应激诱导的类抑郁状态的多模态行为表型分析 黑腹果蝇

摘要

本方案提供了一个用于评估黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中由应激引起的行为变化的框架。通过结合互补的检测方法，可对单只果蝇的活动性、探索行为和决策能力进行定量分析。该方法具有灵活性，可适用于广泛的研究领域，包括应激生物学、代谢以及神经行为功能的研究。

摘要

代谢性、神经退行性以及应激相关疾病常伴随运动能力改变、决策功能受损以及行为灵活性下降。然而，目前尚缺乏便捷可用的多模态行为分析框架，用于量化这些表型 黑腹果蝇 仍然有限。本文介绍了一种整合了强迫游泳暴露、Y迷宫转向行为和利手性、趋光性以及FlyVac系统中的活动性评估、开放场探索和利用长期运动监测的方案 果蝇 活动监测被呈现。这些互补性检测可捕捉行为的多个维度，包括运动输出、动机、决策结构和行为变异性，作为神经与代谢状态的功能性读出指标。该流程具有可扩展性、可重复性，并可适应药理学、遗传学和环境干预，为检测与应激、代谢及神经退行性变相关的行为表型提供了一个多功能框架 果蝇.

引言

行为改变，例如运动能力、决策能力和探索活动的变化，被广泛用作反映生物体神经和生理状态的个体水平指标。在不同物种中，神经功能障碍常表现为运动模式的改变、探索动机的降低、感觉引导的决策行为受损以及行为可预测性的变化。由于这些个体水平的行为输出整合了神经、代谢和生理状态，因此可作为可扩展的检测手段，用于识别与疾病相关的表型。然而，尽管黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）在分子遗传学和神经科学领域被广泛应用，目前仍缺乏能够同时捕捉运动表现、决策结构和行为变异性的标准化多模态行为分析框架。

模式生物对于研究应激相关和神经精神表型的潜在机制至关重要，因为在人类中往往无法进行受控的实验操作。应激相关的行为综合征存在于许多生物类群中，包括昆虫，并涉及保守的神经调质系统（如5-羟色胺和多巴胺）以及代谢信号通路。因此，果蝇因其较短的世代周期、易于进行遗传操作以及与疾病相关的通路具有高度保守性，已成为连接分子功能障碍与个体水平行为结果的有力研究体系^1,2。

同时，果蝇（Drosophila）的许多行为学检测通常单独应用，难以区分一般的疾病效应、运动功能障碍、动机变化以及决策层面的行为改变。此外，仅依赖平均行为指标可能会掩盖具有生物学意义的表型，因为神经调节和发育干扰常常改变行为的变异性，而非平均行为输出。因此，有必要采用一种多模态行为学方法，结合运动、探索、感觉和决策行为检测，以生成可靠的个体水平表型特征³。

本文介绍了一种多模态行为分析流程，该流程整合了强迫游泳实验^4,5、Y迷宫转向行为与利手性^6,7,8,9、利用FlyVac系统进行的趋光性及活动性评估^10,11、开放场地探索实验¹²，以及利用果蝇活动监测仪（Drosophila Activity Monitor, DAM）进行的长期运动监测^5,13（图1）。该框架中的每一项检测均捕捉到与应激相关表型相关的独特行为维度。强迫游泳实验用于测量被动应对行为，其中更早地进入静止状态反映了维持逃逸反应的动机降低。开放场地实验和DAM检测可量化一般的运动活性和昼夜节律结构，提供运动输出和觉醒水平的基础测量指标。Y迷宫实验通过左右选择序列来捕捉决策结构，从而能够估计转向偏好（侧化）和行为变异性，后者作为行为可预测性的度量。最后，FlyVac实验通过重复的趋光性选择来评估感觉引导的决策以及趋近-回避行为。这些检测方法共同提供了互补的行为读数，能够区分活动性、动机以及决策层面行为的变化。

本方案捕捉了运动输出、动机、决策结构和行为变异性等方面的互补特征，为检测与应激、代谢及神经退行性变相关的行为表型提供了一个可扩展的框架，适用于D. melanogaster¹⁴。本研究的主要目标是建立一种多模态行为表型分析框架，通过整合互补的实验方法，全面捕捉应激诱导的行为变化的多个维度。本研究中采用的应激范式作为一种标准化的干扰手段，用于展示该框架的敏感性与适用性。

