儿童队列中Ⅰ型干扰素病相关血管炎的常见遗传变异类别

摘要

对1204名疑似自身炎症性疾病的儿科患者进行全外显子组测序，发现其中132例存在与干扰素病相关的变异，包括79种新发突变。这些变异多数为杂合型，且与血管炎表型相关。这些发现强调了基因检测在诊断中的价值，以及I型干扰素信号通路失调在儿科血管炎中的核心作用。

摘要

儿童血管炎传统上通过组织病理学评估进行诊断；然而，目前临床实践中越来越多地采用创伤较小的基于影像学的诊断方法。尽管如此，确定潜在的单基因病因对于理解疾病机制、预测预后以及指导靶向治疗策略仍然至关重要。I型干扰素病是一组异质性的免疫介导性疾病，其特征为持续性干扰素信号激活，并常表现为血管炎或血管病变。核酸感应通路的持续激活以及细胞内稳态失衡可导致内皮功能障碍和慢性血管炎症。

本研究提出了一种全面的遗传分析工作流程，用于在儿童自身炎症性疾病队列中检测与血管炎相关的干扰素病相关基因变异。对1,204名疑似自身炎症性疾病的患者进行了全外显子组测序。采用基于美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南的生物信息学流程，分析影响编码区和剪接位点的变异，并结合受离散傅里叶变换（DFT）和统计分布启发的统计过滤与信号处理技术，以提高变异位点的优先排序与解读准确性。

通过风湿病门诊数据库评估了132名儿科患者，发现了与干扰素病相关的变异。总体共检测到92个独特的变异，其中包括13个先前报道过的致病性或可能致病性变异，以及79个截至2026年2月未在公共数据库中记录的 novel 变异。临床表现主要包括反复发热、血管炎样表现以及复杂的自身炎症表型。

这些变异涉及与干扰素信号失调和先天免疫激活相关的基因，包括与STING激活、核酸代谢以及细胞内转运功能障碍相关的通路。这一跨学科的工作流程展示了基因组分析在儿童血管炎中的潜在诊断价值，并强调了持续的干扰素信号在血管损伤和自身炎症性疾病发病机制中的重要性。

引言

儿童血管炎的传统诊断方法是通过组织病理学评估，该方法至今仍是诊断的金标准。然而，近年来的诊断策略 increasingly 倾向于采用创伤性更小的方法，尤其是基于影像学的检查手段。尽管如此，在儿童血管炎中明确潜在的单基因病因至关重要，因为这有助于深入理解疾病的发病机制、判断预后，并为靶向治疗提供可能^1,2。

当儿童出现全身性炎症和多器官受累时，应怀疑儿童血管炎。确诊需要详尽的病史采集、全面的体格检查、实验室检查、影像学检查，以及在某些情况下进行组织活检，以明确诊断并排除其他类似疾病。早期发现和治疗至关重要，因为未经治疗的疾病可能导致危及生命的并发症或长期后遗症¹。

I型干扰素病包括一系列多样化的单基因和复杂免疫介导性疾病，其特征为持续的I型干扰素通路激活以及反复出现的血管炎或血管病变表现^3,4核酸感应失调和细胞内稳态受损是将持续性干扰素过度产生与血管炎症及损伤相联系的核心致病机制。TMEM173（STING1）基因的功能获得性突变可导致婴儿期发病的STING相关性血管病变（SAVI），而常染色体显性遗传的COPA基因突变会破坏内质网-高尔基体间的囊泡运输，引起STING异常活化，从而导致血管炎表型。^3-5由核酸代谢基因（TREX1、RNASEH2A/B/C、SAMHD1、ADAR1 和 IFIH1）缺陷引起的其他干扰素病进一步强调了干扰素失调与血管病变之间的机制联系³ （参见 图1).

图1。驱动儿童群体中内皮功能障碍和微血管损伤的I型干扰素病的详细致病结构。 （左）儿童I型干扰素病的系统背景：自我与非我识别缺陷以及宿主核酸感应异常触发系统性自身炎症。临床表型以早发性皮肤血管病变和系统性受累为显著特征，常表现为类似冻疮的皮肤损害。（中）从遗传缺陷到系统失调的机制级联：核酸清除酶（如DNASE1、TREX1）的功能缺失突变导致内源性DNA和RNA在细胞质中异常积聚。同时，STING1等感受器的功能获得性突变驱动cGAS-STING通路在无病毒刺激的情况下持续活化。这种致病性的细胞内核酸感应过度激活干扰素调节因子，导致I型干扰素（IFN-α/β）持续合成。慢性细胞因子释放通过IFNAR1/2受体建立自我维持的系统性放大回路，并因清除机制受损和正反馈调控而加剧。（右）病理结局：循环中的IFN-α/β持续结合内皮细胞受体复合物，诱导JAK-STAT通路持续活化。这种持续的稳态破坏引发内皮细胞持续应激，并损害生理性血管舒张机制。在毛细血管水平，这种高炎症状态导致内皮细胞直接损伤、血管壁显著增厚以及管腔内微血管血栓形成，最终导致严重组织缺血和坏死性微血管病变，且不依赖于自身抗体介导的自身免疫通路。缩写：cGAS-STING = 环状GMP-AMP合酶—干扰素基因刺激因子；DNASE1 = 脱氧核糖核酸酶1；GoF = 功能获得性；IFN = 干扰素；IFNAR = 干扰素α/β受体；IRF = 干扰素调节因子；JAK-STAT = Janus激酶—信号转导子和转录激活子；STING1 = 干扰素反应刺激因子cGAMP互作蛋白1；TREX1 = 3'修复外切酶1。 请点击此处查看该图的放大版本。

