维生素C辅助的芬顿氧化增强氧化杀伤能力 幽门螺杆菌体外实验

摘要

本研究探讨维生素C如何调节芬顿反应的动力学行为 体外 条件。化学染料探针和细菌检测表明，可控的维生素C给药会改变反应的氧化行为，并与增强的抗菌活性相关 幽门螺杆菌 在简化的模型系统中。

摘要

幽门螺杆菌 感染仍是全球主要的健康负担，而抗生素耐药性的日益普遍凸显了开发替代性抗菌策略的迫切需求。本研究探讨了维生素C给药是否能够调节芬顿氧化反应，并增强针对细菌的氧化性抗菌活性 H. pylori 在特定酸性条件下 体外 条件。采用酸性橙7脱色作为间接化学检测方法，以及对香豆酸荧光法作为相对指标来评估羟基自由基相关产物在添加维生素C的铁-过氧化氢反应中的生成情况，以评价氧化活性。抗菌效果通过将标准化的 H. pylori 在pH为3的含尿素盐水中，将悬液与过氧化氢和亚铁离子共同孵育，同时逐步添加或不添加维生素C，随后进行菌落形成单位计数。维生素C的添加改变了氧化反应的读数，并与较常规芬顿反应更显著的活菌减少相关。使用去铁胺和硫脲进行的挽救实验减弱了抗菌活性，支持抗菌作用与铁介导及自由基相关的氧化过程相关的假说。活/死荧光染色和扫描电子显微镜提供了与菌落形成单位（CFU）计数结果一致的定性可视化观察。综上所述，这些发现表明，可控的维生素C给药可调节基于芬顿的氧化反应，并增强对细菌的抗菌活性 H. pylori 在简化的酸性条件下 体外 模型

引言

H. pylori 是一种革兰氏阴性螺旋状细菌，属于Helicobacter属。人群健康研究表明，该菌在不同地理区域、性别和年龄人群中感染率均较高，全球感染率约为50%¹。国际癌症研究机构（IARC）已将H. pylori列为1类致癌物，强调其与胃癌及黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤的密切关联。目前，H. pylori感染的临床管理主要依赖药物治疗方案。研究最为广泛的药物包括质子泵抑制剂（PPIs），可抑制胃酸分泌；铋剂化合物，可增强抗生素疗效；以及阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑等抗生素。然而，单药治疗已被证明不足以实现彻底根除，因此临床上广泛采用联合治疗方案，即通常所说的三联疗法。该方案通常包含一种PPI、克拉霉素以及阿莫西林或甲硝唑中的一种，疗程约为两周³。随着耐药性H. pylori菌株的日益普遍，三联疗法的疗效已显著下降，促使四联疗法的推广应用，即联合使用PPI、铋剂和两种抗生素³。尽管如此，这些治疗方案仍从根本上依赖抗生素，而抗生素耐药性仍是临床管理中的主要挑战^4,5。因此，探索不依赖抗生素的替代性抗菌策略正受到越来越多的关注。

除了其直接的病理作用外，H. pylori 感染还与胃部微量营养素稳态的改变有关。临床和流行病学研究报道，在感染者胃液和血清中维生素C浓度降低⁶，这可能与黏膜炎症、分泌功能受损或氧化消耗增加有关^7,8,9。同时，H. pylori 感染通过多种机制与铁缺乏相关，包括胃酸减少、膳食铁吸收障碍以及细菌对可利用铁的竞争¹⁰。这些发现凸显了伴随 H. pylori 感染的复杂生化环境，并强调了在酸性胃环境中氧化还原和铁相关过程的重要性。

