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方法文章

利用共振拉曼光谱实时无创评估线粒体功能

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DOI：

10.3791/71290

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2026年8月7日

 ,  ,  ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Hospital for Children, 3Pendar Technologies

本文内容

摘要

我们提出了一种利用共振拉曼光谱法（RRS）无创、实时监测线粒体健康状况的方法。我们采用RRS定量分析线粒体的氧化还原状态，并建立了一种评估线粒体健康的指标——共振拉曼还原线粒体比率（3RMR），该指标对氧合状态变化的响应速度优于传统的血气分析物。

摘要

尽管线粒体在疾病发生和发展中起着核心作用，但关于线粒体健康动态的机制性研究仍然成本高昂且难以获取。为弥补这一空白，本研究采用共振拉曼光谱法（RRS）评估线粒体功能，使用一种便携式系统，可对大鼠肝脏中的线粒体细胞色素氧化还原状态进行实时、无创且定量的测量。在本实验方案中，我们展示了该技术的应用，包括系统设置、数据采集和数据处理。本研究提供了一项概念验证实验，突显了RRS在测量线粒体氧化还原状态实时变化方面的能力，进而反映线粒体功能。简言之，将RRS设备连接至激光泵和数据采集计算机，并置于距离大鼠肝脏1 cm的位置。  根据大鼠肝脏实验方案设定采集参数；通过氧气应激测试，在富氧和缺血条件下测量氧化还原状态，并在整个氧气应激测试过程中追踪线粒体氧化还原状态的变化。

引言

线粒体在细胞功能和稳态中发挥关键作用。线粒体是细胞代谢的主要驱动者，通过氧化磷酸化调控ATP的生成。它们还作为信号细胞器，通过调节凋亡通路以及活性氧（ROS）和Ca+2信号传导来决定细胞命运1。因此，线粒体功能障碍可导致多种神经退行性疾病、肌肉疾病和心血管疾病2,3。尽管线粒体在疾病进展中具有关键作用，但评估线粒体功能的方法往往具有侵入性、成本高昂且存在局限性。

线粒体功能的关键指标，例如耗氧率、氧化磷酸化以及电子传递链（ETC）中各复合物的活性，通常通过呼吸测定法进行测量。ETC由嵌入线粒体内膜（IMM）的四个复合物（I–IV）组成。这些复合物在其他辅酶的协助下，将电子从还原型底物（如NADH和FADH2）传递至最终的电子受体O₂。2，随后被还原为水。目前大多数呼吸测定实验（如 Seahorse 和 Orobros O2k）均需要对组织进行处理，从而限制了其在转化研究中的应用4,5. 测量线粒体膜电位（MMP）是评估线粒体功能障碍的另一种方法，该方法利用阳离子脂溶性荧光染料（如JC-1）结合显微成像技术，使耦合状态（健康）和非耦合状态（受损）的线粒体在不同波长下产生荧光6然而，这些检测方法的灵敏度可能较低5染料本身在高浓度下也可能具有高细胞毒性5最后，与呼吸测定法类似，该技术同样需要进行组织处理。近年来，基于光谱学的技术已被用作评估线粒体健康的非侵入性方法。例如，磷磁共振波谱法（P-MRS）通过测定含磷代谢物的浓度来评估细胞代谢，已被用于表征 undergoing 分化的工程化脂肪生成组织7然而，该技术也需要专门的设备和培训。

我们课题组近期展示了一种利用共振拉曼光谱法（Resonance Raman Spectroscopy, RRS）实时、无创且高度特异性地测量线粒体氧化还原状态以评估器官活力的技术。RRS 通过光子的非弹性散射来定量分析线粒体细胞色素的氧化还原状态。当以波长为 441 nm 的激光激发时，线粒体细胞色素、血红蛋白和肌红蛋白等分子中的血红素基团内的卟啉环会根据其氧化状态产生特征性的拉曼光谱8尽管RRS系统采用441 nm波长，但也可使用420 nm和405 nm波长的激光，每种波长优先增强不同的细胞色素复合物。将待测未知样品获得的光谱与预先记录的完全氧化或完全还原的完整线粒体光谱库进行比对，从而得到还原线粒体与总线粒体的比值，或线粒体的平均氧化还原状态 原位 电子传递链细胞色素。该比值定义为共振拉曼还原型线粒体比值（3RMR）。

