原子囊果测定法通过在特定光暗周期下测量粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）原子囊果的形成情况，来量化其光周期反应。该基于平板的方法为比较不同实验条件下光周期依赖性发育反应提供了一种简单且可扩展的技术途径。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
Neurospora crassa 是研究生物节律和光调控发育的成熟模式生物。 原基囊果测定法（Protoperithecia Assay, PPA）是一种基于平板成像的技术，通过检测原基囊果的形成作为发育输出指标，用于量化光周期反应。本实验方案旨在提供一种可重复且可扩展的工作流程，以评估特定光暗循环对真菌有性发育的影响。在该测定中，真菌培养物在合成交配培养基上于受控的光周期条件下生长，随后通过标准化方法去除表面分生孢子以提高观察清晰度。原基囊果的数量通过基于图像的手动计数获得，每平板的平均计数用于不同光周期条件间的统计学比较。与以往方法不同，PPA整合了标准化的培养条件、可控的光周期暴露以及基于象限的成像策略，从而实现不同菌株间可重复的定量比较。该工作流程不仅是一个基础实验方案，更建立了一个在明确定义的实验条件下，用于测量光周期依赖性发育输出的一致且可扩展的框架。该方法从接种到分析约需一周时间，可在多种菌株及特定环境条件下应用。PPA为在受控实验室条件下对真菌光周期依赖性发育进行比较分析提供了一个简单且易于实施的技术平台。 关键词：原基囊果测定法，PPA，光周期反应，真菌有性发育，光暗循环，发育输出，成像分析，定量比较，标准化工作流程，实验室培养
引言
原子囊果测定法（PPA）用于量化粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的光周期反应。许多生物通过感知昼夜长度来协调其生物学过程，这一现象称为光周期现象1,2,3,4,5,6,7,8。 在该实验中，雌性生殖结构——原子囊果的发育程度可作为可测量的、依赖光照的光周期反应指标。尽管通过“暗期间断”实验已在植物中对光周期现象进行了充分表征3，但针对真菌等非光合真核生物的光周期反应，目前仍缺乏标准化的定量方法。N. crassa 因其清晰的遗传背景和光响应发育通路，成为研究该问题的理想模型系统。跨物种研究已观察到光周期依赖性的生殖时间调控现象1,2,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所使用的试剂、软件和设备列在材料表中。
1. 培养基与材料的准备
（预计时间：1–1.5 小时主动操作时间；可选过夜冷却）
- 配制合成培养基（SC培养基）
- 配制SC培养基：0.2%蔗糖、5 µg/L生物素、1.5%琼脂，以及Westergaard盐溶液（用1 N NaOH调节pH至6.5）15。
- 将培养基高压灭菌。冷却至50–55 °C，使其达到可倾倒状态。
注意：从高压灭菌器中取出锥形瓶时，请使用耐热手套。
- 倒平板
- 使用一次性移液管将10 mL熔融培养基加入60 mm的培养皿中。
- 在室温下静置30–45分钟，使平板凝固。
- 将平板倒置，于4 °C保存，最长可保存4周。
注意：保持平板湿度。在4 °C下存放时间不得超过4周。
- 准备真菌菌株
- 根据实验室操作手册说明，将各菌株接种于含完全培养基或最小培养基的小型玻璃试管中进行培养
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
接种野生型菌株后，分生孢子在36–48小时内覆盖了SC表面。经过7天的光周期处理后，形成致密的分生孢子层，并用浸透70%乙醇的湿润纸巾将其去除（图1）。此步骤暴露了下方的原子囊果，同时未破坏其结构。在显微镜下，原子囊果呈现为分布在培养皿表面的深色圆形结构，具有球形形态，并可与周围的菌丝区分开来。在同一培养皿内，原子囊果的大小通常较为均一，其分布情况随光周期条件而变化。在类似昼夜平分的光周期条件下培养的培养皿中，原子囊果形成密集；而在短日照条件下，形成的结构较少。
图1：培养皿的.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
PPA 的目标是利用真菌的性发育作为判断生物体是否感知特定光周期的替代指标。通过量化在不同光周期条件下产生的原生子囊壳平均数量，可以评估并比较不同条件下的光周期反应。与先前的观察结果一致4,16，N. crassa 在类似昼夜平分的光周期下表现出更高的原生子囊壳产量，而在短日照条件下产生的结构较少（图2）。该实验方法提供了一种在受控实验室条件下，于真菌模型系统中研究光周期依赖性发育反应的手段。由于真菌中的光周期反应在表型上已有充分记录17,18，但其机制仍不甚明确，且目前可用的标准化检测方法较少4,18，因此 PPA 提供了一种进行定量分析的方法。
成功执行.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无竞争利益。
致谢
作者感谢 Cathyrn Maienza、Myo Thinzar Htin Aung、Aye Thinzar Htin Aung 和 Morgan Bartleson 对本项目提供的支持、协助与贡献。作者还感谢罗格斯大学卡姆登分校生物系以及计算与整合生物学中心（CCIB）为本研究提供的机构支持、科研设施和资源。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | BD | 90000-786 | 用于合成杂交培养基/最小培养基 |
| 酒精灯火焰 | Wards | 470346-104 | 用于灭菌接种环 |
| 六水合硫酸铁铵 | Supelco | FX0245-1 | 用于合成杂交培养基/最小培养基 |
| 硝酸铵（NH4NO3） | BeanTown Chemical | BT134170-250G | 用于最小培养基 |
| 高压灭菌器 | VWR International | 76683-456 | 用于玻璃器皿和培养基的灭菌 |
| 生物安全柜 | ThermoFischer Scientific | 1323TS | 用于减少平板和实验室的污染 |
| 生物素 | VWR | 97061-444 | 用于合成杂交培养基 |