方案

强迫游泳实验遵循3R原则（替代、减少和优化）。通过使用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）作为无脊椎动物模型，实现了替代，从而避免了因伦理原因日益受限的脊椎动物强迫游泳范式。该实验具有高通量特性，能够从相对较小的实验群体中获得可靠的行為推断，从而支持减少动物使用数量的原则。优化方面，将游泳暴露时间限制在2分钟，该时长可防止果蝇耗竭或溺亡，并在测试结束后立即完全恢复正常的运动行为。综上所述，这些考虑确保了实验在提供有意义的行为数据的同时，最大限度地减少潜在的应激反应，提高伦理可接受性，包括在教育环境中的应用。

1. 诱导类抑郁状态 黑腹果蝇 （振动应激方案）

1. 在羽化后24小时内，于轻度CO₂麻醉下收集雄性D. melanogaster。所有细节详见材料表。
2. 将果蝇以每组10只的方式放入聚丙烯或丙烯酸小瓶（95 mm长 × 25 mm内径）中，并用棉塞密封。
3. 使用振动平台对果蝇施加机械振动（300 Hz）。
4. 在含有标准食物的小瓶中，施加重复循环，每次包括45分钟振动，随后15分钟恢复 。
5. 每天持续进行振动循环，总计6小时。
6. 连续3天重复该应激方案。
7. 对照组果蝇在相同饲养条件下饲养，但不接受振动刺激。
   注：在本方案中，仅使用雄性果蝇，以减少与性别相关的生理和行为差异（包括生殖状态和激素影响）所带来的变异性。这种标准化有助于在受控环境中检测应激诱导的行为效应。然而，该方案同样适用于雌性果蝇，而性别特异性反应是未来研究的重要方向。鉴于包括Drosophila在内的不同分类群中，对应激相关和抑郁样表型的敏感性可能随性别和年龄而变化，将此框架扩展至不同群体可能提供额外的生物学见解。本范式改编自已建立的不可控振动应激模型，该模型可诱导果蝇的动机和活动性改变。

2. 强迫游泳实验 黑腹果蝇

警告：十二烷基硫酸钠（SDS）具有刺激性。配制和操作 SDS 溶液时，请佩戴适当的个人防护装备（如手套和眼部防护装置）。避免与皮肤和眼睛接触。含 SDS 的废弃物应按照机构化学品安全指南进行处理。

1. 在羽化后24小时内收集成年果蝇，并在恒定光照和受控环境条件下饲养。
2. 准备多孔培养板，每孔加入约2 mL室温的0.08% SDS溶液。
3. 在开始记录前立即将单只果蝇转移至各孔中。无需麻醉。
4. 使用顶部摄像机记录2分钟的行为，以量化首次静止的潜伏期。
5. 量化首次静止的潜伏期。
6. 记录结束后取出果蝇，置于吸水纸上以确认其正常运动能力是否恢复。
   注：静止定义为停止主动逃避运动，同时保持在表面的位置不变。若需记录其他参数（如总静止持续时间及静止发作次数），则需要更长的记录时间（例如3分钟）。该实验反映的是被动应对行为；静止潜伏期缩短被解释为维持逃避反应的动机降低。不同果蝇之间的静止潜伏期和总静止时间可能存在变异。该实验可能引起短暂的应激或疲劳。在纵向实验设计中，应在其他实验之前进行本实验，并在后续测试前给予足够的恢复时间（例如≥24小时）。

3. 利用果蝇活动监测仪（DAM）进行长期运动活动监测

1. 使用 CO₂ 短暂麻醉果蝇（5 秒），以便分选。
2. 将单只果蝇放入含有食物和棉塞的玻璃 DAM 管中¹⁷。
3. 将管子插入果蝇活动监测系统。
4. 在受控的温度和明暗条件下连续记录运动活动（48 小时）。
5. 使用数据采集软件存储光束中断计数。
6. 将活动数据按预设时间间隔（例如 1–10 分钟）进行分段。
7. 排除在适应后死亡或无活动的果蝇。
   注意：持续 48 小时的运动监测足以捕捉昼夜活动模式。DAM：个体间在总移动距离、速度和活动片段结构上存在变异性。