3RMR 有 3 种不同的计算方式/类型：线粒体 3RMR（mito-3RMR）、复合物 III 3RMR（cIII-3RMR）和复合物 IV 3RMR（cIV-3RMR）。这些指数均通过特定组分的还原态数量与该组分总量的比值来计算。例如，cIII 的 3RMR 即为还原态 cIII 与组织中 cIII 总量的比值（cIII-R/(cIII-O + cIII-R)），cIV 的计算方式同理。因此，3RMR-cIII 表示还原态 cIII 与 cIII 总量的比值，3RMR-cIV 表示还原态 cIV 与 cIV 总量的比值。通过回归分析，可利用完整线粒体的光谱库计算线粒体氧化还原状态（mito-3RMR），或利用 cIII 和 cIV 的光谱库分别计算各个复合物的氧化还原状态（cIII-3RMR 和 cIV-3RMR）。最近一项研究9表明，mito-3RMR 可代表 cIII 和 cIV 氧化还原状态（即 cIII-3RMR 和 cIV-3RMR）的加权平均值。需要注意的是，复合物 I（cI）和复合物 II（cII）在 441 nm 波长下不具备拉曼活性或无法产生共振增强效应，因此在计算 mito-3RMR 时不予考虑。

利用这类3RMR，我们一直在界定3RMR的最佳范围。 "健康" 器官中，线粒体保持完整并具有充足的氧气供应。相反，受损器官可能存在氧气输送或利用不足，从而导致电子传递链复合物积累电子。电子积累会引起 "还原应激，" 将线粒体从氧化状态转变为还原状态，并提高3RMR值。多项研究8,9,10,11,12 从啮齿类和猪模型的心脏和肝脏等器官的研究，已开始揭示最佳的 "健康" 3RMR 的建议范围为 10 至 30。例如，Perry 等人将哺乳动物心脏置于缺氧条件下，结果显示 30% 的 3RMR 能够在检测缺氧组织时提供最佳的敏感性与特异性平衡8这一趋势在心脏组织的其他研究中得到了进一步证实11,12以及肝脏移植物10. 此外，Nyugen 等人9，证明在代谢已停止的组织中，3RMR值会降至极低（氧化态）水平， 3RMR 水平（7.667 ±± 4.926），而新鲜及可移植的温缺血肝脏的3RMR值则高于10（约12–15）9.

除了展示3RMR测量组织活力的方法之外，RRS的高灵敏度、高特异性和操作简便性使其在众多其他研究领域中具有广泛应用前景，特别是在涉及细胞代谢和线粒体功能变化的研究中。在先前的研究中，RRS已用于通过评估视神经乳头处视网膜神经节细胞无髓鞘轴突的代谢活性，来检测小鼠的黄斑变性和青光眼13此外，该技术还被用于检测先天性心脏病大鼠模型中的主动脉缩窄（CoA），这一诊断在新生儿心脏筛查中常常被遗漏。12该技术被用于理解器官移植领域相关各种实验条件下器官的功能与活力，包括评估器官活力的研究 离体 机器灌注10,11评估静态冷保存后的再氧合14，或减轻温缺血肝脏的再灌注损伤9.

本文旨在确立共振拉曼光谱法（RRS）作为一种实时、灵敏的线粒体健康评估工具。采用大鼠模型的完整肝脏，通过施加不同程度的缺血与氧再灌注作为应激测试，以评估线粒体的响应。在此氧应激测试中，新鲜肝脏依次经历5分钟的初始灌注、5分钟的缺血以及5分钟的再灌注。在整个应激测试过程中，同步采集3RMR信号，并检测乳酸、K⁺及氧分压（pO₂）的变化。与传统的血气分析指标相比，3RMR对氧合状态变化的响应更为迅速。本研究不仅突显了RRS在机制研究中的应用价值，也展示了其作为诊断方法和治疗研究平台的潜力。因此，本研究所共享的实验方案可为从事线粒体相关研究的各类科研人员提供参考。总体而言，RRS凭借其无创性、实时性和高度特异性，有望对细胞代谢研究产生重要影响。

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方案

所有实验用动物的饲养均遵循国家研究委员会的指南，并经麻省总医院（美国马萨诸塞州波士顿）机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. RRS 的设置与使用

