核磁共振代谢组学分析人胚胎培养废液：方法验证与技术考量

摘要

本文介绍了一种利用核磁共振（NMR）波谱法收集、制备和分析人类胚胎废弃培养液的实验方案，可在常规临床培养条件下，对微升级样品实现低分子量代谢物的可重复检测。

摘要

使用过的人类胚胎培养液中含有小分子代谢物，这些代谢物可提供关于胚胎着床前生理状态的非侵入性信息。然而，基于核磁共振（NMR）的代谢组学分析在技术上具有挑战性，因为常规胚胎培养条件涉及微升级体积、添加蛋白质以及覆盖石蜡油，这些因素会产生背景信号并降低谱图质量。本文介绍了一种优化的针对使用过胚胎培养液的NMR代谢组学工作流程，该流程采用可控液滴收集法以最大限度减少油污染，使用氟化乙烯丙烯（FEP）管内衬在容纳微升级样品的同时将样品与外部参考物质（TMSP）进行化学隔离，并采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列进行信号采集，以抑制大分子背景信号。该方案能够在常规实验室条件下，对单独培养的人类胚胎来源的使用培养液实现小分子代谢物的一致性检测与定量，支持可重复的分析。由于存在多种技术挑战，该方法在用于科研或临床目的之前必须经过充分验证。

引言

在胚胎植入前发育期间 体外胚胎持续消耗并释放小分子代谢物到周围培养基中。因此，废弃胚胎培养基（SECM）的成分反映了胚胎的代谢活性，可作为评估胚胎生理状态和发育潜能的非侵入性功能指标。^1,2对该代谢特征的分析可能补充常规评估方法，并改善辅助生殖技术中的胚胎筛选策略^3,4特别是氨基酸和碳水化合物代谢的改变与胚胎发育潜能及活力密切相关^5,6,7.

核磁共振（NMR）波谱法广泛用于多种生物样本的非靶向代谢物谱分析，包括胚胎培养废液^8,9,10。然而，这些样本的分析在技术上仍具有挑战性¹¹。在常规临床实践中，胚胎在特定的微环境中培养，该环境旨在模拟生理条件。培养基中通常添加白蛋白等蛋白质，以稳定渗透压、结合有毒化合物，并为脂质和生长因子提供载体分子，从而支持胚胎正常发育¹²。为防止蒸发并维持溶质浓度恒定，培养液滴表面需覆盖无菌石蜡油¹³。

来自覆盖油和蛋白质组分的脂质会产生宽泛的背景信号，掩盖来自葡萄糖、丙酮酸和氨基酸等低分子量代谢物的尖锐共振信号。此外，在标准的5 mm核磁共振（NMR）试管中分析微升级样品体积时，需要进行显著稀释才能达到射频线圈的检测活性体积。这种分析物浓度的降低严重削弱了信噪比（S/N），导致低丰度代谢物信号被掩盖，并阻碍了可重复的定量分析。尽管已有大量研究将基于核磁共振的代谢组学应用于人类胚胎培养废液，但由于缺乏标准化且可重复的样本采集与制备流程，限制了研究结果的可重复性以及不同研究之间的可比性^8,9,11。

本文介绍了一种基于核磁共振（NMR）的代谢组学工作流程（图1），旨在克服与人类胚胎培养基质取样和分析相关的技术难题。该方法结合了可控液滴采集以减少油相残留、使用氟化乙烯丙烯（FEP）内衬进行微升级体积检测以避免稀释假象，以及采用卡尔-珀塞尔-梅博姆-吉尔（Carr-Purcell-Meiboom-Gill, CPMG）脉冲序列衰减大分子信号。

方案

本研究于2023年1月至4月在斯洛文尼亚马里博尔大学医学中心生殖医学与妇科内分泌科进行。核磁共振（NMR）分析在斯洛文尼亚卢布尔雅那国家化学研究所完成。所有参与者均签署了书面知情同意书。研究获得了机构伦理委员会（编号：UKC-MB-KME-1/21）和国家医学伦理委员会（编号：0120-37/2021/15）的批准。