4. 开放场地运动功能检测

1. 使用 CO₂ 对果蝇进行短暂（5 秒）麻醉。
2. 将单只果蝇转移至矩形 25 x 75 mm 的行为检测 arena 中（每只 arena 放置一只果蝇）。
3. 在恒定低强度漫射白光条件下，让果蝇在记录前适应 arena 环境 20 分钟。
4. 在恒定光照条件下，使用自动化视频追踪系统记录果蝇行为。
5. 使用追踪软件分析运动轨迹，提取以下参数：
   总移动距离
   平均运动速度
   加速度与转向指标
   注：本实验可为解释应激相关的行为变化提供基线数据。适应期可最大程度减少操作引起的应激反应，并使果蝇习惯 arena 环境，从而确保所记录的运动活动反映的是基线行为。采用恒定光照以降低与昼夜节律波动相关的变异性，并确保各次实验间行为条件的一致性。轨迹可通过自动化追踪软件（如 EthoVision XT（Noldus Information Technology））或开源替代工具（包括 Ctrax、idTracker 和 TrackMate（ImageJ/Fiji））提取，具体选择可根据可用资源和用户偏好决定。旷场实验：个体间在总移动距离、速度及运动片段结构上存在变异性。为减少顺序效应，应在各次实验中标准化适应时间和光照条件。若对同一批果蝇进行多项检测，应保持其在 arena 中的暴露时长一致。

5. Y迷宫转向行为与行为变异性检测

1. 使用 CO₂ 对果蝇进行短暂麻醉（5 秒）。
2. 将单只果蝇放入 Y 型迷宫腔室^8,9。迷宫使用激光雕刻机切割成厚度为 1.6 mm 的黑色亚克力材料。我们将果蝇置于由 95 个独立迷宫组成的阵列中，每个迷宫包含三个对称的臂（长 12 mm，宽 3.3 mm）。
3. 让果蝇在较长时间内自由探索（20 分钟）。
4. 记录探索性运动期间的转向决策（左转或右转）（1 小时）。
5. 将个体的转向偏好计算为右转所占比例。计算相关指标，如速度、加速度、静止中的运动、基于时间的活动变化^12,15。
6. 使用转向偏好的中位绝对偏差（MAD）来量化个体间的行为变异性。
   注意：该检测方法可独立于总体活动水平，测量运动的手性偏好和行为可预测性。转向序列反映决策结构；转向偏好反映偏侧化，而个体间的变异性反映行为可预测性。bias = 每只果蝇右转所占比例；variability = 果蝇间偏好的离散程度（MADn）。对于重复测试，建议在个体或群体间交叉平衡检测顺序，以控制序列效应。

6. 趋光性选择：利用 FlyVac 装置监测活动

1. 将单只果蝇装入 FlyVac 装置室中^6,11，避免使用 CO₂ 麻醉。
2. 开始实验前，让果蝇适应环境（10 分钟）。
3. 对每只果蝇重复呈现二元明暗选择。
4. 使用自动检测系统记录 40 次试验中的选择行为。
5. 计算每只果蝇选择光亮区域的概率，以及光亮选择之间的平均时间间隔，作为活动水平的衡量指标。
6. 使用 MAD 量化个体间的行为变异性。
   注意：FlyVac 系统可同时评估平均决策偏向性和个体间的行为差异性。本方案中描述的行为检测方法具有模块化特点，可根据实验设计调整检测顺序。然而，为尽量减少潜在的遗留效应，建议在其他检测之前进行强迫游泳实验。为降低顺序效应，应标准化各次实验中的适应时间和光照条件。

7. 数据分析

注意：行为学分析以单个果蝇作为推断单位，除非另有说明。

1. 强迫游泳实验： 使用行为评分软件或人工分析视频录像。
   注意：不动性定义为果蝇在漂浮状态下无主动逃脱运动。针对每只果蝇提取以下参数： 首次静止潜伏期（s）. 由于行为测量数据不符合正态分布，组间比较采用非参数统计检验。
2. 长期运动活动（DAM）：记录 通过果蝇活动监测仪记录光束中断次数。导出数据并以10分钟为间隔进行分段。
   注意：针对每只果蝇，计算其总活动次数和昼夜节律活动模式。这些模式可使用 R、Python 或 Excel（视可用情况而定）进行计算。在分析前，已排除因死亡或技术伪影导致无活动的果蝇。该检测持续 48 小时。
3. 开放场运动行为检测：使用自动追踪软件处理视频追踪数据。将视频文件导入 EthoVision XT，采用基于对比度阈值的自动检测方法进行追踪。
   注意：轨迹使用默认滤波算法进行了平滑处理。每只果蝇的运动参数（距离、速度、加速度）以 CSV 文件格式导出，用于后续分析。每只果蝇的运动参数包括：总移动距离（mm）、加速度（mm/s²）。在进行组间比较之前，先在个体水平上计算汇总统计量。每组的测试持续时间为1小时。
4. Y迷宫转向行为：从记录的轨迹中提取转向决策，分类为左转或右转，并以二进制序列（左/右）形式导出每个个体的结果。
   注意：每只果蝇的转向偏好通过计算其所有记录决策中向右转的比例来确定。个体间行为变异性的量化采用标准化的中位绝对偏差（MAD）_n = 1.4826 × 转向偏倚的MAD）。每组测试持续时间为1小时。
5. FlyVac 趋光性选择：自动记录明暗选择的二元结果。对每只果蝇，计算其趋光选择概率（LCP），即选择光照臂的试验次数所占的比例。将趋光性偏好表示为二元试验结果的平均值（选择光照 = +1，选择黑暗 = −1）。
   注意：使用 MAD 对果蝇间的变异性进行量化_n 单个趋光性指数。
6. 统计分析：使用基于置换的检验方法，通过10,000次标签随机化来评估行为测量指标的组间差异。
   注意：为了比较变异性，对 MAD 的绝对差异进行了置换检验_n 组间差异。MAD 的置信区间_n 采用自举重采样法获得估计值。使用双尾非配对 t 检验比较果蝇移动距离（mm）和最大加速度（mm/s）²）。数据可视化采用小提琴图（主要用于显示密度、集中程度和偏度）、箱线图和柱状图。统计学显著性水平设定为 α = 0.05。