  1. 设备描述：
    注意：便携式共振拉曼光谱系统（Pendar Technologies；产品仅用于科研目的）采用441 nm激光，因为该波长可共振增强线粒体细胞色素的拉曼光谱。激光功率在4 mW至8 mW之间运行。
    1. 通过光纤电缆将激光激发源连接至定制探头。该探头在组织表面照射出直径为2 mm的激光光斑，并同时收集发射的光谱。光谱随后通过带通滤光片，由电荷耦合器件（CCD）阵列采集。在180秒的时间范围内每秒采集一次光谱，并进行平均，以生成用于分析的原始、降噪后的光谱。
    2. 软件通过回归分析将所获得的光谱与预先测量的光谱库进行比对。
  2. 预建光谱库的操作流程
    注意：在本论文所展示的实验中，构建并使用了还原态与氧化态的线粒体、复合物III和复合物IV、血红蛋白以及肌红蛋白的光谱库。所有光谱库的RRS信号均在室温（21 °C）下的暗箱中采集。这些光谱库文件随分析软件另行提供。然而，根据感兴趣组织的类型以及其他拉曼活性分子的存在情况，也可适当调整以下方案来构建其他光谱库。血红蛋白、肌红蛋白以及氧化/还原态复合物III/IV光谱库的原始RRS光谱见补充图1。
    1. 血红蛋白光谱库（补充图1C）：
      1. 通过动物放血采集新鲜啮齿类动物血液。在玻璃比色皿中使用100%氧气对采集的血液进行氧合，或加入连二亚硫酸钠后使用100%氮气进行脱氧处理。
      2. 将RRS探头置于距离玻璃比色皿9 mm处，透过比色皿壁对每种状态连续测量10分钟的RRS信号。
      3. 利用1356 cm-1 处的光谱峰验证脱氧状态，利用1376 cm-1 处的峰确认氧合状态。
    2. 还原/氧化态线粒体光谱库（图1）
      1. 从匀浆并纯化的啮齿类动物心脏中分离线粒体，置于玻璃比色皿中。将拉曼探头置于距离比色皿9 mm处，透过玻璃壁测量这些线粒体的光谱。
      2. 通过向线粒体通入100%氧气创造完全氧化条件。通过检测1357 cm-1处还原态RR峰的消失来验证氧化状态。
      3. 通过将线粒体暴露于含少量硫化氢的100%氮气中创造完全还原条件。通过检测1371 cm-1处氧化态RR标志峰的消失来验证还原状态。
    3. 氧化/还原态复合物III/IV（补充图1A、B）：
      1. 按照其他文献所述方法分离复合物III和IV9,15,16,17。简而言之，使用分离的线粒体储备样品（相当于200 纳摩尔细胞色素a）作为起始材料。
      2. 将线粒体用冰冻缓冲液C（50 mM Tris，1 mM MgSO4, pH 8.45）稀释至细胞色素A浓度为10 nmol/mL。然后，在冰上轻轻搅拌的同时，逐滴加入10% w/v的n-β-D-十二烷基麦芽糖苷（DM），直至终浓度为1%。
      3. 在4 °C条件下以40,000 × g离心提取物40分钟。将上清液加载至一根已用5柱体积缓冲液C（含0.02% w/v DM）平衡过的离子交换树脂填充的2.5 cm × 20 cm玻璃柱上。
      4. 用2柱体积的缓冲液C洗涤后，用相同缓冲液中0–400 mM NaCl的线性梯度洗脱线粒体复合物，并以4 mL为一份收集洗脱液。
      5. 含复合物IV的绿色组分在梯度中间附近洗脱（约180 mL NaCl），早于含复合物III的红褐色组分。将分别含有各复合物的组分合并后浓缩至细胞色素a浓度为20–30 纳摩尔/mL。
      6. 各复合物分离完成后，分别将其暴露于氧化和还原条件下。在Tris缓冲液中，使用2 mL抗坏血酸（1 M）还原11 mM的复合物III样品以还原细胞色素c1，再加入2 mL HS（连二亚硫酸盐）以完全还原细胞色素bL和bH。
      7. 由于复合物IV经历多步催化氧化过程，需分步还原18.67 mM的复合物IV样品。为完全还原复合物IV，先加入两份2 mL H2O2（10 mM），随后加入2 mL HS。
      8. 每次添加试剂后采集光谱库数据，以捕捉循环中的每一步变化。将完全氧化态和完全还原态的光谱加入最终参考光谱库，以代表复合物IV的稳态。
      9. 将所有样品制备于1 mL玻璃小瓶中，固定于距离探头镜头9 mm的位置，并置于暗箱中以防止光污染。对每个复合物及其氧化状态采集600秒的RRS光谱。
      10. 按照先前方法17验证分离的cIII和cIV的纯度，并参照近期研究9中所述方法验证分离的cIII和cIV光谱库在解释完整线粒体光谱方面的充分性。
    4. 肌红蛋白光谱库（补充图1D）：
      1. 采用类似的氧气和氮气（溶解连二亚硫酸钠）气流，将心肌肌红蛋白提取物中的氧合肌红蛋白饱和度调节在0%至100%之间。通过1355 cm-1 和1376 cm-1处的标志峰验证拉曼光谱。