该方法旨在检测儿童自身炎症性疾病队列中与干扰素病相关的基因变异，因为传统方法在对罕见突变进行早期优先排序时可能面临分析挑战，而中性粒细胞的异质性在预测复发风险中起着关键作用⁶。文献中已通过单细胞分析阐明了干扰素信号通路失调在小血管血管炎中的作用，凸显了全外显子组测序（WES）在儿童队列中实现早期诊断的优势⁶。

单基因自身炎症综合征可能表现为血管炎或类似血管炎的症状。例如，SAVI 可模拟小血管或中血管血管炎⁷。类似地，幼年特发性关节炎（JIA）是一组异质性的儿童期起病的炎症性疾病，可能持续至成年期，并与类似干扰素病的失调相关，这强调了在儿童队列中进行遗传学分析的必要性⁸。

I型干扰素病是一类孟德尔遗传性免疫缺陷病，其特征是宿主来源的核酸触发抗病毒感受器的异常激活，表现为自我与非我识别功能的障碍^3,4。这类疾病以I型干扰素信号通路的上调为定义性特征，皮肤表现常提供重要的诊断线索。SAVI与TMEM173基因的功能获得性突变相关，临床表现为早发性皮肤血管病变和肺部炎症⁹。其中p.V155M突变是最常报道的变异形式¹⁰。SAVI是一种罕见的自身炎症性疾病，由STING1基因突变引起，特征为早发性间质性肺病（ILD）和皮肤损害，临床表现可类似系统性红斑狼疮（SLE）¹¹。I型干扰素信号的失调也见于抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）相关性血管炎（AAV）。在AAV中，I型干扰素特征性表达主要见于显微镜下多血管炎/髓过氧化物酶-ANCA相关性血管炎（MPA/MPO-AAV），并与肾脏预后相关，提示罕见变异在干扰素失调中的作用¹²。

单基因自身炎症综合征可能表现为血管炎或类似血管炎的症状。例如，STING相关血管病变（SAVI）可模拟小血管或中血管血管炎⁷。此前已有研究报道了全球最大的携带STING1激活突变患者的队列，进一步扩展了对SAVI临床和免疫学表型特征的认识¹³。在过去的二十年中，人们对造血细胞和非造血细胞识别病原体的机制取得了显著进展。微生物组分通过种系编码的受体被检测，这是启动该免疫应答的关键步骤¹⁴。2006年研究发现，将DNA转染至多种细胞类型可诱导I型干扰素上调，且该过程不依赖于Toll样受体（TLR）。在此背景下，STING作为一种定位于内质网的跨膜蛋白，于2008年被确认为合成DNA和病毒DNA诱导I型干扰素应答的关键中介分子¹³。STING1的功能获得性突变会导致一种I型干扰素病，称为SAVI⁹˒¹⁰˒¹⁴。该疾病严重，临床表现多样，通常包括早发性系统性炎症、皮肤血管病变以及间质性肺疾病（ILD）¹⁴。SAVI极为罕见，截至目前共报道了来自37个家族的52例患者，多数病例为新生突变所致，但也有常染色体显性遗传的记录。此前已有研究描述了全球最大的携带激活型STING1突变的患者队列，提供了对SAVI更全面的临床与免疫学表型特征的刻画^9,10,11˒¹⁴。

本方案旨在通过基于全外显子组测序（WES）的遗传学分析，在表现为自身炎症特征的儿科患者中实现干扰素病相关基因变异的早期检测，因为传统方法往往难以识别罕见突变，可能错失早期干预的机会。文献表明，通过研究孟德尔遗传病，干扰素上调在类似血管炎表型中的作用已得到阐明，这进一步凸显了WES在检测罕见变异方面的优势^4,7,12。

本方法的主要目标是将基于物理的信号处理原理与简化的生物物理计算建模相结合，以支持在I型干扰素病的全外显子组测序（WES）数据中进行变异检测，同时解读其对干扰素信号通路的下游影响，特别是Janus激酶-信号转导子和转录激活子（JAK-STAT）级联反应。这种探索性方法旨在补充对免疫介导疾病中常受测序噪声和覆盖不均影响的基因组区域的分析，此类疾病中干扰素激活失调可导致血管炎表型。标准的生物信息学工作流程通常聚焦于常规质量指标，在识别STING1或TREX1等基因复杂区域中的变异时，可能仍需额外的辅助过滤手段。通过应用受离散傅里叶变换（DFT）和统计分布启发的信号处理技术，该方法从核苷酸序列中提取潜在的基因组特征，将碱基（A、T、C、G）映射为二进制指示符，用于突变模式分析¹⁵。此外，干扰素通路的生物物理建模引入了阈值行为和累积信号放大效应，以评估遗传变异如何持续导致内皮功能障碍，重点关注JAK-STAT通路在传递I型干扰素（IFN-α/β）信号中的作用。

该探索性应用旨在研究低覆盖度区域中的比对谱型。尽管标准的计算工具可提供初级的变异过滤，但本支持性模型进一步探讨了基于信噪比（SNR）的评估方法是否能够对受非均匀读段分布影响的编码区单核苷酸变异（SNVs）实现次级定性筛选。这种基于物理原理的方法利用信噪比优化来评估基因型质量及次要读段比例。在更广泛的研究文献中，类似的随机建模揭示了JAK-STAT通路呈现梯度响应而非全或无的动力学特征，从而有助于更准确地预测干扰素的过度产生¹⁶。JAK-STAT通路由I型干扰素（IFNs）与IFNAR1/IFNAR2受体结合后激活，其过程涉及Janus激酶（JAK1、TYK2）对STAT1和STAT2的磷酸化，并与IRF9形成ISGF3复合物，进而转入细胞核并启动ISG的转录¹⁷。该过程可通过常微分方程（ODEs）对IFN-β的诱导进行建模：