结果

应用振动应激方案后，在多个检测中观察到可测量的行为改变（图1），这些检测旨在捕捉黑腹果蝇（D. melanogaster）的活动性、应对行为和决策能力。

抑郁样诱导

与未受应激的对照组相比，暴露于重复机械振动（图1A）的果蝇表现出探索活动减少以及行为反应改变。这些变化在后续的行为检测中保持稳定，表明振动范式有效诱导了一种持续的类抑郁状态。

讨论

本方案展示了一种用于诱导并量化黑腹果蝇（D. melanogaster）抑郁样行为状态的多模态方法。通过基于振动的应激范式结合互补的行为学检测，本研究显示，可在应对行为、运动活性、探索动态、决策能力及行为变异性等多个指标中检测到抑郁样状态的诱导¹⁶。本研究所采用的应激方案旨在作为一种实用工具，用以诱发可测量的行为变化，并展示多模态框架的应用价值，而非作为本方案的主要关注点。该整合框架凸显了将传统基于活动的读数与行为个体性测量相结合的重要性。本研究获得的强迫游泳实验结果与先前研究一致，验证了该检测方法作为评估果蝇被动应对行为的有效性。与早期研究结果相似，经历应激的果蝇表现出游泳行为改变，其特征为静止时间增加，支持了振动应激作为诱导范式的可靠性⁵。结合此前在果蝇（Drosophila）中观察到的应激诱导行为变化的研究，这些发现进一步确立了强迫游泳实验作为抑郁相关行为表型分析中可靠组成部分的地位¹⁸。

使用果蝇...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉设备：例如，Benchtop Flowbuddy，带 Ultimate Flypad 的完整系统	Genesis Scientific，美国加利福尼亚州埃尔卡洪	59-122BCU
BioSan MSV-3500 多速涡旋振荡器	Biosan SIA，拉脱维亚里加	BS-010210-TAH	所有平台
窄口小瓶用棉质封口	Flystuff，Genesee Scientific，美国加利福尼亚州埃尔卡洪，邮编 92020	货号：51-101
果蝇活动监测仪（DAM2）	TriKinetics公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	DAM2；RRID：不可用	32 支试管
黑腹果蝇（Oregon-R-modENCODE）	黑腹果蝇（Oregon-R-modENCODE）	BDSC:25211；RRID:BDSC_25211
GraphPad Prism	GraphPad 软件，美国马萨诸塞州波士顿	目录名称：GraphPad Prism，RRID:SCR_002798	版本 11.0.1
罗技 C920 高清专业网络摄像头，高清 1080p 镜头 目录名称：HD Pro Webcam C920	Logitech Europe S.A.，瑞士洛桑	RRID：暂无	用于强迫游泳实验的顶部记录摄像头
窄口果蝇培养管，聚丙烯材质	Flystuff，Genesee Scientific，美国加利福尼亚州埃尔卡洪，邮编 92020	货号：32-120BF
Noldus EthoVision XT	Noldus 信息技术公司，荷兰瓦赫宁根	RRID: SCR_000441	15.0 版
十二烷基硫酸钠（SDS， ≥99%)	德国达姆施塔特默克股份有限公司（Sigma-Aldrich）	目录名称：十二烷基硫酸钠（ACS 级试剂， ≥99% 纯度）；RRID：不可用
蔡司 Stemi 508 体视显微镜	卡尔蔡司股份公司，奥伯科亨，巴登-符腾堡州ü德国 rttemberg	15634448