略。与单次给药相比，在其他条件相同的情况下，逐步添加维生素C可使AO7的降解速率更高。当维生素C与Fe²⁺的摩尔比超过约0.48时，进一步增加维生素C仅使降解效率发生微小变化。这些结果表明，在Fenton体系中，维生素C的.......

讨论

本研究旨在考察在特定酸性条件下，维生素C的给药是否能够调节基于芬顿反应体系的氧化行为及抗菌效应 体外 条件。在化学和微生物测定中，逐步添加维生素C改变了可观察的反应行为，并与更强的抗细菌活性相关 H. pylori 在测试条件下，该体系产生的羟基自由基产量高于传统的芬顿反应。重要的是，该体系应被视为一种简化的酸性-盐-尿素模型，而非完整的生理胃部微环境。该模型旨在为测试基于芬顿反应的氧化活性提供可控的化学和微生物环境，而不模拟胃黏液、宿主细胞、免疫因子、缓冲能力或胃内容物的异质组成。

AO7的降解被用作氧化活性的间接化学指标，而非对特定活性氧物种的直接测定。在此体系中，添加维生素C在选定的Vc:Fe²⁺比例下增强了AO7的降解，而较高浓度的维生素C则降低了降解效率。这种浓度依赖性模式与维生素C的双重生物化学作用一致。在适当的氧化还原条件下，维生素C可作为还原剂，促进Fe³⁺还原为Fe²⁺，支持芬顿循环；然而，在过量存在或不同反应条件下，它也可能发挥抗氧化剂或自由基清除剂的作用，从而.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酸性橙7（AO7）	阿拉丁试剂（上海）有限公司	O113230	用作AO7降解实验的模型染料。
牛血清白蛋白（BSA）	上海麦克林生化科技有限公司	B885114	用于基质干扰实验。
脑心浸液（BHI）肉汤粉末	四川华派生物工程有限公司	N/A	用于细菌培养和冷冻保存。
哥伦比亚血琼脂平板（5%羊血）	常德碧凯美生物技术有限公司	110701028.0	用于细菌培养和菌落形成单位（CFU）计数。
临界点干燥仪（EM CPD300）	徕卡显微系统公司	EM CPD300	用于梯度乙醇脱水后的扫描电镜（SEM）样品制备。
去铁胺（DFO）	上海麦克林生化科技有限公司	D873692	在挽救实验中用作铁螯合剂。
对苯二甲酸二钠	上海麦克林生化科技有限公司	D835937	用作TA荧光探针以检测与羟基自由基（•OH）相关的信号。
无水乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	用于制备梯度乙醇系列，以进行扫描电镜样品脱水。
荧光显微镜（DMi8）	徕卡显微系统公司	DMi8	用于活/死细菌的荧光成像。
戊二醛溶液	Sigma-Aldrich	G5882	用于扫描电镜前细菌样品的固定。
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	用于BHI肉汤中细菌的冷冻保存。
GraphPad Prism 10	GraphPad Software, LLC	Prism 10	用于统计分析和绘图。
Helicobacter pylori 菌株 ATCC 26695	美国模式培养物集存库（ATCC）	700392	用于有限的跨菌株验证的附加参考菌株。
Helicobacter pylori 菌株 ATCC 43504	美国模式培养物集存库（ATCC）	43504	用于有限的跨菌株验证的附加参考菌株。
Helicobacter pylori 菌株 G27	四川大学华西医院感染性疾病中心	N/A	用于菌落计数、挽救实验、基质干扰实验、活/死染色和扫描电镜的主要菌株。
过氧化氢溶液	Sigma-Aldrich	H1009	在芬顿反应实验中用作过氧化物底物。
硫酸亚铁一水合物（FeSO4·H2O）	上海麦克林生化科技有限公司	F904376	在芬顿反应中用作亚铁离子来源。
酶标仪（Synergy H1）	安捷伦 BioTek	Synergy H1	用于测量TA衍生的荧光（激发/发射波长 = 315/425 nm）。
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Sigma-Aldrich	P4417	用于涂布前的处理后稀释/中和以及样品洗涤。
生理盐水（0.9%氯化钠溶液）	Millipore	567442	用于细菌悬浮液制备及酸性盐水-尿素模型的配制。
扫描电子显微镜（INSPECT F）	FEI公司	INSPECT F	用于细菌形态学分析。
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S5881	用于碱化TA实验等分试样并稳定荧光。
溅射镀膜仪（EM ACE200）	徕卡显微系统公司	EM ACE200	用于扫描电镜成像前施加薄金涂层。
SYTO 9/PI 活/死细菌双染试剂盒	上海茂康生物技术有限公司	MX4234	用于基于荧光的活/死细菌染色。
硫脲	上海麦克林生化科技有限公司	T81602	在挽救实验中用作自由基清除剂。
尿素	上海麦克林生化科技有限公司	U820349	用于制备酸性盐水-尿素模型。
紫外-可见分光光度计（UV-2600i Plus）	岛津公司	UV-2600i Plus	用于在483 nm处测定AO7的吸光度。
维生素C（L-抗坏血酸）	上海麦克林生化科技有限公司	A800295	在维生素C辅助的芬顿体系中用作还原剂。