其中所列参数代表磷酸化速率、去磷酸化过程以及通过 SOCS1 实现的负反馈，突显了依赖阈值的信号放大效应¹⁷。其他细节包括 STAT1 同源二聚体的形成在 IFN-γ 信号传导中的作用；但在 I 型干扰素病中，持续的激活会导致干扰素刺激基因（ISG）的过度表达。随机模拟进一步考虑了系统变异性，采用 Gillespie 算法对受体-配体结合及核转运过程中的噪声进行建模，揭示了细胞间干扰素反应的异质性¹⁶。该方法特别适用于研究自身炎症性血管炎的研究人员，因为它提供了将遗传变异与通路失调关联起来的定量框架，例如通过扩展的常微分方程（ODE）纳入旁分泌效应：

其中所列参数代表产生速率、降解速率以及旁分泌增强作用¹⁸。拥有高通量测序数据和计算资源的用户可应用此方法优先筛选候选变异位点，并探索潜在的通路效应。

本研究采用多学科风湿病学与遗传学方法，针对一组表现出自身炎症特征的大型儿童队列，通过基于临床外显子组测序（CES）/全外显子组测序（WES）的遗传分析方案，鉴定干扰素病相关基因中与血管炎相关的变异，以克服血管炎分类困难及传统方法的局限性。此外，本研究旨在强调遗传学评估在儿童血管炎诊断中的价值。

2012年查珀尔希尔血管炎分类标准未包含单基因自身炎症性血管炎¹⁹。本研究旨在确定在一组患有自身炎症症状的儿童患者中检测到的干扰素病相关变异的频率，为罕见病数据库的扩充提供数据，并强调遗传学评估在儿童血管炎中的重要性。

方案

本方案经伊泽大学医学院伦理委员会批准。所有外周血样本均在获得患者或其法定监护人书面知情同意后采集，符合《赫尔辛基宣言》的规定。本项回顾性单中心研究旨在评估在接受遗传学分析的疑似自身炎症性疾病患者中，干扰素病相关变异的发生频率，并探讨其与血管炎的关系。研究纳入了2022年至2025年间送至伊泽大学分子医学实验室、初步诊断为自身炎症性疾病的外周血样本。共有1,204份样本接受了遗传学分析。采用靶向外显子及相邻内含子序列的二代测序（NGS）技术，即靶向外显子组测序（CES/WES）。根据ACMG标准和生物信息学分析对变异进行分类，排除良性及可能良性变异。其中，符合纳入标准的132例携带明确干扰素病相关变异的儿科病例被纳入最终研究队列。

在该儿童队列中，临床数据来自风湿病门诊数据库。在132例患者中共鉴定出92个独特的基因变异，其中包括13个此前已在公共变异数据库（如ClinVar）中报道过的致病性或可能致病性变异，以及79个截至2026年2月尚未在公共数据库中记录的 novel 变异。大多数变异为杂合型，与CAPS样表型或复杂的自身炎症性血管炎表现相关。外显子组测序（WES）采用靶向蛋白质编码区（外显子）及相邻内含子序列的高通量测序（NGS）技术，用于检测剪接位点及调控区域的变异。尽管WES仅覆盖人类基因组的约1%–2%，但它能捕获近85%的已知致病突变，因此是检测罕见变异的高效工具。

实验流程包括从外周血中提取基因组DNA、DNA片段化、连接接头的文库构建，以及通过生物素-链霉亲和素 pulldown 方法进行杂交捕获的外显子富集。在DNA纳米球测序平台上进行高通量双端测序，平均测序深度达到100–200x，以确保可靠的变异检测。生物信息学分析包括将测序数据比对至参考基因组、变异位点识别及利用经过人工审编的变异数据库进行注释，并依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南对变异进行分类。变异被归类为已报道过的或 novel（新发现的）。所筛选出的变异通过Sanger测序进行验证。

除了标准的生物信息学分析流程外，还应用了基于物理的信号处理原理和简化的计算建模方法，以评估测序深度、覆盖均匀性以及信噪比特征，从而为分析原始测序深度和区域覆盖情况提供一种探索性、补充性的分析层面。此外，采用生物物理建模概念来评估与血管炎相关的遗传变异的累积影响。

该跨学科框架作为初步的实验室模型，可用于探索性研究中分析变异过滤特征，尤其可为抗干扰素治疗策略提供指导。其局限性包括对低水平嵌合变异的检测敏感性降低，以及需要对新发现进行功能验证。潜在应用包括儿童血管炎的早期诊断、个体化治疗决策，以及扩展与免疫学、风湿病学和血管医学相关的变异数据库。

DNA片段化

将20 µL稀释后的DNA转移至新的无菌PCR管中。向每根PCR管中加入2 µL片段化/腺苷酸化缓冲液和3 µL片段化/腺苷酸化酶混合液，总体积为25 µL。轻轻混匀后短暂离心，并在热循环仪上运行片段化程序。程序一完成，立即对PCR管进行短暂离心并置于冰上。预期结果为DNA片段的平均长度在200–300 bp之间。

接头连接

向每种片段化产物中加入 2.5 µL 测序接头，随后加入 10 µL 连接反应主混合液（无需涡旋振荡）。轻轻吹打混匀，短暂离心后，将反应管置于热循环仪中，打开热盖，在 20 °C 下孵育 15 分钟。孵育结束后，短暂离心反应管并置于冰上保存。

基于微珠的纯化

向每个样品中加入30 µL磁珠，用移液器充分混匀，直至获得均一的悬浮液。混合物在室温下孵育5 min，然后将试管置于磁力架上静置3 min。待上清液澄清后，小心移除上清。沉淀用100 µL 80%乙醇洗涤两次，最后一次洗涤后去除残留乙醇。将磁珠置于磁力架上空气干燥，时间不超过5 min。加入9 µL无核酸酶水，通过移液重悬沉淀，并在室温下孵育2 min。经3 min磁力分离后，将7.5 µL上清液转移至新的标记好的PCR管中。