注意：上述大多数光谱组分（如血红蛋白或氧化/还原态线粒体）均为含血红素的分子，可被同一波长激发。该共振拉曼光谱（RRS）系统通过为每种分子建立基于其独特光谱信号的回归谱库，避免了信号重叠。所获得的散射光谱通过回归算法与选定的谱库进行比对。回归算法为每个谱库光谱输出一个因子，该因子代表其在记录光谱中相对贡献的最佳拟合估计值，从而反映其在组织中的相对浓度。由于该算法基于一系列波数范围内的最佳拟合，因此即使谱库各组分的光谱峰在位置或强度上仅有微小差异，回归分析仍可区分彼此密切相关的发色团。通过回归算法与光谱谱库，RRS系统可根据各组分独特的光谱峰，将总散射信号分解为多个组分，从而避免含血红素分子之间的信号重叠。为展示血红蛋白与线粒体之间的关系，本文提供了补充图2，其中包含来自肝脏灌注的光谱图像，分别分解为实测信号、最佳拟合曲线以及因各光谱峰差异导致的未解释残差。在图A中，选用了还原态与氧化态血红蛋白以及还原态与氧化态线粒体的回归谱库。通过谱库和回归分析生成的最佳拟合曲线与实测信号高度重合，未解释残差极小。在图B中，仅选用氧化态与还原态线粒体的谱库。由于存在显著的未解释残差结构，表明线粒体光谱峰的位置较血红蛋白偏移数个波数，而血红蛋白未被纳入此次回归分析。此外，在Nguyen 等人9的补充图中，作者阐明了线粒体与各独立复合体（cIII 和 cIV）之间的关系，以及各复合体之间的相互关系16，其中复合体III表现出更尖锐、频率更低的峰，而复合体IV则呈现更宽、频率更高的谱带。此外，作者还表明，还原态复合体III与复合体IV的谱库可完全解释还原态完整线粒体的实测光谱，从而产生极小的未解释残差。

显示氧化态和还原态线粒体光谱峰分析的拉曼光谱图
图1：完全氧化态与还原态线粒体的光谱库。 在分离的线粒体分别暴露于（A）100% 氧气或（B）100% 氮气以达到氧化态和还原态后，获得共振拉曼光谱（RRS）库光谱。这些状态通过存在RR（C）氧化态和（D）还原态标志峰得以确认。这些峰的位移对应于在有氧条件下分子振动模式的变化。每个峰的强度均归一化为1个任意单位（AU），因为在使用441 nm激发波长时，还原态的增强效应更强。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 使用共振拉曼光谱法进行数据采集

