对肾素—血管紧张素系统相关候选生物标志物的转录组鉴定及高血压诊断模型的外部检测

摘要

利用公开的血液转录组数据集，本研究鉴定了与肾素-血管紧张素系统（RAS）相关的候选高血压生物标志物。生物信息学和机器学习在一个独立的血液队列中检测出八个基因特征，将RAS转录组改变与免疫和炎症特征联系起来，需进一步验证。

摘要

本研究旨在鉴定与高血压相关的候选肾素-血管紧张素系统（RAS）相关血液转录组生物标志物，构建外部测试的候选诊断模型，并验证Ang II诱导内皮细胞模型中的选定基因。分析了两个公开微阵列数据集，GSE75360和GSE74144。先用limma进行差别表达分析，随后进行GO/KEGG富集、预排序GSEA、CIBERSORT免疫浸润分析、蛋白-蛋白质相互作用与调控网络构建，以及基于机器学习的特征选择，采用逻辑回归和随机森林法。基于所选基因的逻辑回归模型于GSE75360年开发，并在GSE74144年外部测试。实验验证在Ang II诱导的HUVECs中，采用qRT-PCR、西方印迹、ELISA和CST3/FURIN功能损失和增益分析，随后进行了CCK-8、Transwell、炎症、氧化应激和内皮功能分析。 GSE75360年共鉴定出173个差异表达基因，其中包括18个与RAS相关的差异表达基因。通过联合机器学习分析，选出了八个候选基因：LRP1、CTSD、MTHFR、AUTS2、FURIN、CST3、FCER1G和TBXAS1。富集和免疫浸润分析表明，这些基因主要与免疫和炎症特征相关。八基因模型在GSE75360中表现出高度的区分力，并在GSE74144中保持中等表现。在Ang II处理的HUVECs中，大多数候选基因在mRNA水平上调，CST3、FURIN和TBXAS1在蛋白质水平也得到了进一步验证。CST3和Furin调节改变了Ang II诱导的内皮存活能力、迁移、炎症/粘连标志物表达、ROS积累及eNOS/NO相关功能读数。 本研究鉴定了候选RAS相关生物标志物及高血压免疫相关特征，并开发了外部测试的候选诊断模型。体外研究结果支持CST3和FURIN在Ang II诱导内皮反应中的功能相关性，值得进一步的临床和机制验证。

引言

本研究聚焦于高血压，这是一种全球常见的慢性心血管^疾病。高血压显著增加严重健康并发症的风险，包括心血管和脑血管事件以及肾损伤。这对患者的生活质量和寿命构成严重威胁，同时也带来了显著的社会和经济负担 ^2,3.目前，高血压的诊断和治疗主要依赖血压监测和降压药物。然而，由于高血压的成因复杂且异质性，许多患者对现有治疗反应不佳，分子知情分层仍然有限 ^4,5。因此，有必要识别与高血压相关的候选生物标志物和转录组特征，同时避免将血液研究结果过度解读为决定性的组织层面机制。

近年来，肾素-血管紧张素系统（RAS）在高血压的发病机制和进展方面受到了广泛^关注。现有研究表明，RAS相关基因的异常表达与血压调节障碍及目标器官损伤密切相关，但具体分子网络和关键调控因子尚不完全清楚。由于高血压越来越被认可为涉及血管、免疫和炎症调节障碍的疾病，外周血单核细胞和白细胞为可访问的替代组织提供了可捕捉系统性RAS相关转录组改变的替代组织^8。本研究通过GeneCards和PubMed检索筛选出RAS相关基因集，因此包括了文献中报告与RAS信号功能相关的典型RAS通路基因和基因。

本研究采用了两个公开的微阵列数据集（GSE75360和GSE74144），采用生物信息学和机器学习方法进行转录组分析。具体方法包括利马差异分析、GO/KEGG/GSEA富集分析、CIBERSORT免疫浸润分析、PPI网络构建，以及基于机器学习的关键基因选择和逻辑回归诊断模型构建与评估。这些方法的优势在于能够分析大规模转录组数据，跨数据集进行外部测试，并整合互补的分析方法以构建候选模型。我们假设血细胞转录组谱可以识别与高血压及相关免疫特征相关的候选RAS相关生物标志物。因此，我们的目标是识别候选RAS相关基因，描述其功能背景，构建外部测试的候选诊断模型，而非建立明确的分子机制或临床成熟的精准诊断工具。