PCR 扩增

体外转录（IVT）引物被稀释（20 µL 引物原液 + 80 µL 无核酸酶水）。对于PCR反应（总体积17.5 µL），加入2.5 µL IVT引物1、2.5 µL IVT引物2和12.5 µL文库扩增预混液。轻轻吹打混匀后，进行PCR-3程序。

PCR后纯化

向每份PCR产物中加入25 µL磁珠。室温孵育5分钟后进行磁力分离，磁珠用100 µL 80%乙醇洗涤两次。空气干燥最多5分钟，加入11 µL无核酸酶水。将10 µL上清转移至新管中。测定文库浓度；目标： >25 ng/µL。

混合与杂交（每池样本数）

将文库进行混合，每池包含8个患者样本（每个样本93.75 ng，总量750 ng）。如有需要，用无核酸酶水将体积调整至12.5 µL。杂交混合物在65 °C预孵育15分钟。依次加入封闭液、通用封闭寡核苷酸、外显子捕获探针、无核酸酶水和杂交增强剂。启动16小时杂交程序（18:00–10:00）。

杂交靶标在链霉亲和素磁珠上的捕获

链霉亲和素磁珠用结合缓冲液洗涤三次。16小时杂交后，将混合物加入磁珠中，在25 °C孵育30分钟，每5分钟轻柔混匀一次。随后用捕获洗涤缓冲液1在室温下洗涤，再用预热（48 °C）的捕获洗涤缓冲液2洗涤三次，每次均在48 °C孵育。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于23 µL无核酸酶水中。

单链DNA（ssDNA）制备

加入24 µL TE缓冲液，混合物在95 °C变性3分钟，然后立即置于冰上。加入含有splint连接缓冲液和快速DNA连接酶的预混液，运行SS-2程序（37 °C，30分钟）以环化单链DNA。加入消化缓冲液和消化酶混合液，运行SS-3程序（37 °C，30分钟）。随后加入3.75 µL消化终止缓冲液。加入85 µL磁珠，进行标准磁珠纯化。将15 µL上清转移至新管中；预期浓度为0.8–2 ng/µL。

DNA纳米球（DNB）制备

将单链DNA产物用于DNA纳米球（DNB）的形成。加入DNB形成缓冲液、低EDTA TE缓冲液以及DNB酶混合液1和2。依次运行DNB-1和DNB-2程序。反应完成后，加入20 µL DNB反应终止缓冲液，并使用宽口吸头轻轻混匀（5–8次）；预期浓度为8–40 ng。制备好的DNA纳米球被加载至DNA纳米球测序平台进行高通量测序。

测序数据处理与信号分析

使用 FastQC（v0.11.9）和 fastp（v0.23.1）对原始测序读长进行质量控制。通过受试者工作特征（ROC）曲线分析，在已知自身炎症性变异位点的基准数据集上优化信噪比（SNR）阈值为 20 dB，在低频变异检测中平衡假阳性发现率（FDR）<1% 与目标灵敏度>95%；低于该 20 dB 阈值的读长被剔除。使用 BWA-MEM（v0.7.17）将测序数据比对至基因组参考联盟人类参考基因组 38 版（GRCh38），并使用基因组分析工具包（GATK，v4.2.6）进行初步的变异检测。

在基于物理的信号处理步骤中，核苷酸序列被转换为二进制数值信号（0 表示嘌呤；1 表示嘧啶）。为了计算离散傅里叶变换（DFT），采用长度为 N = 512 个碱基对的滑动窗口对二进制信号进行处理，并设置 50% 重叠（步长为 256 bp），以保持局部基因组分辨率。DFT 定义如下：

为了在不过度平滑真实单核苷酸变异（SNVs）的情况下滤除高频测序伪影（这些伪影表现为尖锐、局部的高频转换），通过程序化方式校准了一个低通数字滤波器。最优归一化截止频率（fc）通过在每碱基0.05–0.25个周期的范围内迭代扫描确定。优化算法选择fc = 0.15 cycles/base，定义为信号功率谱保留已知真阳性对照变异总方差≥85%的拐点，同时消除背景技术噪声。采用基于离散傅里叶变换（DFT）的滤波方法，使用Python（v3.9）编写的自定义脚本，特别调用NumPy（v1.23.0）和SciPy（v1.9.1）库，以降低高频噪声的同时保留与突变相关的频谱特征。滤波参数通过程序化方式迭代校准，以防止对稀有变异信号的过度平滑。信号处理与生物物理建模的集成工作流程总结于图2中。

干扰素信号传导的生物物理与随机建模

为了研究已鉴定变异的功能影响，使用定义的常微分方程（ODEs）对JAK–STAT信号通路动态进行了建模：

使用 COPASI（复杂通路模拟器，v4.36）执行确定性常微分方程（ODE）模拟，并利用基于 Python 的 scipy.integrate.solve_ivp 模块编写的自定义脚本进行验证。设定符合生物学实际的初始条件，并使用 SALib（Python 中的敏感性分析库，v1.4.5）对扩增速率常数进行敏感性分析。整合了 TYK2 介导的 IFN-α 信号动力学，以模拟功能获得性突变驱动的 STAT2 扩增。

采用朗之万方程引入随机效应：

dX  = f(X) dt + g(X)dW

此外，使用 GillesPy2 (v1.7.0) Python 库进行了吉列斯皮（Gillespie）随机模拟，以建模转录爆发以及异质性的干扰素-β诱导的干扰素刺激基因（ISG）激活。通过伽马核函数表示的分布延迟函数，在 Python 中采用数值积分方法实现，用于模拟延迟的转录反馈机制。所有计算流程，包括信号滤波和数学建模，均在基于 Linux 的高性能计算（HPC）环境中执行。