  1. 设备 设置：
    1. 将光谱仪单元（置于一个紧凑的盒体内）使用配套电缆连接至直流（DC）电源和电源适配器。光谱仪单元有一个带对准凹槽的圆形插头。
    2. 将圆形插头的凹槽与连接电源适配器的电缆凹槽对齐。连接端口前无需清洁。图2). 
    3. 使用提供的电缆，将运行分析的计算机连接到与光谱仪和电源共用的同一电源适配器上。
    4. 将激光探头放入探头架中。在实验开始时调整该探头的位置。
    5. 打开光谱仪控制软件（Cellular Energetics Software）。
  2. 软件设置：
    注意：系统提供针对不同类型组织的设置文件和回归分析库。这些文件包含有关RRS系统在回归分析中应包含哪些库、回归窗口中包含的光谱数量以及其他参数（如激光功率）的信息。默认设置可进行修改，并可将新设置保存为文件，供后续实验使用。下文展示了软件界面的截图 补充图3.
    1. 打开光谱仪控制软件后，会显示一幅图表，呈现3RMR百分比、氧饱和度（StO2）和肌红蛋白饱和度将显示出来。如果选择显示这些参数，此界面将在整个测量过程中实时显示它们。点击 设置 页面左下角的标签。
    2. 在……之下 信息 标签，输入会话信息 会话名称以及所需的任何细节在下方 实验说明 表。
    3. 有两种数据采集模式。使用 斑点检测 以累积光谱直至达到指定的质量指标（例如，目标 sigma 值或回归窗口/光谱数量）后停止记录。使用 连续模式 直至按下停止按钮为止记录光谱。两种模式下，所有数据（包括3RMR结果和单个光谱）均自动保存。本实验采用 连续模式.
    4. 输入所有会话信息后，点击 系统 表。
    5. 下 设置文件，选择适合该项目的方案（对于无细胞大鼠肝脏灌注，选择相应的方案） 大鼠肝脏脱细胞支架 方案）。这将自动调整测量类型、测量的平均长度（回归窗口）以及目标西格玛。
      1. 要创建一个新的设置文件，请调整上述列出的任意组件，然后单击 保存 按钮。这会将这些参数保存为一个独立的设置文件，随后可导入系统中。
      2. 要导入新的设置文件，请点击旁边的下拉菜单 默认（Mod） 并选择 导入新设置文件. 点击新的 设置文件 待导入。
    6. 在……下方 回归文库选择并确认用于数据采集和分析的文库组合。本实验选择了用于还原态和氧化态线粒体 [Mito Only] 的文库。其他用户可选择包含血红蛋白、肌红蛋白或在其他条件下发现的其他复合物的文库。 高级文库. 
    7. 选择并确认首选项 窗宽模式
      1. 自适应宽度模式：使用 自适应宽度 模式下，将单个光谱逐个添加至平均光谱，直至达到设定的最大σ目标值。若未达到σ目标值，当记录光谱数量达到预设回归窗口上限（即设定的最大记录光谱数量）时，记录将自动停止。一旦达到最小σ目标值，测量结果将实时显示在屏幕上。
      2. 固定宽度模式：使用 固定宽度 设置为将单个光谱逐个添加至平均光谱，直至达到设定的光谱数量（在平均长度中设置）。
    8. 系统设置完成后，单击 图示 表。
    9. 下 主系列，选择在测量期间需绘制并显示在屏幕上的组件。
    10. 确认所选的所有测量组件均符合目标实验方案的要求。
  3. 数据采集：
    注意：拉曼测量应在暗室中进行。开始数据采集前，确保工作区域尽可能屏蔽外界光线。若房间无法完全遮光，RRS 系统配备有一个黑色遮罩，中心设有矩形开口（如图所示） 图2），激光探头可由此置入。该装置可覆盖待检测的样本或器官切片区域。使用共振拉曼光谱（RRS）激光时，应避免眼睛直接或长时间暴露于激光。切勿将激光直接照射眼睛或反射表面。仅在激光探头准确定位于目标组织时方可启动激光。当输出功率为4 mW时，该激光器属于3R类激光产品；当输出功率为10 mW时，属于3B类激光产品。该激光器与组织接触是安全的。
    1. 选择适当的预存设置、记录参数和库文件。
    2. 将激光探头直接置于目标组织/器官上方，尽量使其与组织表面垂直，并距离组织1 cm。使用直尺精确测量器官表面至探头的距离，确保为1 cm。若信号不清晰，可将探头调整至小于1 cm的距离，但务必确保探头始终不接触组织。
      注意：探头可手持使用，但建议使用可调节且能保持稳定的探头支架/支架台。将探头尽可能垂直地置于组织表面，距离组织1 cm处。可使用直尺精确测量距器官表面1 cm的距离。若信号不清晰，可将探头调整至距离小于1 cm的位置，但探头切勿接触组织。
    3. 确认激光光斑位于左侧肝叶，尽可能靠近门静脉。
    4. 确认所有选定的谱库、回归设置、目标西格玛值、回归窗口和采集模式均正确且符合预期。
      1. 确保房间尽可能黑暗。检查探头窗口是否沾有任何污染物，尤其是血液。若存在污染，应使用蘸有70%异丙醇的无绒、无研磨性擦拭布清洁石英窗口，随后用干燥的擦拭布彻底擦干，再继续操作。
      2. 若污染严重，应按照上述方法尽可能彻底擦拭探头。然后，将激光器放入内壁贴有黑色胶带的暗盒中，并按下按钮校准设备 暗处理 校准大约需要5–10分钟。无论是否存在污染，均需每月校准一次设备，设备将自动发送提醒消息。
        注意：每项质量控制指标的解释、此类质量控制指标的示例，以及从最佳和次优记录中获得的原始光谱信号（补充文件 1, 图3, 补充图3）。这些质量控制标准是针对大鼠模型的完整肝脏优化而得。任何使用不同器官或动物模型新开发的方案，均应相应地优化和调整这些指标。
    5. 在主页上，点击 开始 点击按钮开始采集数据。根据所选设置，软件将持续记录数据，直至达到目标误差值（sigma）或180秒为止。数据采集现已完成。
      1. 根据这些图谱和数值推断RRS信号的质量，以调整探针位置或测量条件（图3）。如果获得的RRS信号未能达到这些质量控制标准，应调整探头，使其尽可能垂直，并使探头窗口距表面约9 mm。
    6. 数据采集/实验方案完成后，将整个肝脏/组织丢弃至生物危害废物容器中。使用70%乙醇清洁所有与器官/组织接触过的系统或表面。
      1. 若使用灌流系统，先运行去离子水（DI 水）与酶清洁剂的混合液（7.8 mL 酶清洁剂稀释于 1 L 去离子水中），随后再运行洁净的去离子水。
        注意：每次记录将作为单独的分析文件保存在新的会话文件下。3RMR 和线粒体信号强度（r3RMR）的结果将在主窗口中绘制显示。原始光谱也可同时展示。其他质量检查指标，如残余信号强度和总信号强度，将显示在下方 光谱 表。
  4. 数据分析：
    1. 数据采集完成后，单击 综述 点击屏幕底部的文件夹以打开实验文件并查看结果。
    2. 或者，打开一个包含结果的文本文件，选择所需会话文件，系统将打开一个包含所有测量结果的分析文件。每个参数及其sigma值将分别占据独立的列。例如，每秒获得的3RMR值将列在“3RMR”列下，其sigma值将列在“sigma_3RMR”列下。
    3. 每列的最后一行将包含该次实验文件各个参数的最终值。请使用此值进行绘图。
    4. 对每个会话文件/每次记录重复上述步骤。根据需要绘制所得数值。