方案

分析工作流程概述

本研究基于转录组和机器学习的整体分析设计如 图1所示，涵盖关键步骤：采集肾素-血管紧张素系统相关基因（RASRGs）;从高血压数据集中筛选RAS相关差异表达基因（RASRDEGs）;功能富集分析（GO/KEGG/GSEA）;免疫浸润分析（CIBERSORT）;构建蛋白质间相互作用（PPI）及调控网络;基于机器学习的关键基因选择（逻辑回归、随机森林[RF]）;以及高血压诊断模型的评估。本研究中使用的完整软件、数据库和在线工具清单见 材料表。

数据下载

高血压数据集GSE75360^8和GSE74144（智人）通过R软件包GEOquery⁹从GEO数据库¹⁰获取。来自外周血单核细胞的产GSE75360（平台：GPL10558）包括10个高血压样本和11个对照样本;GSE74144来自白细胞（平台：GPL13497）包括14个高血压样本和8个对照样本（见表1）。最初通过GeneCards¹¹（关键词：“Renin-Angiotensin System”）和PubMed（关键词：“Renin-Angiotensin System”）12,13识别出编码蛋白的RASRGs（^1,264）。这些RASRG与GSE75360/GSE74144基因的交汇产生了1,159个最终^RASRG14。这两个数据集分别处理，因为它们是在不同的微阵列平台上生成的。探针注释根据对应的GPL平台注释文件进行，下游分析则使用归一化的基因表达矩阵。使用箱形图比较归一化前后表达式分布。

高血压相关肾素-血管紧张素相关差异表达基因

GSE75360数据集中的样本被分为高血压组和对照组。Limma软件被用于两组之间的差异基因表达分析¹⁴，差异表达基因（DEGs）通过|logFC|的阈值识别。>0.45，p值<0.05。该差分分析结果通过火山图（使用R ggplot2软件生成）可视化。

为获得RASRDEGs，满足上述阈值（|logFC| > 0.45，p值<0.05）的DEGs与RAS相关基因（RASRGs）交叉比对，交叉结果通过维恩图呈现。随后，利用R包热点图将已鉴定的RASRDEG表达图可视化为热图，RASRDEGs的染色体定位则通过R包RCircos¹⁵生成的染色体图显示。

差异表达基因验证与ROC曲线分析

构建组间图以分析GSE75360¹⁶中高血压与对照组间RASRDEG表达差异，使用R包装pROC绘制ROC曲线并计算RASRDEG诊断效能的AUC（0.5–0.7：低准确率;0.7–0.9：中等;>0.9：高）。

相关分析

Spearman的相关分析对GSE75360中RASRDEG表达进行了;结果通过热图（R 包 ggplot2）可视化（|r| < 0.3：无/弱相关;0.3–0.5：弱;0.5–0.8：中等;>0.8：强）。

GO和KEGG的浓缩分析

GO（基因本体，2024年发布，http://geneontology.org/）是一个广泛用于大规模功能富集的资源，涵盖三个领域：生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）¹⁷。KEGG（京都基因与基因组百科全书，2024年第109.0版，https://www.genome.jp/kegg/）存储有关基因组、生物通路、疾病和药物的数据¹⁸。

RASRDEGs通过R套件clusterProfiler¹⁹对GO注释和KEGG通路富集分析进行了分析。富集测试方法：超几何测试;多重测试校正法：Benjamini-Hochberg（BH）方法。筛选标准：调整后的p值<0.05。

基因集富集分析（GSEA）

对于队列级GSEA，所有在差异表达GSE75360分析中检测的基因均按logFC降序排序，并作为clusterProfiler¹⁹的输入基因列表。在GSEA之前，没有进行DEG预过滤。来自MSigDB²⁰的c2基因集。参数：种子 = 2022，每组10–500个基因;筛查标准：校正p < 0.05（Benjamini-Hochberg，BH方法），FDR < 0.25²¹.

