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方法文章

基于平板成像的光周期反应定量分析方法 Neurospora crassa 利用原子囊果发育

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DOI：

10.3791/71271

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2026年6月9日

 , 
1Center for Computational and Integrative Biology (CCIB) Rutgers, The State University of New Jersey, 2Rutgers University-Camden, Department of Biology Rutgers, The State University of New Jersey, 3Institute for Empowering Equitable Education in STEM (E3-STEM)

本文内容

摘要

原子囊果测定法通过在特定光暗周期下测量粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）原子囊果的形成情况，来量化其光周期反应。该基于平板的方法为比较不同实验条件下光周期依赖性发育反应提供了一种简单且可扩展的技术途径。

摘要

Neurospora crassa 是研究生物节律和光调控发育的成熟模式生物。 原基囊果测定法（Protoperithecia Assay, PPA）是一种基于平板成像的技术，通过检测原基囊果的形成作为发育输出指标，用于量化光周期反应。本实验方案旨在提供一种可重复且可扩展的工作流程，以评估特定光暗循环对真菌有性发育的影响。在该测定中，真菌培养物在合成交配培养基上于受控的光周期条件下生长，随后通过标准化方法去除表面分生孢子以提高观察清晰度。原基囊果的数量通过基于图像的手动计数获得，每平板的平均计数用于不同光周期条件间的统计学比较。与以往方法不同，PPA整合了标准化的培养条件、可控的光周期暴露以及基于象限的成像策略，从而实现不同菌株间可重复的定量比较。该工作流程不仅是一个基础实验方案，更建立了一个在明确定义的实验条件下，用于测量光周期依赖性发育输出的一致且可扩展的框架。该方法从接种到分析约需一周时间，可在多种菌株及特定环境条件下应用。PPA为在受控实验室条件下对真菌光周期依赖性发育进行比较分析提供了一个简单且易于实施的技术平台。 关键词：原基囊果测定法，PPA，光周期反应，真菌有性发育，光暗循环，发育输出，成像分析，定量比较，标准化工作流程，实验室培养

引言

原子囊果测定法（PPA）用于量化粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的光周期反应。许多生物通过感知昼夜长度来协调其生物学过程，这一现象称为光周期现象1,2,3,4,5,6,7,8。 在该实验中，雌性生殖结构——原子囊果的发育程度可作为可测量的、依赖光照的光周期反应指标。尽管通过“暗期间断”实验已在植物中对光周期现象进行了充分表征3，但针对真菌等非光合真核生物的光周期反应，目前仍缺乏标准化的定量方法。N. crassa 因其清晰的遗传背景和光响应发育通路，成为研究该问题的理想模型系统。跨物种研究已观察到光周期依赖性的生殖时间调控现象1,2,3,4,5,6,7,8，这支持了光驱动生理反应的普遍意义；然而，真菌中相关机制的研究仍受限于缺乏可重复的实验方法。

原子囊壳是粗糙脉孢菌（N. crassa）中未成熟的雌性生殖结构。它们起源于产囊体，后者发育出卷曲的受精丝，与相反交配型的菌丝或分生孢子发生融合9。融合后，“雄性”亲本的细胞核进入原子囊壳。原子囊壳的产生数量受季节调控，并强烈依赖于光照诱导10。光周期调控在生态学、时间生物学和真菌生理学中具有核心作用，因为许多受生物钟控制的过程均依赖于光信号。光信号影响多个遗传通路，包括光感受器、激酶以及与有性发育相关的光信号转导机制11。由于原子囊壳可在显微镜下清晰观察，并对光刺激具有高度敏感性，因此非常适合作为光周期反应的检测指标。

尽管光周期现象在真菌中具有重要意义，但目前可用于在受控光照周期下定量原丝子实体产生的标准化且可重复的检测方法仍然很少。一种中等通量的基于平板的检测方法具有重要价值，因为真菌是成本低廉且易于维持的模式生物，能够实现对光诱导的有性发育及基因功能的系统性分析。大多数光周期研究集中在植物上，而针对真菌系统的等效定量研究框架仍十分有限。在其他生物体（包括昆虫）中，诸如滞育等依赖光的现象已被充分表征7，但在真菌中尚缺乏可比的研究方法。这一空白限制了在不同菌株和实验条件下对光周期响应进行可重复的比较研究。