激光光谱装置；手持探头、441 nm 激光器、数据分析；瞬态吸收图谱。
图 2：RRS 装置设置。RRS 系统设置的示意图。探头通过光纤电缆连接至 RRS 系统，该系统包含激光激发源和光谱仪。此装置进一步连接至任何装有光谱仪控制应用程序的笔记本电脑，用于数据采集与分析。计算机和光谱仪单元均需连接至电源插座。RRS 测量应在暗环境中进行。若房间无法完全屏蔽外界光线，RRS 系统配备一个中心带有矩形开口的黑色遮光罩，可将激光探头置于该开口处。该遮光箱覆盖待测样品或器官的测量区域。请点击此处查看此图的放大版本。

分析线粒体信号的拉曼光谱图，包含最佳拟合线和残差。
图3：质量次优与最优的示例轨迹及其质量控制指标。残差信号（噪声）用橙色括号标出，线粒体信号用绿色括号标出。（A）来自次优拉曼信号的示例轨迹。残差信号过大，无法与线粒体信号区分。在整个测量信号中，光谱峰无法分辨。（B）来自最优拉曼信号的示例轨迹。线粒体信号明显强于残差信号且可清晰区分。所获得测量结果中的光谱峰可被识别。（C）从各信号获得的质量控制指标。总体而言，次优读数所获得的总信号低于最优读数。与次优记录相比，最优记录中测得的线粒体信号更多，线粒体信号分别占总信号的17%和14%。最优读数的信号测量误差为4.3%，而次优读数为18.5%。类似地，未解释的残差信号在次优记录中占总信号的11%，而在最优记录中仅占3.6%。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 使用RRS评估线粒体健康

注意：采用共振拉曼光谱技术（RRS）开发了一种线粒体活力指标（3RMR），用于指示移植器官的活力状态。本研究旨在展示氧合状态（进而反映细胞呼吸）的变化如何体现在3RMR趋势中，并与乳酸和K+等传统损伤生物标志物进行比较。本实验采用氧应激测试方法，即在持续灌注5分钟后，暂停氧合灌注流5分钟，随后再恢复灌注5分钟。在整个应激测试过程中，持续采集RRS测量数据以及流入和流出的灌注液样本。