图2。JAK-STAT信号通路的信号处理与生物物理建模集成框架。 1：信号处理阶段：核苷酸序列的二进制映射（嘌呤 = 0，嘧啶 = 1），随后进行基于DFT的滤波。注意在准确识别变异时关键的信噪比（SNR）阈值为20 dB。2：生物物理建模：基于常微分方程（ODE）的扩增速率模拟，初始条件的微小扰动可导致持续信号传导中的阈值偏移。3：生物学表型：对IFN-α通路中TYK2功能获得性变异的建模，导致STAT2激活增强，并引发干扰素病表型。缩写：DFT = 离散傅里叶变换；IFN-α = 干扰素α；JAK-STAT = Janus激酶-信号转导子与转录激活子；ODE = 常微分方程；SNR = 信噪比；STAT2 = 信号转导子与转录激活子2；TYK2 = 酪氨酸激酶2。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2 总结了基于DFT的信号处理与在探索性计算工作流程中使用的常微分方程（ODE）和随机建模组件的整合。该综合性方案整合了先进的分子遗传学、高通量测序技术、信号处理算法和生物物理建模，以支持在儿童自身炎症性血管炎中检测干扰素病相关变异并进行功能解读。

统计框架与信号映射概率分布

在进行信号滤波之前，为规范基因组序列的数字化映射，建立了基于核苷酸生物化学特性的二进制转换框架。对于任意长度为 N 的结构基因组窗口，嘌呤 {A, G} 被映射为数字值 0，嘧啶 {C, T} 被映射为 1。在无偏、均匀背景基因组分布的零假设（H0）下，该二进制转换遵循伯努利试验框架。映射信号 X 的概率质量函数（PMF）定义如下

P(X = x) = p^x(1 - p)^1-x，其中 x ∈ {0,1}

其中 p = 0.5 表示在未选择的背景序列中遇到嘧啶残基的概率。当通过离散傅里叶变换（DFT）对连续碱基进行该转换以计算功率谱密度（PSD）时，累积的背景噪声分布表现为随机游走，根据中心极限定理收敛为高斯白噪声分布。因此，该零分布的归一化功率谱服从自由度为 2 的卡方（χ²）分布。为了保持严格的统计显著性阈值（α = 0.05），用于定义真实致病变异信号峰的关键功率强度阈值通过以下概率密度积分解析计算得出：

阈值 = - In(a) × a²

其中 σ² 表示局部背景基因组噪声基线的操作方差。任何超过该阈值的谱峰（p < 0.05，相当于信噪比 SNR > 20 dB）将被优先用于后续的计算机过滤步骤，以确保变异检测由数据驱动，且较少受到随机测序噪声的影响。

运行效率与成本分析（图3）

从转化医学和临床实施的角度，该整合方案的操作效率、临床周转时间（TAT）和经济可行性已与传统诊断路径（如逐项进行的Sanger测序或有限的靶向基因 panel）进行了对比评估。尽管针对儿童血管炎或疑似I型干扰素病的传统诊断流程常因逐个基因的迭代检测而持续8–12周，但本方案通过简化的流程——包括高通量全外显子组测序（WES）、优化的16小时杂交步骤，以及在高性能计算（HPC）集群上并行化的DFT信号滤波——从样本接收至最终分子报告的总临床TAT可缩短至10–14天。此外，由于高效的样本多重化处理（每个杂交反应模块中合并八个患者样本），核心试剂和测序成本约为每位患者250–300美元，显著低于传统综合性基因panel（通常超过1,200–1,800美元）。诊断周期和成本结构的双重压缩表明，这种受物理学启发的生物信息学工作流程在常规临床遗传学实验室中具有可行性和可扩展性。

结果

在这一包含132例携带已知与干扰素病相关变异患者的队列中，鉴定出一系列广泛的遗传变异（表1）。其中，53例（40.2%）为女性，79例（59.8%）为男性。患者的平均年龄为10.2岁（范围：0–18岁）。最终队列的个体患者数据见于补充表S1。

表1：在儿童自身炎症队列（n = 132）中发现的I型干扰素病相关遗传变异的分布与分类。 请点击此处下载该表格

最常受影响的基因为ADAR（25例患者，18.94%）和DNASE1（24例患者，18.18%）。DNASE1变异均为3类（占该基因变异的100%；占总队列的18.18%）。类似地，大多数ADAR变异也为3类（24例患者，96.00%；占队列的18.18%），仅有一例为2类变异（占该基因变异的4.00%；占队列的0.76%）（表2）。

表2：在罕见病NGS检测面板中鉴定出的变异。 请点击此处下载该表格

STING1（20例患者，15.15%）和RNASEH2B（14例患者，10.61%）的变异也较为常见。所有STING1变异均为3类（100%）。对于RNASEH2B，10例患者（71.43%）携带3类变异（占队列的7.58%），而4例患者（28.57%）携带2类变异（占队列的3.03%）。

在13例患者（9.85%）中检测到RNASEH2A突变，所有患者均携带3类变异（100%）。10例患者（7.58%）存在TREX1突变，其中包括8例3类变异（80.00%；占队列的6.06%）和2例2类变异（20.00%；占队列的1.52%）。

在9例患者中检测到SAMHD1变异（占6.82%），其中7例携带3类变异（占77.78%，占队列的5.30%），1例携带1类变异（占11.11%，占0.76%），1例携带2类变异（占11.11%，占0.76%）。

在8例患者（6.06%）中发现了RNASEH2C突变，所有突变均为3类。在6例患者（4.55%）中鉴定出DNASE1L3突变，其中包括5例3类变异（83.33%；占队列的3.79%）和1例2类变异（16.67%；0.76%）。PSMB8和COPA突变各在5例患者（3.79%）中被检测到，所有变异均为3类（100%）。DNASE2和STAT4突变各存在于3例患者（2.27%）中，所有变异均被归类为3类。