高血压诊断模型的构建

为了识别与高血压相关的关键基因，我们采用了两种机器学习算法：逻辑回归和随机森林（RF）。逻辑回归（二元因变量：高血压/对照组）筛查p <0.05的RASRDEGs。随机森林（RF，R package randomForest）：参数 set.seed（520）， ntree = 1000;提取了MeanDecreaseGino（变量重要性指标），并选定了前15名RASRDEGs。RASRDEG的标准值为0.05<筛查。

RF（随机森林）算法是一种属于Bagging类别的集合学习方法（集成多重决策树），通过R包randomForest²² （参数：set.seed（520），ntree = 1000）应用。提取了特征基因的MeanDecreaseGini（通过节点分裂时平均纯度下降反映变量重要性），并选出了前15个RASRDEGs。最后，绘制了通过逻辑回归和射频过滤的基因维恩图，以识别与高血压相关的关键基因。

高血压诊断模型的验证

基于关键基因构建了逻辑回归模型;线性预测值（η）的计算方式如下：

使用R套件pROC¹⁶ 绘制ROC曲线并评估模型在预测高血压风险方面的有效性。通过R软件包rms²³ 构建了一组名录图，以可视化每个关键基因对逻辑回归模型的贡献（反映关键基因与高血压风险之间的关联）。生成校准曲线以评估预测高血压概率与实际高血压概率之间的一致性;进行了决策曲线分析（DCA，R 套件 ggDCA²⁴）以评估模型在GSE75360和GSE74144中的临床效用（净收益）。

单基因 GSEA

GSEA通过分析特定基因的表达，探讨与特定基因相关的基因在生物过程/通路/疾病中的作用，有助于理解该基因的功能作用。GSE75360中每个焦点基因，样本在中位数被分为高表达组和低表达组。随后对所有检测基因进行了差异表达分析，并在GSEA前使用clusterProfiler¹⁹从高到低对全基因组logFC值进行排名。在GSEA之前，没有进行DEG预过滤。参数：seed = 2020，每组10–500个基因（来自MSigDB²¹的c2基因集集合）。筛查标准：p < 0.05（通过BH法修正的p）。

免疫浸润分析（CIBERSORT）

CIBERSORT算法²⁵ （基于线性支持向量回归）对转录组矩阵进行了去卷积，以估算混合样本中的免疫细胞组成（选取免疫细胞富集得分为>0的数据）。通过比例条形图可视化了GSE75360的最终免疫细胞浸润矩阵。斯皮尔曼相关分析被用于分析免疫细胞-免疫细胞及关键基因-免疫细胞的关联，结果分别以相关热图（R 包热图）和相关气泡图（R 包 ggplot2）呈现。

蛋白质间相互作用（PPI）网络

PPI网络是由相互连接的蛋白质组成，通过相互作用调控生物过程。利用STRING数据库²⁶，构建了关键基因的PPI网络（最低交互得分：0.150，置信度低）。通过筛选相互作用基因，筛选了与肾素-血管紧张素相关的枢纽基因。GeneMANIA数据库²⁷利用基因组和蛋白质组数据集识别功能相似基因，用于预测关键RAS基因的功能相似基因，并构建蛋白质相互作用网络。

监管网络的构建

mRNA-TF网络：转录因子（TFs）通过转录后与目标基因的相互作用调控基因表达。从ChIPBase数据库检索了针对枢纽基因及其调控关系的转录因子（^TFs），并利用Cytoscape²⁹可视化了mRNA-TF网络。

mRNA-miRNA网络：miRNA调控多个靶基因（单个靶点可能被多个miRNA共同调控）。使用StarBase v3.0³⁰ 识别与RASRDEG相关的miRNA，并通过Cytoscape可视化mRNA-miRNA网络。

mRNA-药物网络：使用³¹ 个毒理基因组数据库预测枢纽基因的直接/间接药物靶点。用Cytoscape可视化了mRNA-药物网络（显示基因-药物相互作用），完成了网络构建。

Ang II诱导的HUVEC模型

人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）在含5%_CO2的加湿培养箱中保持在37°C。细胞按照供应商指示，在完整的内皮细胞培养基中保存，并补充胎儿牛血清和抗生素。为建立体外高血压相关内皮损伤模型，HUVECs接受血管紧张素II（Ang II;100 nM）治疗48小时。使用车辆处理细胞作为对照组。