活性氧（ROS）因其氧化特性而在抗菌研究中受到广泛关注。ROS 是指在氧气部分还原过程中形成的一类化学性质活泼的分子，包括超氧阴离子（O₂•⁻）、过氧化氢（H₂O₂）、单线态氧（¹O₂）和羟基自由基（•OH）等。在生物系统中，ROS 广泛参与正常的生理代谢过程，并对多种细胞调控活动至关重要¹¹。值得注意的是，大量研究表明，过量的 ROS 可通过脂质过氧化作用破坏细菌细胞膜，导致膜结构与功能的改变，最终引起细菌失活¹²。因此，基于 ROS 的抗菌策略已引起关注，被视为研究针对 H. pylori 的非抗生素抗菌效应的潜在途径^13,14,15,16。在多种 ROS 生成方法中，芬顿反应因其高效的自由基生成能力而受到广泛关注。芬顿反应是一种高级氧化工艺¹⁷，在酸性条件下，亚铁离子（Fe²⁺）与 H₂O₂ 反应生成具有强氧化能力的羟基自由基（•OH），后者可氧化细胞内生物分子。

Fe²⁺ +H→Fe³⁺+•OH+OH^-

Fe³⁺ + H → Fe²⁺ + •OOH + H⁺

H₂O→OH+•OOH+H₂O

具体而言，在 pH 约为 2.8–4.5 的条件下，H₂O₂ 在 Fe²⁺ 催化下发生分解，生成 •OH，同时 Fe²⁺ 被氧化为 Fe³⁺。随后，Fe³⁺ 与 H₂O₂ 反应重新生成 Fe²⁺，从而建立 Fe²⁺/Fe³⁺ 氧化还原循环，维持活性氧（ROS）的持续产生¹⁸。然而，Fe³⁺ 还原为 Fe²⁺ 的过程相对较慢，构成反应的限速步骤，因而降低了芬顿反应的整体效率。研究表明，在芬顿反应体系中引入适当的还原剂可加速 Fe³⁺ 向 Fe²⁺ 的还原，从而增强 ROS 的生成。维生素 C 具有依赖环境的氧化还原作用。在含铁体系中，它可促进 Fe³⁺ 还原为 Fe²⁺，进而支持芬顿循环；但在较高浓度或不同反应条件下，它也可能发挥抗氧化剂或自由基清除剂的功能¹⁹。

基于此背景，本研究探讨了一种维生素C辅助的芬顿反应体系，作为一种可在明确酸性条件下化学调控氧化活性的可调谐方法 体外 条件^20,21维生素C被用作还原剂以促进Fe的还原²⁺再生，从而改变芬顿反应的有效氧化行为。本研究所采用的实验体系为简化的酸性盐水-尿素模型，并非旨在完全重现包含黏液、缓冲成分、宿主细胞、免疫因子及多种有机底物的生理胃部微环境。在此受控模型中，通过化学检测手段表征氧化活性，并同步评估细菌表型反应，为探究活性氧介导的抗菌效应提供了实验依据 H. pylori 体外.

方案

伦理声明
本研究是一项 体外 本研究为细菌学研究，未涉及人类受试者、动物实验或患者来源材料。因此，无需获得机构审查委员会批准和动物伦理审批。

维生素C辅助Fenton体系中AO7降解的评价
为了评估维生素C对Fenton反应可观测氧化行为的影响，采用酸性橙7（AO7）的降解作为氧化活性的间接化学检测指标。该检测方法不特异性地定量单个活性氧物种。配制100 mL浓度为5 mg/L的AO7溶液，并将溶液pH值调节至3。加入H₂O₂和FeSO₄，使其终浓度分别为2.2 mM和0.055 mM。维生素C可在反应启动时一次性加入，或采用三步分次添加的方式加入。在剂量-反应实验中，使用的Vc:Fe²⁺摩尔比分别为0、0.12、0.24、0.48、2、4、6和8，当FeSO₄浓度为0.055 mM时，对应的维生素C终浓度分别为0、0.0066、0.0132、0.0264、0.110、0.220、0.330和0.440 mM。在三步添加条件下，将相同总量的维生素C均分为三等份，并在反应启动后的3、5和7分钟时各加入一份。例如，在Vc:Fe²⁺比为0.48时，每份添加的维生素C浓度为0.0088 mM，最终总浓度为0.0264 mM。