总体而言，在该队列的几乎所有基因中，3类变异构成了主要的变异类型。具体的变异位点，包括靶向基因中详细的核苷酸替换及其相应的氨基酸改变，均已列于表3中。

信号处理性能的探索性分析

为了探究基于DFT的信号处理流程的稳健性与灵敏度，本研究将其与标准的仅使用GATK的变异检测流程进行了对比基准测试，特别聚焦于低覆盖度基因组区域（测序深度 < 30x）。在初步基准测试中，整合DFT滤波流程在选定的低覆盖度区域显示出潜在的优先识别能力提升趋势，提示在此特定实验室控制条件下，探索性恢复率可达96.8%。需要强调的是，这些参数和数值效率指标代表的是在特定机构队列背景下校准得出的初步探索性结果，而非经过普遍验证的临床级分析流程。该流程还在高噪声区域成功恢复了此前被丢弃的真实阳性变异。此外，错误发现率（FDR）从6.4%降低至1.2%，凸显了低通滤波器在消除高频测序伪影方面的潜在稳健性。在队列中新发现的变异中，有14个变异（占新发现变异的17.7%），主要位于STING1和TREX1基因中覆盖度不均的区域，最初被标准算法阈值归类为低质量伪影，但在实施信噪比增强协议后，通过Sanger测序成功恢复并得到验证。这一分析结果表明，在探索性研究流程中，评估物理信号特征可能是一种有效的辅助工具。

与标准工作流程的比较基准测试

为了评估该集成框架的相对性能，我们将其与两种标准的变异检测流程进行了并行基准测试：GATK 最佳实践流程（BWA-MEM + GATK HaplotypeCaller v4.2.6）和 DeepVariant（v1.5）。性能指标通过队列中的高置信度验证子集进行计算，并在低覆盖度（深度 < 30x）和高噪声基因组区域中进行了评估。比较架构总结于 表4中。

计算模型的定量参数化与验证

为了在定量层面上建立生物物理与随机框架，将常微分方程（ODE）和Gillespie模拟基于实验对照条件下校准的经验动力学参数进行参数化。连续的ODE模拟追踪了模拟I型干扰素刺激后720分钟时间过程中磷酸化STAT2（[STAT2p]）绝对浓度的变化。在野生型（WT）计算模型中，信号级联表现出快速的稳态衰减特征：在t = 45 min时出现激活峰值，随后由模拟SOCS1表达介导的程序性负反馈（k3 = 0.45 min-1）驱动快速清除。相比之下，对STING1和TYK2通路中功能获得性（GoF）变异的建模揭示了显著的阈值偏移，导致持续性、无法衰减的过度炎症状态。信号半衰期（t1/2）和稳态倍数变化总结如下 表5.

数据可用性声明

https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology 与最终队列相对应的个体患者水平临床数据见补充表 S1。用于复现 DFT 滤波以及生物物理通路模拟（常微分方程和随机建模）所需的离散数字信号处理阈值、数学表达式、软件环境配置和计算参数均已公开。为确保读者永久且无障碍地访问，该复现框架已存入 GitHub 并通过 DOI 永久归档于 Zenodo：https://doi.org/10.5281/zenodo.20378497。GitHub 地址：https://github.com/drgulnarahmedova-pixel/DFT-WES-Pediatric-Cohort-Methodology。本工作流程中使用的标准开源软件库和数值计算平台，例如 NumPy、SciPy 和 COPASI，均可公开获取。

图3。用于识别及构建I型干扰素病相关变异体的可操作故事板与数据驱动型分析流程架构。 该示意图展示了一个按时间顺序排列的四层实验与计算工作流程，整合了临床队列分析与生物信号处理。(A) 队列分层与NGS分析流程：针对接受全外显子组测序（WES）的儿童自身炎症性疾病队列（n = 132）的工作流程。插图显示了代表性的原始FastQ质量控制Phred评分轨迹，随后进入GATK/DeepVariant变异检测流程，并最终生成VCF矩阵。(B) 基于离散傅里叶变换（DFT）的信号处理：将基因组文本信息算法转化为数值型基因组信号以实现噪声抑制。嵌入的数据驱动图展示了功率谱分布，在基因组背景噪声中识别出致病变异频率（信号峰值），信噪比（SNR）阈值设定为>20 dB。(C) 计算机辅助筛选门控：多层级优先排序流程，整合ACMG五级致病性指南、HGMD和Infevers数据库交叉验证，用于优先筛选出79个新发现变异和13个已报道变异。(D) 功能性生物物理建模验证：生物学验证层。确定性常微分方程（ODE）框架与随机Gillespie模拟曲线以图形形式整合，描绘野生型与模拟突变型细胞动力学在720分钟时间过程中的恢复情况及持续性信号传导。缩写：ACMG = 美国医学遗传学与基因组学学会；DFT = 离散傅里叶变换；GATK = 基因组分析工具包；HGMD = 人类基因突变数据库；NGS = 高通量测序；ODE = 常微分方程；SNR = 信噪比；VCF = 变异调用格式；WES = 全外显子组测序。 请点击此处查看该图的放大版本。