在基因干预实验中，利用商用转染试剂（oe-CST3和oe-FURIN）靶向CST3或FURIN的小干扰RNA（si-CST3和si-FURIN）、对应的负面对照siRNA（si-NC）、CST3或Furin过表达质粒（oe-CST3和oe-FURIN）及相应的空载体对照（oe-NC）转染到HUVEC中。转染后，细胞暴露于Ang II，然后采集以进行表达验证和功能检测。qRT-PCR和西方墨迹法证实了敲低和过表达效率。

qRT-PCR

使用标准RNA提取试剂从HUVECs中分离出总RNA，并利用逆转录试剂盒生成互补DNA。SYBR绿色化学用于qRT-PCR。LRP1、CTSD、MTHFR、AUTS2、FURIN、CST3、FCER1G、TBXAS1、IL-6、TNF-α、VCAM1、ICAM1和eNOS的表达水平均归一为GAPDH，并采用2^−ΔΔCt方法计算。

西部污点

对于西部墨迹分析，蛋白质通过RIPA溶解缓冲液提取，并用BCA检测法定量。等量蛋白质通过SDS-PAGE分辨并转移到PVDF膜上。阻断后，膜与针对CST3、FURIN、TBXAS1或GAPDH的初级抗体一起孵育，随后与合适的二级抗体一起孵育。通过化学发光检测到条带，密度测量结果归一为GAPDH。培养上清液中分泌的CST3，按照制造商的方案使用ELISA试剂盒进行定量。

细胞存活率

细胞存活率使用细胞计数套件-8（CCK-8）检测法进行评估。简要地，转染和Ang II处理的HUVEC被植入96孔板中，加入CCK-8试剂后0、24、48和72小时测量了450纳米处的吸收率。细胞迁移使用透孔腔评估。在所指示的干预措施后，细胞被播种到上腔，移动到下膜表面的细胞被固定、染色，并在随机选定的田野中显微镜下计数。

炎症测试

评估炎症激活、氧化应激和内皮功能，IL-6、TNF-α、VCAM1、ICAM1和 eNOS。mRNA水平通过qRT-PCR检测。使用商业一氧化氮检测试剂盒测量培养上清液中的一氧化氮（NO）水平，并根据制造商说明使用DCF荧光检测细胞内活性氧（ROS）水平。

统计分析

在R中进行了转录组处理和建模。连续变量使用Shapiro-Wilk检验评估其正常性。对于两组比较，正态分布变量使用独立样本t检验，而非正态变量则使用Wilcoxon秩和检验。对于三组或更多组，当方差假设的正态性和均匀性均成立时，采用了适当的事后检验进行方差单向分析;否则，则采用Kruskal-Wallis检验。CCK-8时间程数据采用双向方差分析进行分析。计算了斯皮尔曼相关系数以进行关联分析。除非另有说明，实验结果均值显示为平均值±标准差，双尾p<0.05被视为显著。

结果

高血压数据集清理

为确保后续分析的可靠性，首先对GSE75360和GSE74144数据集进行了探针注释和数据归一化，使用R limma软件包。基因表达值在归一化前后的分布见 补充文件1—补充图S1A-D，橙色代表高血压样本，蓝色代表对照样本。

GSE75360：归一化前（补充文件1—补充图S1A），高血压和对照样本的表达值范围明显差异，样本间中位数和四分位数分布不一致，表明显著的批次效应或技术差异。归一化后（补充文件1—补充图S1B），所有样本的表达值分布高度对齐——高血压组和对照组的中位数和四分位数范围有显著重叠，整体数据分散减少，证实了非生物变异的有效消除。

对于GSE74144：归一化前期（补充文件1

讨论

高血压是一种复杂的心血管疾病，涉及RAS失调、免疫炎症激活、血管损伤和内皮功能障碍³²。在本研究中，我们首先利用公开的血液转录组数据集和机器学习方法识别RAS相关的候选生物标志物，并构建了外部测试的候选诊断模型。随后，我们通过在Ang II诱导的HUVEC模型中进行实验验证，进一步扩展了这些生物信息学发现。这种综合策略通过将血液来源的RAS相关特征与Ang II刺激下的内皮反应联系起来，增强了转录组候选者的生物学可信度。特别是，新增的细胞实验使我们能够检验转录组和机器学习分析中识别的关键基因是否对高血压内皮微环境有响应性，以及选定基因是否能影响内皮增殖、迁移、炎症、氧化应激和内皮功能标志物。