PPA 基于一项 2004 年的研究，该研究在节律异常（bd）突变体（ras-1bd）中测量了从持续黑暗到持续光照条件下，随着日照时间延长原生子囊果的产生情况，该突变体已被用于昼夜节律研究4,12。在此遗传背景下观察到了光周期依赖性的原生子囊果产生变化。本实验流程在参考菌株 FGSC 2489 中改进并拓展了该方法，该菌株与全基因组测序及基因敲除资源相关联13,14。该检测方法通过量化在一周内特定光周期条件下产生的原生子囊果平均数量，作为光周期响应的替代指标。该方法对培养条件、成像和定量过程进行了标准化，从而实现不同实验条件和菌株间的可重复比较。关键的方法学改进包括基于平板的标准化培养条件、明确的光周期暴露参数、基于象限的成像方法以及可重复的定量分析流程。

本方案通过测量N. crassa在特定光暗周期处理后原生子囊壳的形成情况，来定量其光周期反应。每种光周期条件下使用四个生物学重复，每个重复包含一个独立接种的合成杂交（SC）培养皿。每个培养皿采集四张图像，取平均值作为该生物学重复的单一数值用于统计分析。培养皿在经过校准的光周期条件（例如12小时光照:12小时黑暗或8小时光照:16小时黑暗）下培养七天。

将数据记录仪置于培养室内部，以持续记录光照强度、温度和湿度，从而验证环境条件的稳定性。光照强度需维持在1,000 lux以上，因为较低的光照水平会减少原子囊壳的产生。应避免过强的光照，以防培养室温度升高并引发混杂的热效应。培养结束后，用浸透70%乙醇的湿润纸巾轻轻去除大分生孢子。使用体视显微镜在明场照明下，以40×放大倍数对每个培养皿边缘四个等间距的象限进行成像。通过图像处理软件手动计数原子囊壳，各培养皿的平均计数值用于不同光周期之间的统计学比较。

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方案

所使用的试剂、软件和设备列在材料表中。

1. 培养基与材料的准备

（预计时间：1–1.5 小时主动操作时间；可选过夜冷却）

  1. 配制合成培养基（SC培养基）
    1. 配制SC培养基：0.2%蔗糖、5 µg/L生物素、1.5%琼脂，以及Westergaard盐溶液（用1 N NaOH调节pH至6.5）15。
    2. 将培养基高压灭菌。冷却至50–55 °C，使其达到可倾倒状态。
      ​注意：从高压灭菌器中取出锥形瓶时，请使用耐热手套。
  2. 倒平板
    1. 使用一次性移液管将10 mL熔融培养基加入60 mm的培养皿中。
    2. 在室温下静置30–45分钟，使平板凝固。
    3. 将平板倒置，于4 °C保存，最长可保存4周。
      ​注意：保持平板湿度。在4 °C下存放时间不得超过4周。
  3. 准备真菌菌株
    1. 根据实验室操作手册说明，将各菌株接种于含完全培养基或最小培养基的小型玻璃试管中进行培养15。
    2. 将试管置于30 °C恒温、持续黑暗（DD）条件下培养，直至试管表面形成可见的菌丝覆盖层（通常为2–3天）。
      注意：操作真菌培养物时应遵循标准微生物操作规范，并在生物安全柜内操作，以尽量减少污染风险。

2. 平板接种

（预计时间：每组平板 15–30 分钟）

  1. 转移真菌分生孢子
    1. 使用无菌技术及接种环接种每块SC平板。
    2. 将分生孢子置于平板中央，以确保生长均匀（图1A）。分生孢子呈粉末状、浅色孢子，覆盖菌落表面。
    3. 接种时使用约1–2 µL浓缩的分生孢子悬液（或等量的接种环取样），以实现各平板间接种量的标准化。
  2. 准备平板进行培养
    1. 妥善封闭平板，以防止污染，同时允许气体交换。
    2. 在每块平板上标记菌株名称、日期和光周期条件。