在避光条件下持续搅拌反应溶液10分钟，同时保持温度低于30 °C。在反应前后分别取2 mL样品。使用紫外-可见分光光度计在483 nm处测定吸光度，并根据公式1计算AO7的降解率：

降解率（%）= [(A₀ − A₁) / A₀] × 100% (1)

此处，A₀ 表示反应前样品的吸光度，而 A₁ 表示反应后样品的吸光度。

使用TA探针评估•OH相关荧光信号
为了在与抗菌实验相同的酸性体外条件下评估羟基自由基（•OH）相关荧光信号，建立了一个无细胞化学体系，采用对苯二甲酸二钠（TA，1 mM）作为荧光探针。该检测用于相对指示•OH相关产物的生成情况，但不解释为对羟基自由基生成的绝对定量。实验共设七组：（1）空白对照组（仅含反应缓冲液中的1 mM TA），（2）单独H₂O₂组，（3）单独Fe²⁺组，（4）单独维生素C（Vc）组（分步添加），（5）传统Fenton反应组（Fe²⁺ + H₂O₂），（6）维生素C辅助Fenton反应组（一次性添加Vc，Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc，一次性），以及（7）维生素C辅助Fenton反应组（分步添加Vc，Fe²⁺ + H₂O₂ + Vc，分步）。在分步添加条件下，Vc在反应开始后3、5和7分钟以等量分次加入；而在一次性添加条件下，则在反应开始时一次性加入与分步组相同总量的Vc。

在10分钟的反应期间内收集等分试样，立即用NaOH碱化以终止进一步的自由基反应并稳定荧光，随后在测量前于4 °C保存。使用酶标仪测定由TA生成的产物的荧光强度（激发/发射波长：315/425 nm）。自由基的生成以空白校正后的荧光强度表示，并作为自由基生成的相对指标。至少进行了三次独立实验，数据以时间进程曲线以及10分钟时的终点比较形式呈现。

通过菌落计数评估抗菌性能
H. pylori 菌株保存于含 25% 甘油的脑心浸液（BHI）肉汤中，置于 −80 °C 冻存。用于主要菌落计数实验、挽救实验、基质干扰实验、活/死荧光染色以及扫描电子显微镜分析的主要菌株为 H. pylori G27。每次实验前，将细菌划线接种至哥伦比亚血琼脂平板，在 37 °C 微需氧条件下培养 3 天，气体环境为 5% O₂、10% CO₂ 和 85% N₂²²。

原始菌株中的菌落计数实验
采用菌落形成单位（CFU）计数法评估不同处理条件下抗菌活性。实验包括以下组别：未处理对照组、单独H₂O₂处理组、单独维生素C处理组、传统芬顿反应组以及维生素C辅助芬顿反应组。若原始实验未设置单独Fe²⁺处理组，则不应将主实验解释为完全区分铁离子单独作用与芬顿反应介导的氧化作用。收集培养的H. pylori，并将其重悬于生理盐水中。将600 nm处的光密度（OD₆₀₀）调整至0.5，随后将菌悬液转移至含3 mM尿素、pH调至3的生理盐水中。根据分组分别加入H₂O₂、FeSO₄和维生素C。H₂O₂和FeSO₄的终浓度分别为2.2 mM和0.055 mM。对于维生素C辅助芬顿反应处理组，分别在3、5和7分钟时等量分三次加入维生素C，总终浓度为0.0264 mM。

处理10分钟后，立即将每份样品在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中稀释100倍，以中和酸性悬液，并减少残留氧化剂和铁离子对后续涂布步骤的干扰。将稀释后的细菌悬液涂布于哥伦比亚血琼脂平板上，在含5% O₂、10% CO₂和85% N₂的微需氧条件下，于37 °C培养3天。计数菌落形成单位（CFU），并根据公式2计算相对于未处理对照组的抗菌活性，以log₁₀ CFU减少量表示：