我们的分析在高血压和对照组样本中识别出18个RASRDEGs。随后应用两种不同的机器学习算法（逻辑回归和随机森林）筛选出8个关键基因（LRP1、CTSD、MTHFR、AUTS2、FURIN、...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔细胞培养板			用于CCK-8细胞活力测定
血管紧张素II（Ang II）			用于在100 nM的HUVEC中诱导内皮损伤，持续48小时
抗生素溶液			根据供应商说明添加到内皮细胞培养基中
BCA蛋白检测试剂盒			用于确定western blotting的蛋白浓度
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）			用于评估HUVEC的活力/增殖
化学发光检测试剂			用于可视化western blot蛋白带
ChIPBase v2.0	Sun实验室/研究资源	N/A	用于检索hub基因的转录因子-靶标关系的数据库
CIBERSORT	斯坦福大学/Newman实验室	N/A	用于估算22种免疫细胞类型丰度的免疫细胞分解算法
clusterProfiler（R包）	Bioconductor	N/A	用于GO、KEGG和GSEA分析的R包
CO2细胞培养箱			用于在37℃和5% CO2下培养HUVEC
比较毒理基因组学数据库（CTD）	NC州立大学/芒特德塞特岛生物研究所	N/A	用于预测基因-药物相互作用的数据库
完全内皮细胞培养基			用于HUVEC培养
带互联网访问的计算机工作站	任何标准的研究计算平台	N/A	用于数据下载、预处理、统计分析和可视化
CST3酶联免疫检测试剂盒			用于检测细胞培养上清液中分泌的CST3
CST3过表达质粒（oe-CST3）			用于HUVEC中的CST3功能增强实验
Cytoscape	Cytoscape联盟	N/A	用于可视化mRNA-miRNA、mRNA-TF和mRNA-药物调控网络的软件
DCF荧光探针/ROS检测试剂			用于检测细胞内ROS水平
空载体对照质粒（oe-NC）			用作过表达对照
胎牛血清			添加到内皮细胞培养基的补充剂
FURIN过表达质粒（oe-FURIN）			用于HUVEC中的FURIN功能增强实验
GeneCards	魏茨曼科学研究所	N/A	用于整理RAS相关基因的数据库
GeneMANIA	多伦多大学	N/A	用于识别功能相关基因的网络工具
GEO数据库	NCBI	N/A	用于访问GSE75360和GSE74144数据集的公共数据库
GEOquery（R包）	Bioconductor	N/A	用于下载GEO数据集的R包
ggDCA（R包）	CRAN/作者使用的GitHub来源	N/A	用于决策曲线分析的R包
ggplot2（R包）	CRAN	N/A	用于数据可视化的R包
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）			用于Ang II诱导的内皮损伤实验的细胞模型
limma（R包）	Bioconductor	N/A	用于归一化和差异表达分析的R包
MSigDB	Broad研究所	N/A	用于GSEA的基因集数据库
负对照siRNA（si-NC）			用作敲低对照
一氧化氮检测试剂盒			用于测量培养上清液中的NO水平
pheatmap（R包）	CRAN	N/A	用于生成热图的R包
CST3的一抗			用于western blotting
FURIN的一抗			用于western blotting
GAPDH的一抗			用作western blot的负载控制
TBXAS1的一抗			用于western blotting
pROC（R包）	CRAN	N/A	用于生成ROC曲线和计算AUC的R包
PubMed	美国国立医学图书馆	N/A	用于补充RAS相关基因整理的文献数据库
PVDF膜			用于western blot蛋白转移
qRT-PCR引物			用于检测候选基因和炎症/内皮标记
R软件	R统计计算基金会	N/A	用于所有分析的统计计算环境
randomForest（R包）	CRAN	N/A	用于随机森林特征选择的R包
RCircos（R包）	CRAN/Bioconductor相关资源	N/A	用于可视化RASRDEGs的染色体定位的R包
逆转录试剂盒			用于合成互补DNA
RIPA裂解缓冲液			用于总蛋白提取
rms（R包）	CRAN	N/A	用于构建列线图的R包
RNA提取试剂			用于从HUVECs中提取总RNA
二抗			用于western blotting
靶向CST3的siRNA（si-CST3）			用于CST3敲低实验
靶向FURIN的siRNA（si-FURIN）			用于FURIN敲低实验
starBase v3.0	Sun实验室/研究资源	N/A	用于识别miRNA-靶标相互作用的数据库
STRING	STRING联盟	N/A	用于构建蛋白-蛋白相互作用网络的数据库
SYBR Green qPCR试剂			用于qRT-PCR检测
转染试剂			用于将siRNAs和过表达质粒转染到HUVECs
Transwell孔室			用于HUVEC迁移测定