3. 光周期处理设置

（预计时间：10 分钟准备 + 7 天培养）

  1. 校准培养室
    1. 将培养室温度设置为 25 °C。
    2. 将湿度设为 50%（可接受范围：40%–60%），以防止培养皿干燥。
    3. 设定光周期循环：EQ（昼夜平分）：12 小时光照 / 12 小时黑暗；SDP（短日照）：8 小时光照 / 16 小时黑暗。
    4. 使用经校准的照度计，将培养皿位置的光照强度设置为 >1,000 lux。避免光照强度导致培养室内温度超过 25 °C。
      注意：确保培养室光源不会使内部过热。
      ​警告：请勿使用Parafilm或塑料袋维持湿度，因其会限制气体交换并抑制真菌生长。若无法控制湿度，可在培养室内放置一个盛水容器作为加湿装置。
  2. 将培养皿放入培养室
    1. 将培养皿均匀放置在架子上，以确保光照均匀。
    2. 在培养室内放置一个数据记录仪，持续监测温度和湿度，以确认环境条件稳定。
  3. 开始实验
    1. 将培养皿在设定的光周期条件下培养 7 天，期间避免扰动。

4. 监测并准备用于成像的平板

（预计时间：每块板 15–20 分钟）

  1. 从培养箱中取出培养皿
    1. 培养7天后取出培养皿。
    2. 检查培养皿中分生孢子的生长情况及原子囊果的形成。
  2. 清洁培养皿以提高观察清晰度
    1. 使用撕成小块的纸巾清除培养皿盖和琼脂表面的分生孢子（图1B）。
    2. 将一张纸巾用1–2 mL的70%乙醇润湿，轻轻拍打培养皿表面3–5次以去除分生孢子。成像前让培养皿在空气中干燥1–3分钟（图1C）。
      注意：乙醇易燃，应远离热源。
      备注：避免施加过大压力。切勿拖动纸巾摩擦琼脂表面，以免损伤培养基或扰动原生子囊果。

5. 成熟前期子囊果的成像

（预计时间：每块板 5 分钟）

  1. 准备成像
    1. 设置显微镜，保持光照和放大倍数一致（通常为 40×）。
    2. 确保培养皿表面干燥且无碎屑。
  2. 采集图像
    1. 使用一致的放大倍数，在培养皿边缘均匀选取四个象限进行成像。
    2. 为每张图像标注菌株、光周期条件、培养皿编号及象限位置。
    3. 以统一格式（例如 TIFF）保存图像用于分析。

6. 定量与数据分析

（预计时间：每块平板计数需10–20分钟；分析需15–25分钟）

  1. 计数原子囊果
    1. 在图像处理软件中打开每张图像。
    2. 使用细胞计数插件手动计数原子囊果。排除气泡、边缘伪影和结构不明确的物体。将成簇的原子囊果按可区分的个体单位分别计数。
    3. 记录每个象限的计数结果，并计算每块培养皿的平均值。
  2. 数据分析
    1. 将定量数据导入统计分析软件。
    2. 采用韦尔奇t检验（Welch’s t-test）对图2所示数据进行统计分析。
    3. 绘制图表，比较不同光周期处理、菌株或重复实验之间的差异。

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结果

接种野生型菌株后，分生孢子在36–48小时内覆盖了SC表面。经过7天的光周期处理后，形成致密的分生孢子层，并用浸透70%乙醇的湿润纸巾将其去除（图1）。此步骤暴露了下方的原子囊果，同时未破坏其结构。在显微镜下，原子囊果呈现为分布在培养皿表面的深色圆形结构，具有球形形态，并可与周围的菌丝区分开来。在同一培养皿内，原子囊果的大小通常较为均一，其分布情况随光周期条件而变化。在类似昼夜平分的光周期条件下培养的培养皿中，原子囊果形成密集；而在短日照条件下，形成的结构较少。

培养皿微生物生长对比，实验结果展示不同培养阶段的菌落生长情况。
图1：培养皿的...