1. 研究设计

注意：该研究采用基于核磁共振的代谢组学方法分析人类胚胎培养废液。

1. 在卵胞浆内单精子注射（ICSI）后经过延长的胚胎培养后收集样本。同时收集等量未使用的孵育对照样本。

2. 样品采集

1. 在胚胎孵育后收集用过的胚胎培养液（SECM）样本，如图2所示。
2. 将胚胎从培养液滴中移出后，小心吸取培养皿表面多余的覆盖油，注意不要扰动培养基（图2，步骤1）。
3. 使用无菌移液器，从原始液滴中吸取约35 µL培养基，留下约5 µL，以避免吸入残留的表面油。将此体积转移至一个无菌培养皿中，形成新的液滴（图2，步骤2）。
4. 在体视显微镜下目视检查新形成的液滴。小心从此液滴中再吸取约30 µL，同样留下约5 µL，以最大限度减少油的带入。将此体积转移至第二个无菌位置，形成更洁净的液滴（图2，步骤3）。
5. 在放大条件下目视检查第二个液滴。识别油滴最不明显的区域。将移液器吸头插入该区域，并吸取约25 µL培养基，再次留下约5 µL，以最大限度减少油的带入（图2，步骤4）。
6. 立即将收集的25 µL样品转移至无菌、无RNase的微量离心管中。加样时避免接触管内壁，以防污染和样品损失。立即将所有收集的样品在液氮中速冻，并于-80 °C保存，直至进行核磁共振（NMR）分析（图2，步骤5）。
7. 收集配对的未使用孵育对照液滴（即在相同培养皿中、使用相同的覆盖油、孵育时间、培养箱环境和上述操作流程，在无胚胎条件下孵育的培养基），以尽量减少环境变异和潜在的系统性偏差。
   注意：严格遵循逐级液滴转移和目视检查步骤可显著降低油污染。在此阶段，实验可暂停，并在进行NMR检测前继续后续样品处理。

3. 用于核磁共振分析的样品制备

1. 在室温下解冻样品，约 10 分钟。
2. 制备核磁共振（NMR）混合液：
   1. 将 25 µL 的 SECM 转移至 1.5 mL 微离心管中，加入 200 µL 的 D₂O。涡旋振荡 10 秒，然后在室温下以 1000 × g 离心 10 秒。
3. 装载内插管：将 225 µL 混合液转移至 FEP 衬管中。
4. 制备外部参比管：
   1. 用含有 1 mM 3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d4 钠盐（TMSP-d4）的 D₂O 溶液填充一支 5 mm NMR 管，体积为 150 µL。
5. 组装样品：将 FEP 内插管插入 NMR 管中，并用 Parafilm 密封膜密封。

4. 核磁共振采集与谱图处理

1. 使用 Bruker 的 cpmgpr1d 脉冲序列进行 ¹H-CPMG 数据采集，参数设置如下：64 次扫描；65,536 个数据点；弛豫延迟：8 s；谱宽：11.9 kHz；回波时间：400 µs × 80 个循环（有效 T₂ 滤波时间为 32 ms）；总采集时间：约 15 分钟。
   注：选择 64 ms 的有效 CPMG T₂ 滤波时间是基于已建立的含蛋白质生物样本的代谢组学实验方案，该参数可有效抑制大分子信号，同时保留小分子代谢物的共振信号¹⁴。
2. 进行谱图处理：
   1. 获得傅里叶变换谱图。
   2. 应用 0.3 Hz 的指数线宽展宽。
   3. 进行相位校正和基线校正。
   4. 以 TMSP-d4 在 0 ppm 处作为参考进行谱图校准。
   5. 化学位移（δ）以外部 TMSP-d₄ 在 0 ppm 处的信号为参考。
      注：由于 FEP 衬管内的样品混合物（225 µL）与外层同轴间隙中的外部 TMSP-d₄ 参比溶液（150 µL）在 NMR 检测线圈有效检测区域内的物理几何结构和体积不同，其绝对信号强度并不呈 1:1 比例关系。使用外部参比进行直接绝对定量需要针对系统特性的几何校准曲线。因此，鉴于本实验方案中样品体积严格恒定且移液精度高度可重复，直接使用原始桶积分值来追踪样品间的相对代谢变化，无需进行外部参比校正或总信号强度归一化。
3. 进行谱图分桶（binning）：
   1. 在分桶前排除水共振区域（例如 4.65–5.00 ppm）和 TMSP-d4 参考信号区域（例如 -0.05–+0.05 ppm）。
   2. 将谱图划分为变宽度的桶（bucket），以避免峰被分割。
   3. 在统计分析中使用原始桶积分值，而非归一化至外部 TMSP-d4 信号，因为该参比物在外部管腔体积中物理隔离。此方法可避免因插入管与外管活性体积不同而引起的定量误差。
   4. 将桶积分值导出为数值数据矩阵用于统计分析。
      注：每个 "桶"（或称 bin）代表在特定 ppm 范围内所有 NMR 信号积分值的总和。尽管这些积分值反映了该范围内化学基团的相对浓度，但单个桶可能包含多个重叠代谢物的信号，或仅包含某一特定代谢物总信号的一部分。