对数₁₀ 菌落形成单位减少量 = log₁₀（菌落形成单位，CFU_对照) − log10(菌落形成单位_处理) (2)

挽救实验
为了检测维生素C辅助的芬顿体系的抗菌活性是否与铁的可利用性及自由基相关过程有关，使用去铁胺（DFO）作为铁螯合剂、硫脲作为羟基自由基清除剂进行挽救实验。在加入FeSO₄和H₂O₂前5分钟，将DFO或硫脲添加至细菌悬液中。DFO和硫脲的终浓度分别为100 µM和5 mM。

共设置六个实验组：未处理对照组、维生素C辅助芬顿组、维生素C辅助芬顿联合去铁胺（DFO）组、维生素C辅助芬顿联合硫脲组、单独使用去铁胺组以及单独使用硫脲组。所有其他实验参数，包括pH值、盐/尿素背景环境、H₂O₂浓度、FeSO₄浓度、维生素C给药方案、处理时间、涂板前的稀释/中和步骤以及培养条件，均与主要菌落计数实验中所用参数相同。抗菌活性通过菌落形成单位（CFU）计数进行量化，并以相对于未处理对照组的log₁₀ CFU减少量表示。

多菌株验证
为了对在主要菌株中观察到的抗菌效应提供有限的跨菌株支持，将菌落计数实验进一步应用于另外两种H. pylori参考菌株ATCC 43504和ATCC 26695。针对每种菌株，实验均包含三个组：未处理对照组、传统芬顿反应组，以及分步添加维生素C辅助的芬顿反应组。实验条件和操作步骤与主要菌落计数实验中所用的完全相同。抗菌活性以相对于未处理对照组的log₁₀ CFU减少量表示。每个实验均进行n = 3次独立的生物学重复，数据以单个数据点表示，并标注均值±标准差。

基质干扰实验
为评估有机基质成分是否可能减弱维生素C辅助芬顿体系的抗菌活性，采用牛血清白蛋白（BSA）建立蛋白质干扰模型。BSA的终浓度分别为0、1和3 g·L⁻¹。在每种BSA浓度下设置三个实验组：（1）未处理对照组，（2）传统芬顿体系（Fe²⁺ + H₂O₂），（3）分步添加维生素C的维生素C辅助芬顿体系。实验采用主要菌株，按照前述主要菌落计数实验相同的方案进行，包括相同的pH条件、盐/尿素背景、试剂浓度、处理时间（10分钟）及涂布操作。抗菌活性以相对于各BSA浓度下未处理对照组的log₁₀ CFU减少量表示。每个实验至少独立重复三次。主要比较重点在于：在含蛋白质条件下，增强型芬顿体系是否仍优于或至少不劣于传统芬顿体系。

细菌活/死荧光染色
处理后，将细菌悬液按上述方法用 PBS 稀释 100 倍，以减少残留的酸性和氧化性物质干扰。在室温下以 1,800 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。将菌体沉淀重悬于 200 µL 生理盐水中。加入 SYTO9 和碘化丙啶（PI），使其终浓度分别为 6 µM 和 30 µM。在室温下避光孵育 20 分钟。取 5–10 µL 染色后的细菌悬液滴加于洁净的玻璃载片上，盖上盖玻片。使用荧光显微镜在相同曝光条件下，通过绿色和红色荧光通道获取图像。每个组至少采集三个随机选择的视野。将图像作为活/死染色模式的定性视觉证据，而非细菌活力的定量测量结果。