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讨论

PPA 的目标是利用真菌的性发育作为判断生物体是否感知特定光周期的替代指标。通过量化在不同光周期条件下产生的原生子囊壳平均数量，可以评估并比较不同条件下的光周期反应。与先前的观察结果一致4,16，N. crassa 在类似昼夜平分的光周期下表现出更高的原生子囊壳产量，而在短日照条件下产生的结构较少（图2）。该实验方法提供了一种在受控实验室条件下，于真菌模型系统中研究光周期依赖性发育反应的手段。由于真菌中的光周期反应在表型上已有充分记录17,18，但其机制仍不甚明确，且目前可用的标准化检测方法较少4,18，因此 PPA 提供了一种进行定量分析的方法。

成功执行...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

作者感谢 Cathyrn Maienza、Myo Thinzar Htin Aung、Aye Thinzar Htin Aung 和 Morgan Bartleson 对本项目提供的支持、协助与贡献。作者还感谢罗格斯大学卡姆登分校生物系以及计算与整合生物学中心（CCIB）为本研究提供的机构支持、科研设施和资源。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂BD90000-786用于合成杂交培养基/最小培养基
酒精灯火焰Wards470346-104用于灭菌接种环
六水合硫酸铁铵SupelcoFX0245-1用于合成杂交培养基/最小培养基
硝酸铵（NH4NO3）BeanTown ChemicalBT134170-250G用于最小培养基
高压灭菌器VWR International76683-456用于玻璃器皿和培养基的灭菌
生物安全柜ThermoFischer Scientific 1323TS用于减少平板和实验室的污染
生物素VWR97061-444用于合成杂交培养基
硼酸（H3BO3）Electron Microscopy Sciences100503-696用于合成杂交培养基/最小培养基
氯化钙（CaCl2）AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLCJT1311-1用于合成杂交培养基
二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）Sigma-Aldrich223506-25G用于最小培养基
一水合柠檬酸（C6H8O7·H2O）Sigma-Aldrich1002440500用于合成杂交培养基/最小培养基
五水合硫酸铜（CuSO4·5H2O H2O）BeanTown ChemicalBT121245-1KG用于合成杂交培养基/最小培养基
乙醇Decon Labs71001-754用于从平板表面去除分生孢子及灭菌接种环
FIJI/ImageJ美国国立卫生研究院（NIH）N/A用于图像分析/计数
手套SW Safety Solutions76382-944用于安全防护
GraphPad PrismGraphPad Software, LLCN/A用于执行统计检验和生成图表
生长培养箱Caron Products & Services6320 & 6340 系列可编程控制光周期循环
HOBO 数据记录仪Onset Computer CorporationMX2202用于光照强度和温度记录
接种环VWR International10806-354用于将真菌材料转移至培养皿
七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）BeanTown ChemicalBT145380-1KG用于合成杂交培养基/最小培养基
一水合硫酸锰（MnSO4·H2O H2O）Sigma-Aldrich1059410250用于合成杂交培养基/最小培养基
显微镜（Leica S6 D Greenough 体视显微镜）Leica Microsystems10446297用于成像
粗糙脉孢菌 FGSC 2489真菌遗传资源中心74-OR23-1VA, JCM19069真菌菌株
纸巾Kimberly-Clark Professional, Scott 和 Kleenex6666114用于倾注培养基
永久性记号笔Sharpie30072用于标记培养皿
培养皿VWR International25384-164用于接种合成杂交培养基
移液管VWR International75816-090用于倾注培养基
磷酸二氢钾（KH2PO4）BeanTown ChemicalBT225070-500G用于合成杂交培养基/最小培养基
硝酸钾（KNO3）Sigma-Aldrich221295-100G用于合成杂交培养基
小型一次性玻璃试管VWR International470211-698用于初始真菌菌株培养
氯化钠（NaCl）VWR InternationalBDH9286-500G用于合成杂交培养基
二水合柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）VWR97061-008用于最小培养基
氢氧化钠（NaOH）AVANTOR PERFORMANCE MATERIAL LLCJT5635-2用于合成杂交培养基
二水合钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）Supelco1.06524.1000用于合成杂交培养基/最小培养基
蔗糖VWR InternationalBDH9308-500G用于合成杂交培养基/最小培养基
七水合硫酸锌（ZnSO4·7H2O）BeanTown ChemicalBT122545-500G用于合成杂交培养基/最小培养基

参考文献

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