方法文章

基于板的成像测定方法，利用原腹皮发育量化 大脑神经孢子 的光周期反应

DOI：

10.3791/71271

⸱

2026年6月9日

 , 
1Center for Computational and Integrative Biology (CCIB) Rutgers, The State University of New Jersey, 2Rutgers University-Camden, Department of Biology Rutgers, The State University of New Jersey, 3Institute for Empowering Equitable Education in STEM (E3-STEM)

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

原腹囊细胞测定通过测量原腹囊壳在特定光暗周期下的形成，量化了 Neurospora crassa 的光周期反应。这种基于板的方法为比较不同实验条件下的光周期依赖性发育反应提供了一种简单且可扩展的方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurospora crassa 是研究生物时序和光控发育的成熟模式生物。 原腹囊壳测定（PPA）是一种基于板的成像方法，通过测量原腹囊形成作为发育输出来量化光周期反应。该方案的目标是提供一个可重复且可扩展的工作流程，用于评估定义的明暗周期如何影响真菌的有性发育。在该检测中，真菌培养物在合成交叉培养基上，受控光周期条件下生长，随后标准化地去除表面分生孢子以改善观察。原腹囊通过人工图像计数定量，每片平均计数用于不同光周期条件的统计比较。与以往方法不同，PPA集成了标准化培养条件、受控光周期暴露和象限成像，实现了跨菌株的可重复定量比较。该工作流程超越了基本协议，建立了一致且可扩展的框架，用于在特定实验条件下测量光周期依赖的发育输出。该方法从接种到分析大约需要一周时间，并且可以在特定环境条件下应用于多种菌株。PPA提供了一个简单易懂的平台，用于在受控实验室条件下比较分析真菌中光周期依赖性发育。

引言

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原腹囊细胞检测法（PPA）量化了大神经孢子真菌中的光周期反应。许多生物通过测量昼夜长度来协调生物过程，这一现象被称为光周期效应1,2,3,4,5,6,7,8。在该检测中，女性性结构——原腹皮细胞的发育，作为光周期反应的可测量、依赖光线的代理指标。尽管通过夜间实验3，植物中光周期性已被很好地表征，但用于量化非光合作用真核生物（如真菌）光周期响应的标准化方法较少。由于其明确的遗传学特征和对光的反应发育途径，N. crassa提供了一个易于处理的模式系统。在生物1、2、3、4、5、6、7、8中观察到光周期依赖性调节生殖时间，支持光驱动生理反应的相关性;然而，真菌的机理性研究仍受限于缺乏可重复的检测方法。

原腹囊是 N. crassa的早熟雌性生殖结构。它们起源于子囊，子囊体发育出盘绕的毛发体，与相反交配类型9的菌丝或分生孢子融合。融合后，“雄性”伴侣的细胞核进入原腹皮囊。原腹囊的数量受季节调节，强烈光照诱导为10个。光周期调节在生态学、时间生物学和真菌生理学中至关重要，因为许多时钟控制的过程依赖光线。光线影响多种遗传途径，包括光感受器、激酶以及与性发育相关的光传导机制11。原腹囊非常适合测量光周期输出，因为它们在显微镜下易于观察，且对光线反应灵敏。

尽管光周期效应在真菌中非常重要，但目前很少有标准化且可重复的检测方法能在受控光周期下定量原腹囊的产生。中通量的平板测定有价值，因为真菌是廉价且易于维护的模式生物，能够系统分析光诱导的有性发育和基因功能。大多数光周期性研究主要集中在植物上，而真菌系统的同等定量框架仍然有限。在其他生物中，包括昆虫，依赖光的现象如滞育已被很好地描述7，但真菌中缺乏类似的方法。这一差距限制了不同应变和实验条件下光周期响应的可重复比较。

PPA基于2004年一项研究，该研究测量了从持续黑暗到恒定光照的原始腹皮囊产生，该带（bd）突变体（ras-1bd）已被用于昼夜节律研究4,12。在这一背景下观察到原腹囊产生随光周期变化。当前工作流程采用参考品系FGSC 2489，该菌株与全基因组测序和敲除资源相关，对此进行了调整和扩展，见13,14。该测定方法量化了在定义光周期内一周内产生的原腹囊平均数量，作为光周期反应的代理指标。该方法规范了培养条件、成像和定量，实现了不同实验条件和品系间的可重复比较。关键方法学进展包括标准化的平板培养条件、定义的光周期暴露参数、象限式成像以及可重复的定量工作流程。

该方案通过测量暴露于特定光暗循环后原腹皮囊形成，量化 了N. crassa 的光周期反应。对于每种光周期条件，使用四个生物复制品，每个复制品由一个独立接种的合成交叉（SC）板组成。每块板块收集四张图像，并平均生成每个生物复制的单一值以供统计分析。板材在校准光周期下孵育七天（例如12小时12小时或8小时16小时明暗周期）。