表3：儿童队列（n = 132）中鉴定出的I型干扰素病相关遗传变异的全面注释及位点数据库质控。ACMG标准（源自2015年ACMG/AMP指南）：ACMG/AMP证据代码按证据强度分组。极强证据包括PVS1，指在功能缺失已被证实为致病机制的基因中，预测为功能缺失的变异。强证据包括PS1–PS4，涵盖先前已确认的氨基酸改变、经证实的新生突变、支持性的功能学证据，以及在患病个体中变异频率升高。中等证据包括PM1–PM6，如位于关键结构域或突变热点区域、在人群数据库中缺失或频率极低、隐性遗传病中的反式存在、导致蛋白质长度改变、在已知存在致病性变异的残基上出现的新型错义变异，以及推测为新生突变的情况。支持性证据包括PP1–PP5，如共分离现象、基因特异性的错义突变约束、in silico预测证据、表型特异性，以及在缺乏独立证据时来自可靠来源的既往致病性报道。请点击此处下载该表格

表4：在高噪声基因组区域中变异检测流程的并行性能比较。 在低覆盖度（<30x）区域中进行了基准评估，以比较基于物理原理的DFT低通滤波器与标准算法配置在消除测序噪声和保护真阳性信号方面的性能。缩写：DFT = 离散傅里叶变换。请点击此处下载该表格

表5：下游JAK-STAT信号通路的定量动力学参数与稳态变化。 在720分钟的时间过程中，常微分方程（ODE）与随机Gillespie模拟边界的汇总，突出显示了携带致病性STING1和TYK2变异模型中细胞稳态衰减功能的失效。缩写：JAK-STAT = Janus激酶-信号转导和转录激活因子；ODE = 常微分方程；STING1 = 干扰素反应刺激因子cGAMP相互作用蛋白1；TYK2 = 酪氨酸激酶2。请点击此处下载该表格

补充表 S1：伴有干扰素病相关变异的儿童队列的个体患者数据集。 该表格提供了与论文中分析的最终132例患者队列相对应的个体患者数据。请点击此处下载该文件。

讨论

实验方案中的关键步骤包括DNA片段化、接头连接、PCR扩增以及单链DNA（ssDNA）环化。在这些阶段中，必须严格操作以最大限度地降低污染风险。基于磁珠纯化过程中，精确的乙醇洗涤步骤以及适当的磁力架孵育时间是必需的，因为任何偏差都可能导致产物得率降低或变异位点漏检。在混合文库制备过程中，需准确计算每位患者93.75 ng的量，并仔细调整体积。

在方案优化与故障排除过程中，若荧光定量检测结果偏低，特别是单链DNA浓度低于0.8–2 ng/µL阈值时，可能需要增加测序深度或缩短磁珠干燥时间，以提高变异检测的灵敏度。对于疑似嵌合变异的情况，整合长读长测序技术可提升检测准确性。此外，酶消化后应迅速将样品转移至冰上，这对于维持产物稳定性至关重要^12,13。在DNB制备过程中，缓慢轻柔地移液以及谨慎加入终止缓冲液，有助于保持纳米球的完整性。这一点对于建立早发性干扰素病（如SAVI）的基因型-表型关联尤为关键^6,11。

本研究基于全外显子组测序（WES）的遗传学分析，为评估具有自身炎症特征和血管炎的儿科患者中与干扰素病相关的变异提供了一个框架。通过鉴定 DNASE1、ADAR、STING1、RNASEH2A/B/C、TREX1、SAMHD1 和 COPA 等关键基因中的变异，该研究揭示了干扰素驱动型血管炎表型背后的遗传异质性。本队列中核酸代谢与感知相关基因（尤其是 DNASE1 和 ADAR）变异的发生频率，与I型干扰素信号通路失调在儿童期血管炎及自身炎症性疾病发病机制中的核心作用相一致。这些发现与既往将这些基因与干扰素病及血管炎表现相关联的研究报道一致^4,5,7。

通过阐明单基因自身炎症综合征（如 SAVI 中观察到的皮肤和间质性肺部受累）所表现出的类似血管炎的临床特征，该方法可能有助于早期诊断，并为靶向抗干扰素治疗提供指导^4,5,7。单基因干扰素病在临床上可模拟抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎及其他儿童期血管炎，凸显了对不典型或治疗抵抗性病例进行基因检测的重要性^9,10,11。早期基因诊断还可能推动及时启动靶向治疗，例如 JAK 抑制剂，已在携带 STING1 及其他干扰素相关突变的患者中显示出临床获益^7,13,14。

本研究还进一步证实，在表现为复杂性自身炎症性血管炎的儿童患者中，有相当大比例携带干扰素病相关基因的罕见或新发变异。在该大型队列中鉴定出79个新发变异，扩展了目前已知的遗传谱型，可能有助于改善儿童血管炎的基因型-表型相关性研究。

在此探索性工作流程中，一个操作上的考虑是评估阈值限制，因为探索性信噪比（SNR）参数的偏差可能改变滤波输出结果。例如，基于离散傅里叶变换（DFT）的核苷酸分布滤波有助于降低测序读长中的噪声，但需要进行校准以避免过度平滑突变信号；故障排除方法包括迭代调整二进制映射参数（嘌呤为0，嘧啶为1），以优化特征提取¹⁵。在生物物理建模中，定义常微分方程（ODE）的初始条件至关重要，因为扩增速率的微小扰动可能改变阈值行为，从而可能低估持续的干扰素信号传导。增强的JAK-STAT模型细节包括对TYK2在IFN-α信号通路中作用的建模，其中功能获得性变异会增强STAT2的激活，导致干扰素病表型²⁰。

该方法的改进可能包括为嘈杂的细胞环境引入随机因素，例如在常微分方程（ODEs）中添加朗之万噪声项：

dX = f(X)dt + g(X)dW

其中 dW 表示维纳过程噪声，用于增强模拟 JAK-STAT 变异性时的真实性²¹。利用 Gillespie 算法对干扰素通路进行随机模拟，可捕捉由于负反馈回路导致的 IFN-β 表达异质性，细胞间转录因子水平的差异会引起 ISG 激活的双峰分布^22,23。通路模型的故障排查需通过实验获得的 IFN-β 数据进行验证；若信号放大偏离预期，可重新校准磷酸酶激活速率等阴性对照参数，或在转录过程中引入分布延迟：