通过扫描电子显微镜进行细菌形态学分析
处理后，收集细菌样品，并在4 °C条件下用0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中配制的2.5%戊二醛固定12小时。固定后，用磷酸盐缓冲液洗涤样品以去除残留的固定剂。 随后，样品依次在50%、70%、90%和100%的梯度乙醇溶液中进行脱水。脱水完成后，进行临界点干燥。干燥后的样品被固定在扫描电镜样品台（SEM stubs）上，并溅射镀上约10 nm厚的薄金层。使用加速电压为5 kV的扫描电子显微镜观察细菌形态。对每组处理样品分别在低倍和高倍下获取代表性图像。扫描电镜图像用于定性的形态学观察，而非作为特定损伤机制的定量证据。

统计分析
统计分析使用 GraphPad Prism 10.0 版本进行。所有定量实验均采用 n = 3 次独立的生物学重复，数据以均值 ± 标准差（SD）表示。对于 TA 荧光检测，多个处理组之间的统计比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 多重比较检验。在涉及多种处理条件的原始菌株菌落计数实验中，统计比较同样采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接 Tukey 多重比较检验。对于挽救实验，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接 Dunnett 多重比较检验，以维生素 C 辅助芬顿组作为参照组。在有限的跨菌株验证实验中，采用非配对双尾 t 检验，在每个菌株内比较传统芬顿组与维生素 C 辅助芬顿组之间的 log₁₀ CFU 降低值。对于基质干扰实验，采用双因素方差分析（two-way ANOVA），以处理方式和 BSA 浓度为因子，并包含交互项。在每个 BSA 浓度下，不同处理之间的成对比较采用 Šídák 多重比较检验。统计学显著性定义为 P < 0.05。显著性水平表示为 *p < 0.05，** P < 0.01，***P < 0.001，以及 ****p < 0.0001。

结果

维生素C辅助芬顿体系中AO7降解效果的评价
使用酸性橙7（AO7）降解作为化学探针，研究维生素C在酸性条件下对芬顿反应可观察氧化行为的影响。在不添加维生素C的情况下，传统芬顿体系在10分钟反应时间内仅导致部分AO7降解。当引入维生素C后，染料降解程度增加，且其效果依赖于维生素C与Fe²⁺之间的摩尔比。在维生素C与Fe²⁺的摩尔比较低时²⁺ 比例下，与无维生素C条件相比，AO7降解率提高。在Vc:Fe比例约为73.5%时，观察到最大降解效率。²⁺比值为0.24，而在不添加维生素C的条件下，降解率约为51.7%。进一步提高维生素C浓度并未带来降解效率的进一步提升，反而伴随降解效率的逐渐降低。

随后在保持维生素C总量不变的前提下，评估了一种逐步递增的维生素C给药策略。与单次给药相比，在其他条件相同的情况下，逐步添加维生素C可使AO7的降解速率更高。当维生素C与Fe²⁺的摩尔比超过约0.48时，进一步增加维生素C仅使降解效率发生微小变化。这些结果表明，在Fenton体系中，维生素C的...

讨论

本研究旨在考察在特定酸性条件下，维生素C的给药是否能够调节基于芬顿反应体系的氧化行为及抗菌效应 体外 条件。在化学和微生物测定中，逐步添加维生素C改变了可观察的反应行为，并与更强的抗细菌活性相关 H. pylori 在测试条件下，该体系产生的羟基自由基产量高于传统的芬顿反应。重要的是，该体系应被视为一种简化的酸性-盐-尿素模型，而非完整的生理胃部微环境。该模型旨在为测试基于芬顿反应的氧化活性提供可控的化学和微生物环境，而不模拟胃黏液、宿主细胞、免疫因子、缓冲能力或胃内容物的异质组成。