  1. 肝脏获取：
    1. 使用3%–5%异氟烷在诱导室中对动物进行镇静。用活性炭过滤过量蒸气。
    2. 对雄性Lewis大鼠（150 g）进行全肝切除术。结扎门静脉的分支。通过下腔静脉注射50 U肝素钠。术中用16 G导管插入门静脉，并用50 mL生理盐水冲洗肝脏。
    3. 将获取的肝脏置于含有30 mL威斯康星大学（UW）溶液的培养皿中，并置于冰上。
  2. 亚常温 机器灌注（SNMP）装置与共振拉曼测量:
    1. 按照先前所述设置RRS设备。设置 无细胞大鼠肝脏方案 在光谱仪控制软件上，该软件会自动设置 宽度模式 至 自适应宽度，将平均长度设为180，目标σ设为1.5。同时选择 3RMR 和 荧光 作为测量参数，以及 仅线粒体 作为回归库。将采集模式设置为 连续模式.
    2. 按照其他地方所述设置 SNMP 系统18.
      1. 简而言之，确保灌注装置由灌注室、蠕动泵、膜式氧合器和气泡捕集器组成。
      2. 以大气混合比例（95% O₂）输送氧气2 和 5% CO2）；保留 pO2 维持压力在400–500 mmHg之间。使用压力传感器监测肝内压力，并将其保持在3–5 mmHg之间。通过取样口收集样品。
    3. 软件和灌注系统设置完毕后，将穿透门静脉（PV）的导管连接至灌注机的进液管路。保持器官、灌注液及灌注装置处于室温（21 °C），无需水浴帮助。
    4. 利用蠕动泵通过门静脉（PV）中的导管将灌注液输送至器官。
      1. 配制灌注液时，将500 mL不含酚红的Williams'培养基与5 g牛血清白蛋白（BSA）、12 mg水溶性地塞米松、5 mL青霉素-链霉素、5 mL L-谷氨酰胺混合， 2.5 µL 胰岛素和1000 U肝素。
      2. 将所有组分置于摇床搅拌约20分钟，或直至所有组分完全溶解。增加灌注流速，使压力达到3–5 mmHg。
    5. 然后，将RRS激光源放入探头架中，并置于肝脏最大叶上方1 cm处，尽可能靠近门静脉（PV）。在灌注5分钟时（T5）并在10分钟时（T10）。在15分钟（T15).
    6. 在整个应激试验过程中采集共振瑞利散射（RRS）测量数据；从时间点 T 开始，每 5 分钟采集一次流入和流出测量数据0 (图4）。绘制3RMR值以及流出道K+ T 的水平和乳酸水平0，T5，T10，T15 （n = 3）（图5).
    7. 在 T 时刻计算耗氧率（OCR）0，T5，T10，T15 通过将氧的流入/流出分压（pO2) 与血浆中氧气的溶解系数（0.00314）相乘。绘制 T 的耗氧率（OCR）0，T5，T10，T15 (图5).
      注意：灌注（T5），缺血性（T10），并重新灌注（T15）表明 来自一个肝脏的结果显示（图6)

使用氧合机器进行大鼠肝脏灌注的过程、灌注装置、缺血与再灌注阶段。
图4：实验流程示意图。对雌性Lewis大鼠实施全肝切除术。获取的肝脏置于亚常温机械灌注系统中，并在前5分钟内供给含氧灌注液。灌注液经门静脉流入肝脏，并通过蠕动泵循环（灌注流向以蓝色箭头表示）。在T5时间点暂停氧合灌注5分钟，随后在T10时间点重新启动并持续5分钟。在整个应激测试过程中进行三次重复微循环测量（以激光表示）。分别在T0、T5、T10和T15时间点采集灌注液样本。 请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

新鲜肝脏通过氧应激测试进行缺血和再灌注处理。随后，在整个应激测试过程中，将3RMR的实时变化与在T0、T5、T10、T15时间点从灌注液分析中获得的耗氧率、流出乳酸和钾离子进行比较。在健康状态下，3RMR值预计介于10%至30%之间（图5A）。如预期所示，由于在这些时间点之间肝脏持续接受含氧灌注液供应，T0和T5时的3RMR值均处于该范围内（图5A）。然而，在缺血期结束时（T10），3RMR值超出最佳范围（图5A）。这一升高表明线粒体向还原状态转变，因脱氧导致电子在传递链中积聚。在T10时，恢复含氧灌注流，再灌注期开始。在再灌注期结束时（T15），随着氧气作为最终电子受体重新引入，电子传递链（ETC）活性恢复，3RMR值也回归至最佳水平（