生长室内放置数据记录仪，持续记录光强、温度和湿度，从而验证环境的稳定。光强维持在1000勒克斯以上，因为较低水平会减少原腹膜的产生。避免过多照明，以防止腔室温度升高和混淆热效应。孵育后，用浸湿70%乙醇的纸巾轻柔取出巨分线孢子。每块板周边均匀分布的四个象限，在明场照明下用立体显微镜以40×倍放大率成像。原腹囊通过图像处理软件手工计数，每片平均计数用于不同光周期的统计比较。

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方案

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所使用的试剂、软件和设备列于 材料表中。

1. 培养基和材料的准备

（预计使用时间：1–1.5小时;夜间冷却可选）

  1. 准备合成交叉（SC）介质
    1. 制备SC培养基：0.2%蔗糖，5微克/升生物素，1.5%琼脂，以及韦斯特加德盐（pH 6.5，含1N NaOH）15。
    2. 用高压灭菌器灭菌。冷却至50–55°C，直到达到可倒状态。
      注意：取出烧瓶时请戴耐热手套。
  2. 浇注板
    1. 用一次性移液器将10毫升熔融培养基移液到60毫米培养皿中移液。
    2. 让板材在室温下凝固30–45分钟。
    3. 将盘子倒置存放于4°C，保存时间可达4周。
      注意：保持盘子水分充足。不要在4°C下储存盘子超过4周。
  3. 准备真菌菌株
    1. 在含有完整或最小培养基的小型玻璃试管中培养每种菌株，均按照实验室手册说明制作。
    2. 在30°C的持续黑暗（DD）下孵育管，直到管表面形成可见菌丝覆盖（通常2–3天）。
      注意： 使用标准微生物学操作处理真菌培养物，并在生物安全柜内工作以减少污染。

2. 板块接种

（预计时间：每组底片15–30分钟）

  1. 转移真菌分生孢子
    1. 使用无菌技术和接种环为每块SC板进行接种。
    2. 将分生孢子置于板中心，以确保均匀生长（见图1A）。分生孢子以粉状、浅色孢子的形式覆盖在群体表面。
    3. 施加约1–2微升的浓缩分生孢子悬浮液（或等效的环状溶液），以标准化各板间的接种。
  2. 准备培养盘
    1. 密封板材以防止污染，同时允许气体交换。
    2. 在每块板上标注菌株名称、日期和光周期状况。

3. 光周期处理装置

（预计时间：10分钟准备+7天潜伏期）

  1. 校准生长室
    1. 将腔室温度设为25°C。
    2. 将湿度设为50%（可接受范围：40%–60%）以防止盘子干燥。
    3. 节目光周期：EQ（春分）：12小时光照/12小时黑暗，SDP（短白天）：8小时光照/16小时黑暗
    4. 使用校准光度计将光强设置为板面>1000勒克斯。避免使用使腔室温度超过25°C的强度。
      注意： 确保舱内灯不会过热。
      注意：不要使用防腐剂或塑料袋来保持湿度，因为它们会限制气体交换并抑制真菌生长。如果无法控制湿度，可以在箱内放置一个水箱。
  2. 将板放入腔室
    1. 将盘子均匀摆放于架子上，以确保光线均匀。
    2. 在舱内放置数据记录仪，以持续监测温度和湿度，并验证环境的稳定。
  3. 开始检测
    1. 在编程光周期下孵育平板7天，不干扰。

4. 监测和准备成像板

（预计时间：每片15–20分钟）

  1. 将钢板从腔室中取出
    1. 潜伏7天后取出平板。
    2. 检查分生子生长和原腹皮形成。
  2. 干净的车牌以便视野
    1. 用撕碎的纸巾去除盘盖和琼脂表面的分生孢子（见图1B）。
    2. 用1–2毫升70%乙醇润湿纸巾。轻轻点拭盘面3–5次以去除分生孢子。成像前让平板自然干燥1–3分钟（见图1C）。
      注意： 乙醇是易燃的;远离热源。
      注意： 避免施加过大压力。不要用毛巾拖过琼脂表面，因为这可能会损坏培养基或扰乱原腹膜。

5. 原周皮成像

（预计时间：每盘5分钟）

  1. 准备成像
    1. 设置一台照明和放大倍率稳定的显微镜（通常是40×倍率）。
    2. 确保板面干燥且无杂质。
  2. 拍摄图像
    1. 用恒定放大镜拍摄板块周边四个均匀分布的象限。
    2. 为每张图像标注应变、光周期状况、板数和象限位置。
    3. 将图像保存为统一格式（例如TIFF）以便分析。

6. 量化与数据分析

（估计时间：每块板计数10–20分钟;分析15–25分钟）

  1. 原腹皮西亚伯爵
    1. 打开图像处理软件包中的每张图片。
    2. 使用细胞计数插件手动计数原腹膜。排除气泡、边缘伪影和模糊结构。将聚集的原腹皮囊视为独立且可区分的单元。
    3. 每个象限的记录计数，并计算每个车牌的平均值。
  2. 分析数据
    1. 将定量数据导入统计分析软件。
    2. 对图 2所示的比较进行统计分析，使用韦尔奇t检验。
    3. 生成比较光周期处理、应变或复制的图表。

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结果

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接种野生型菌株后，分生孢子在36至48小时内覆盖了南卡表面。经过7天的光周期暴露后，形成了致密的分生孢子层，并用浸有70%乙醇的湿纸巾去除（见图1）。这一步骤暴露了底层的原腹皮，同时未破坏其结构。显微镜下，原腹囊呈黑色圆形结构，分布于板面。这些结构呈球形，与周围菌丝区分开来。在板内，原腹囊通常大小均匀，分布随光周期条件变化。在类似春分的光周期下生长的板块表现出密集的原腹皮囊形成，而短日照条件下产生的结构较少。

图1
图1：板片的代表性图像。 （A）一个60毫米培养皿，内含10毫...