AO7的降解被用作氧化活性的间接化学指标，而非对特定活性氧物种的直接测定。在此体系中，添加维生素C在选定的Vc:Fe²⁺比例下增强了AO7的降解，而较高浓度的维生素C则降低了降解效率。这种浓度依赖性模式与维生素C的双重生物化学作用一致。在适当的氧化还原条件下，维生素C可作为还原剂，促进Fe³⁺还原为Fe²⁺，支持芬顿循环；然而，在过量存在或不同反应条件下，它也可能发挥抗氧化剂或自由基清除剂的作用，从而...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酸性橙7（AO7）	阿拉丁试剂（上海）有限公司	O113230	用作AO7降解实验的模型染料。
牛血清白蛋白（BSA）	上海麦克林生化科技有限公司	B885114	用于基质干扰实验。
脑心浸液（BHI）肉汤粉末	四川华派生物工程有限公司	N/A	用于细菌培养和冷冻保存。
哥伦比亚血琼脂平板（5%羊血）	常德碧凯美生物技术有限公司	110701028.0	用于细菌培养和菌落形成单位（CFU）计数。
临界点干燥仪（EM CPD300）	徕卡显微系统公司	EM CPD300	用于梯度乙醇脱水后的扫描电镜（SEM）样品制备。
去铁胺（DFO）	上海麦克林生化科技有限公司	D873692	在挽救实验中用作铁螯合剂。
对苯二甲酸二钠	上海麦克林生化科技有限公司	D835937	用作TA荧光探针以检测与羟基自由基（•OH）相关的信号。
无水乙醇	Sigma-Aldrich	E7023	用于制备梯度乙醇系列，以进行扫描电镜样品脱水。
荧光显微镜（DMi8）	徕卡显微系统公司	DMi8	用于活/死细菌的荧光成像。
戊二醛溶液	Sigma-Aldrich	G5882	用于扫描电镜前细菌样品的固定。
甘油	Sigma-Aldrich	G5516	用于BHI肉汤中细菌的冷冻保存。
GraphPad Prism 10	GraphPad Software, LLC	Prism 10	用于统计分析和绘图。
Helicobacter pylori 菌株 ATCC 26695	美国模式培养物集存库（ATCC）	700392	用于有限的跨菌株验证的附加参考菌株。
Helicobacter pylori 菌株 ATCC 43504	美国模式培养物集存库（ATCC）	43504	用于有限的跨菌株验证的附加参考菌株。
Helicobacter pylori 菌株 G27	四川大学华西医院感染性疾病中心	N/A	用于菌落计数、挽救实验、基质干扰实验、活/死染色和扫描电镜的主要菌株。
过氧化氢溶液	Sigma-Aldrich	H1009	在芬顿反应实验中用作过氧化物底物。
硫酸亚铁一水合物（FeSO4·H2O）	上海麦克林生化科技有限公司	F904376	在芬顿反应中用作亚铁离子来源。
酶标仪（Synergy H1）	安捷伦 BioTek	Synergy H1	用于测量TA衍生的荧光（激发/发射波长 = 315/425 nm）。
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4	Sigma-Aldrich	P4417	用于涂布前的处理后稀释/中和以及样品洗涤。
生理盐水（0.9%氯化钠溶液）	Millipore	567442	用于细菌悬浮液制备及酸性盐水-尿素模型的配制。
扫描电子显微镜（INSPECT F）	FEI公司	INSPECT F	用于细菌形态学分析。
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S5881	用于碱化TA实验等分试样并稳定荧光。
溅射镀膜仪（EM ACE200）	徕卡显微系统公司	EM ACE200	用于扫描电镜成像前施加薄金涂层。
SYTO 9/PI 活/死细菌双染试剂盒	上海茂康生物技术有限公司	MX4234	用于基于荧光的活/死细菌染色。
硫脲	上海麦克林生化科技有限公司	T81602	在挽救实验中用作自由基清除剂。
尿素	上海麦克林生化科技有限公司	U820349	用于制备酸性盐水-尿素模型。
紫外-可见分光光度计（UV-2600i Plus）	岛津公司	UV-2600i Plus	用于在483 nm处测定AO7的吸光度。
维生素C（L-抗坏血酸）	上海麦克林生化科技有限公司	A800295	在维生素C辅助的芬顿体系中用作还原剂。