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讨论

本研究介绍了一种非侵入性、实时且高度灵敏的线粒体健康定量方法，该方法采用便携式共振拉曼光谱系统，系统由紧凑型探头中的激光器组成，并通过光纤电缆连接至激光泵。该方法使用441 nm激光激发线粒体，线粒体根据其氧化状态产生独特的光谱信号。因此，共振拉曼光谱（RRS）能够通过其光谱特征量化线粒体的每种状态，并通过回归分析将发射光谱与预先测量的光谱库进行比对。随后基于还原态线粒体与总线粒体的比值构建了一项线粒体健康指标：还原共振拉曼线粒体比率（3RMR）。

本文重点展示在无需样本处理的情况下，3RMR 随天然组织氧合状态实时变化的情况。该目标通过氧应激测试实现：在持续氧合灌注 5 分钟后，暂停灌注 5 分钟，随后重新启动灌注 5 分钟。在整个应激测试过程中持续采集 3RMR 测量数据。通过在缺血与氧合状态之间切换的应激测试模型，可追踪线粒体氧化还原状态的连续变化，进而反映线粒体功能的变化。换句话说，氧应激测试使我们能够追踪 3RMR 随氧合状态变化的趋势。本课题组已指出，3RMR 值升高与缺血条件相关，即灌注中断导致电子传递链（ETC）中的电子因缺乏最终电子受体 O2...

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披露

作者声明存在竞争利益。S.N.T 和 P.R. 拥有与本研究相关的临时专利申请。P.R. 是 Pendar Technologies 的员工及股东。S.N.T 的利益由麻省总医院（MGH）和 Partners HealthCare 根据其利益冲突政策进行管理。J.N.K 的竞争利益由波士顿儿童医院（BCH）的利益冲突政策进行管理。本研究中使用了以下专利技术：US2020/0281474A1 利用拉曼光谱进行细胞能量代谢的体内监测（申请）。此外，已提交了多项使用共振拉曼光谱技术在眼科、组织存活性及烧伤损伤评估中的专利申请，其中 R.J. 也是发明人之一。

致谢

本研究获得了美国国立卫生研究院（R01DK134590）向 S.N.T. 提供的慷慨资助。我们还衷心感谢以下机构向 S.N.T. 提供的资助：美国国立卫生研究院（K99/R00 HL1431149；R01HL157803；R24OD034189）、美国国家科学基金会（EEC 1941543）、Polsky 家族基金会以及波士顿 Shriners 儿童医院（项目编号 #BOS-85115）。此外，我们感谢美国肝病研究学会基金会通过项目编号 #LIFER23-263034 向 R.J. 提供的资助。作者对哈佛医学院病理学核心实验室在组织学研究中提供的专业支持表示深切感谢。我们谨向美国国立卫生研究院心肺血液研究所的 Robert Balaban 博士和 Armel Femnou 博士致以诚挚谢意，感谢他们在线粒体能量代谢领域的专业知识，以及在构建单个线粒体复合物的 RRS 文库过程中所提供的宝贵帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16 G 导管 BD Insyte Authoguard381454用于门静脉插管
活性炭Vet Equip Vapor Guard 活性炭931401用于麻醉期间过滤过量蒸气
BSA Sigma-Aldrich A7906灌注液成分
气泡捕获器 Radnoti130149
地塞米松Sigma-AldrichD2915灌注液成分
Glutamax Thermo Fisher Scientific35050061灌注液成分
Masterflex L/S 精密泵管（24 G）Fisher Scientific 13-200-292用于使灌注液流经肝脏
Masterflex 蠕动泵 Cole Parmer, Vernon Hill, IL7528-30 用于使灌注液流经肝脏
膜式氧合器 Radnoti130144用于灌注液的氧合。 
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP4458灌注液成分
RAPIDPoint 500 血气分析系统Siemens Healthineers41115805用于血气分析
共振拉曼系统  Pendar TechnologiesA4D441有关该产品的咨询，请联系 Pendar Technologies

参考文献

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