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讨论

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PPA的目标是利用真菌中的性发育作为判断生物体是否感知特定光周期的代理指标。通过量化不同光周期下产生的原腹囊平均数量，可以评估和比较不同条件下的光周期反应。与之前观察一致4,16，N. crassa在类似春分点的光周期下表现出更高的原腹囊产生，而短日照条件下产生的结构较少（见图2）。该检测方法提供了一种在受控实验室条件下，观察真菌模型系统中光周期依赖性发育反应的方法。由于真菌中的光周期反应表型有充分记录，但机制上定义较少，且标准化的检测方法很少，PPA提供了定量分析方法。

PPA的成功执行需...

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披露

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作者声明没有利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢Cathyrn Maienza、Myo Thinzar Htin Aung、Aye Thinzar Htin Aung和Morgan Bartleson对本项目的支持、协助和贡献。作者还感谢罗格斯大学卡姆登分校生物学系及计算与综合生物学中心（CCIB）为其提供机构支持、研究设施和资源。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AgarBD90000-786用于合成交叉培养基/最低培养基
酒精燃烧器火焰Wards470346-104用于灭菌接种环
硫酸铁铵六水合物SupelcoFX0245-1用于合成交叉培养基/最低培养基
硝酸铵（NH4NO3）BeanTown ChemicalBT134170-250G用于最低培养基
高压灭菌器VWR International76683-456用于玻璃器皿和培养基的灭菌
生物安全柜ThermoFischer Scientific 1323TS用于减少板子和实验室的污染
生物素VWR97061-444用于合成交叉培养基
硼酸（H3BO3）Electron Microscopy Sciences100503-696用于合成交叉培养基/最低培养基
氯化钙（CaCl2）AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLCJT1311-1用于合成交叉培养基
氯化钙二水合物（CaCl2·2H2O）Sigma-Aldrich223506-25G用于最低培养基
柠檬酸一水合物（C6H8O7·H2O）Sigma-Aldrich1002440500用于合成交叉培养基/最低培养基
硫酸铜五水合物（CuSO4·5H2O H2O）BeanTown ChemicalBT121245-1KG用于合成交叉培养基/最低培养基
乙醇Decon Labs71001-754用于去除板面上的分生孢子和灭菌接种环
FIJI/ImageJ国家卫生研究院（NIH）N/A用于分析图像/计数
手套SW Safety Solutions76382-944用于安全
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCN/A用于执行统计测试和创建图形
生长室Caron Products & Services6320 & 6340系列可编程光周期周期
HOBO数据记录器Onset Computer CorporationMX2202用于光强度和温度记录
接种环VWR International10806-354用于将真菌材料转移到培养皿中
硫酸镁七水合物（MgSO4·7H2O）BeanTown ChemicalBT145380-1KG用于合成交叉培养基/最低培养基
硫酸锰一水合物（MnSO4·H2O H2O）Sigma-Aldrich1059410250用于合成交叉培养基/最低培养基
显微镜（Leica S6 D Greenough 立体显微镜）Leica Microsystems10446297用于成像
Neurospora crassa FGSC 2489真菌遗传学库中心74-OR23-1VA, JCM19069真菌菌株
纸巾Kimberly-Clark Professional, Scott和Kleenex6666114用于倒入培养基
永久性记号笔Sharpie30072用于标记板子
培养皿VWR International25384-164用于合成交叉培养基的平板培养
移液器VWR International75816-090用于倒入培养基
磷酸二氢钾（KH2PO4）BeanTown ChemicalBT225070-500G用于合成交叉培养基/最低培养基
硝酸钾（KNO3）Sigma-Aldrich221295-100G用于合成交叉培养基
小型一次性玻璃试管VWR International470211-698用于真菌菌株的初始生长
氯化钠（NaCl）VWR InternationalBDH9286-500G用于合成交叉培养基
柠檬酸钠二水合物（Na3C6H5O7·2H2O）VWR97061-008用于最低培养基
氢氧化钠（NaOH）AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLCJT5635-2用于合成交叉培养基
钼酸钠二水合物（Na2MoO4·2H2O）Supelco1.06524.1000用于合成交叉培养基/最低培养基
蔗糖VWR InternationalBDH9308-500G用于合成交叉培养基/最低培养基
硫酸锌七水合物（ZnSO4·7H2O）BeanTown ChemicalBT122545-500G用于合成交叉培养基/最低培养基

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