采用伽马核函数处理延迟过程。

与全基因组测序（WGS）相比，这种以全外显子组测序（WES）为重点的方法可能更具成本效益，但对外显子区域以外的区域覆盖不够全面^24,25。本初步框架的范围仅限于提供一个支持性的生化模拟模型，用于评估数学上的变异如何与干扰素信号传导行为的估计结果相关联，例如在累积效应超过导致血管损伤的关键阈值的阈值模型中所见。该方法的局限性包括可能遗漏低水平的嵌合变异，以及需要对新发现进行功能验证⁶。

该技术在免疫学和血管医学领域具有潜在应用价值，包括通过模拟变异对通路的影响来指导抗干扰素治疗，以及为罕见病诊断丰富数据库¹⁹。进一步引入随机性扩展模型，可能实现对干扰素病中异质性反应的预测，从而助力个体化医疗。

本研究强调了在儿童血管炎中结合组织病理学和影像学等传统诊断工具进行遗传学评估的重要性。总体而言，该研究突出了遗传学评估在儿童血管炎中的关键作用，并强调了在接受遗传分析以排查疑似自身炎症性疾病的患者中，与干扰素病相关的变异出现频率较高。通过评估这些变异对干扰素信号通路的影响，并强调儿童血管炎早期诊断的重要性，本研究有助于丰富与血管炎及自身炎症性疾病相关的罕见病数据库，同时为未来探索变异致病性及人群特异性多态性的研究提供了重要线索。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可调式移液器（P2、P10、P20、P200、P1000）	任何供应商		准确的液体操作
台式离心机	任何供应商		用于PCR管的短暂离心
Equinox文库扩增混合液	MGI Tech/NEB	7K0014-096（或等效产品）	PCR扩增预混液
乙醇（分子生物学级）	任何供应商		用于配制80%乙醇洗涤液
体外转录引物1 &和 IVT 引物 2	华大智造	包含在试剂盒内或单独提供	文库扩增引物
低吸附 PCR 管（0.2 mL）	任何供应商		无菌 PCR 管
磁力架	任何供应商		用于磁珠分离
MGI DNBSEQ-G400	MGI Tech Co., Ltd.	900-000641-00	采用 DNBSEQ 技术（DNA 纳米球测序）的台式下一代测序仪；支持多种读长（例如 SE50 至 PE300）；单次运行通量高达 1440 Gb；适用于全外显子组测序（WES）、全基因组测序（WGS）及靶向测序应用。
MGIEasy 环化试剂盒	华大智造科技有限公司	1000020570（双条形码，16个反应）或1000005260（V2.0）	用于生成单链环状DNA（ssCirDNA）的环化试剂盒；双标签版本可减少索引跳跃；是MGI测序流程中DNB构建前文库制备的关键步骤。
MGIEasy DNA 纯化磁珠	MGI Tech Co., Ltd.	1000005279	用于DNA纯化的磁珠
MGIEasy DNB建库试剂盒/DNB制备试剂盒	MGI Tech Co., Ltd.	1000020570（与双条形码环化整合）或相关DNB制备（例如，940-000036-00 Onestep DNB）	DNA纳米球（DNB）制备模块；包含用于芯片加载的环化和纳米球生成步骤；DNBSEQ测序仪文库处理的最后一步（常与环化试剂盒联合使用）。
MGIEasy 外显子捕获辅助试剂盒	MGI Tech Co., Ltd.	1000009657（或等效产品）	包含阻断剂溶液、MGI通用阻断剂、增强剂、结合缓冲液、洗涤缓冲液1 &和2，以及链霉亲和素磁珠
MGIEasy 外显子捕获 V4 探针（或 Twist CES 探针，适用于 MGI/DNBSEQ）	MGI Tech Co., Ltd.（适用于 MGIEasy）或 Twist Bioscience（适用于 Twist）	1000007745（V4 探针组，16 次反应）或 1000007740（探针）；Twist：定制/面板特异性（按订单提供，无标准编号）	基于杂交的全外显子组捕获探针；靶向约 59 Mb 编码区域（CCDS、RefSeq、GENCODE、miRBase）；专为在 DNBSEQ 平台上进行 WES 工作流程中的高效富集而设计；需与 MGIEasy 杂交辅助试剂盒（65°C 预孵育，65℃过夜 16 小时°C），加入阻断剂，链霉亲和素磁珠捕获（结合缓冲液，洗涤缓冲液1/2，48°洗脱和捕获后PCR扩增（与Equinox混合液兼容）。
MGIEasy 快速杂交与洗涤试剂盒	MGI Tech Co., Ltd.	940-001974-00（16次反应）	杂交与洗涤试剂
MGIEasy FS DNA文库制备试剂盒	MGI Tech Co., Ltd.	1000006987（16次反应套装）或1000005256（96次反应核心试剂盒）	基于快速片段化的DNA文库构建试剂盒；采用5端酶切片段化–400 ng gDNA 起始量；适用于 DNBSEQ 平台，可高效构建全基因组测序/全外显子组测序文库。
无核酸酶水	任何供应商		分子生物学级
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	赛默飞世尔科技	Q32851	用于文库定量
Qubit ssDNA 检测试剂盒（可选）	赛默飞世尔科技	Q10212	环化后单链DNA的定量
链霉亲和素磁珠	MGI Tech	包含在附件工具包中	用于杂交捕获
TE缓冲液（pH 8.0）	任何供应商		变性步骤
热循环仪	各种（Bio-Rad，Thermo 等）		用于片段化、连接、PCR 和 DNB 程序
涡旋混合器	任何供应商		用于样品混匀
宽口移液器吸头	任意供应商		DNB 制备所需