5. 统计分析

1. 使用 nmrglue¹⁵ 将经过处理的 ¹H-CPMG 谱图导入 Python（v3.12）中。
2. 去除水峰和 TMSP-d4 的谱图区域。
3. 导出用于分析的分桶积分数据。
4. 使用 SciPy（v1.14.1）进行统计检验：
   1. 采用 Shapiro–Wilk 检验评估每个谱图分桶的正态性。
   2. 对正态分布的数据采用单因素方差分析（ANOVA），对非参数数据采用 Kruskal-Wallis 检验，以识别未使用培养对照组与使用后培养基之间存在统计学显著差异的分桶。
   3. 对于显示显著差异的分桶，结合一维和二维核磁共振实验进行结构归属：¹H-¹³C HSQC、¹H-¹³C HMBC 和 ¹H-¹H COSY。
   4. 将观测到的二维相关信号与标准数据库（如 HMDB）进行比对，以确认导致差异性分桶的代谢物身份。

结果

未靶向核磁共振代谢组学分析废弃胚胎培养液的分析流程见图1。

采样过程中去除油污染
图2展示了用于减少覆盖油残留的连续液滴转移操作流程。若未谨慎移液，所采集的样品在谱图的脂肪族区域（δ 0.5–2.3 ppm）内表现出广泛的碳氢化合物共振峰，导致基线严重失真，并掩盖了低分子量代谢物信号（图3A，绿色轨迹）。相比之下，采用优化后的连续液滴转移方案采集的样品中，石蜡油污染几乎完全消除，基线稳定性得以恢复，并在目标谱图区域内清晰呈现出分辨良好的代谢物共振峰（图3B，黑色轨迹）。值得注意的是，表征石蜡油污染的宽碳氢包络峰被有效去除，表明连续液滴转移将残留油污染降低至谱学检测的实际极限以下，从而实现了可靠的下游代谢物定量分析。

大分子背景信号的抑制

讨论

本研究解决了利用非靶向核磁共振代谢组学方法鉴定和定量胚胎培养废液中低分子量代谢物时面临的关键分析挑战。研究结果表明，优化后的工作流程能够获得高质量、信息丰富的谱图，适用于可靠地检测低分子量代谢物。

仔细的逐滴转移步骤被证明对于减少油污染至关重要，否则油污染会产生宽共振峰，掩盖目标小分子代谢物信号。在实施优化采样程序前后所采集谱图的比较表明，石蜡油信号几乎完全消除，从而有效去除了遮蔽代谢物共振峰的宽碳氢化合物背景。大分子干扰主要来源于白蛋白类蛋白质，进一步限制了谱图的可靠解析。采用文献验证的有效T₂滤波时长为64 ms的CPMG脉冲序列，可选择性抑制大分子共振信号，同时保留窄峰代谢物信号，因此优于超滤等物理去除方法；后者虽可降低背景信号，但也会减弱代谢物信号强度。

我们进一步证明，FEP管衬管非常适用于微升级别的核磁共振（NMR）测量。该装置可将样品限制在NMR线圈的活性检测体积内，从而最大限度地减少在标准5 mm试管中为达到所需填充高度而必须进行的稀释。尽管仍需加入少量D2O以确保稳定的锁场并消除衬管内的气-液界面，但最终代谢...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mm FEP 管衬	SP Wilmad-LabGlass	4682701	同轴 NMR 内插件
5 mm NMR 管	SP Wilmad-LabGlass	535-PP-7-SB	外管
6 孔培养板	Oosafe	OOPW-SW02	胚胎培养皿
低温液氮	Messer	联系制造商	样品速冻
重水（D2O）	Eurisotop	D214L	NMR 溶剂
微量移液器（10–100 µL）	Eppendorf	4924000053	可调体积移液器
微量离心管，1.5 mL，无 RNase	Eppendorf	N216966N	样品收集与储存
矿物油	Vitrolife	VTL-10029	培养液滴覆盖
NMR 波谱仪，600 MHz	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html	光谱采集
巴斯德移液管	Falcon	FAL-357575	液滴转移
单通道机械移液器	Sartorius	728060	样品操作
移液器吸头，无菌	Eppendorf	22491148	与微量移液器兼容
带滤芯无菌移液器吸头	Sartorius	790201F	气溶胶屏障
序贯 G 系列培养基	Vitrolife	VTL-10143	胚胎培养基
TMSP-d4（三甲基硅丙酸钠-d4）	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-48-1	化学位移参照物
Safe-Lock 管	Eppendorf	0030121589	储存管