| 硼酸（H3BO3） | Electron Microscopy Sciences | 100503-696 | 用于合成杂交培养基/最小培养基 |
| 氯化钙（CaCl2） | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT1311-1 | 用于合成杂交培养基 |
| 二水合氯化钙（CaCl2·2H2O） | Sigma-Aldrich | 223506-25G | 用于最小培养基 |
| 一水合柠檬酸（C6H8O7·H2O） | Sigma-Aldrich | 1002440500 | 用于合成杂交培养基/最小培养基 |
| 五水合硫酸铜（CuSO4·5H2O H2O） | BeanTown Chemical | BT121245-1KG | 用于合成杂交培养基/最小培养基 |
| 乙醇 | Decon Labs | 71001-754 | 用于从平板表面去除分生孢子及灭菌接种环 |
| FIJI/ImageJ | 美国国立卫生研究院（NIH） | N/A | 用于图像分析/计数 |
| 手套 | SW Safety Solutions | 76382-944 | 用于安全防护 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | N/A | 用于执行统计检验和生成图表 |
| 生长培养箱 | Caron Products & Services | 6320 & 6340 系列 | 可编程控制光周期循环 |
| HOBO 数据记录仪 | Onset Computer Corporation | MX2202 | 用于光照强度和温度记录 |
| 接种环 | VWR International | 10806-354 | 用于将真菌材料转移至培养皿 |
| 七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O） | BeanTown Chemical | BT145380-1KG | 用于合成杂交培养基/最小培养基 |
| 一水合硫酸锰（MnSO4·H2O H2O） | Sigma-Aldrich | 1059410250 | 用于合成杂交培养基/最小培养基 |
| 显微镜（Leica S6 D Greenough 体视显微镜） | Leica Microsystems | 10446297 | 用于成像 |
| 粗糙脉孢菌 FGSC 2489 | 真菌遗传资源中心 | 74-OR23-1VA, JCM19069 | 真菌菌株 |
| 纸巾 | Kimberly-Clark Professional, Scott 和 Kleenex | 6666114 | 用于倾注培养基 |
| 永久性记号笔 | Sharpie | 30072 | 用于标记培养皿 |
| 培养皿 | VWR International | 25384-164 | 用于接种合成杂交培养基 |
| 移液管 | VWR International | 75816-090 | 用于倾注培养基 |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | BeanTown Chemical | BT225070-500G | 用于合成杂交培养基/最小培养基 |
| 硝酸钾（KNO3） | Sigma-Aldrich | 221295-100G | 用于合成杂交培养基 |
| 小型一次性玻璃试管 | VWR International | 470211-698 | 用于初始真菌菌株培养 |
| 氯化钠（NaCl） | VWR International | BDH9286-500G | 用于合成杂交培养基 |
| 二水合柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O） | VWR | 97061-008 | 用于最小培养基 |
| 氢氧化钠（NaOH） | AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLC | JT5635-2 | 用于合成杂交培养基 |
| 二水合钼酸钠（Na2MoO4·2H2O） | Supelco | 1.06524.1000 | 用于合成杂交培养基/最小培养基 |
| 蔗糖 | VWR International | BDH9308-500G | 用于合成杂交培养基/最小培养基 |
| 七水合硫酸锌（ZnSO4·7H2O） | BeanTown Chemical | BT122545-500G | 用于合成杂交培养基/最小培养基 |
参考文献
- Wood SH et al. Circadian clock mechanism driving mammalian photoperiodism. Nat Commun. 2020;11:4291.
- Wikelski M et al. Avian circannual clocks: adaptive significance and possible involvement of energy turnover in their proximate control. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008;363:411-23.
- Wang Q et al. Plants distinguish different photoperiods to independently control seasonal flowering and growth. Science. 2024;383:eadg9196.
- Tan Y, Merrow M, Roenneberg T. Photoperiodism in Neurospora crassa. J Biol Rhythms. 2004;19:135-43.
- Kumar V. Photoperiodism in higher vertebrates: an adaptive strategy in temporal environment. Indian J Exp Biol....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
