利用共振拉曼光谱实时、非侵入式评估线粒体功能

摘要

我们提出了一种利用共振拉曼光谱（RRS）进行线粒体健康监测的非侵入性实时方法。我们利用RRS定量线粒体氧化还原状态，并开发了线粒体健康的指标——共振拉曼减线粒体比率（3RMR），该指标显示对氧气变化的响应速度快于传统血液气体分析物。

摘要

尽管线粒体在发病机制和疾病进展中起着核心作用，但对线粒体健康动态的机制性洞察仍然昂贵且难以获得。为弥补这一空白，本研究采用共振拉曼光谱（RRS）评估线粒体功能，采用便携式系统实时、无创且定量地测量大鼠肝脏中的线粒体细胞色素氧化还原状态。在本协议中，我们展示了该技术的应用，包括设置、数据采集和数据处理。本研究展示了一项概念验证实验，突出RRS测量线粒体氧化还原状态实时变化的能力——进而测量线粒体功能。简而言之，RRS装置连接了激光泵和数据采集计算机，并放置在距离大鼠肝脏1厘米处。 获取参数的选择符合大鼠肝脏实验方案;在含氧和缺血条件下，利用氧应激测试测量氧化还原状态。线粒体氧化还原状态的变化在整个氧气压力测试过程中被追踪。

引言

线粒体在细胞功能和稳态中起着关键作用。线粒体是细胞代谢的主要驱动因子，通过氧化磷酸化调节ATP的生成。它们还作为信号器，通过调控凋亡通路、ROS和Ca⁺²信号1来决定细胞命^运。因此，线粒体功能障碍可能导致各种神经退行性、肌肉和心血管疾病 ^2,3。尽管线粒体在疾病进展中起着关键作用，但评估线粒体功能可能具有侵入性、成本高昂且局限性强。

线粒体功能的关键指标，如氧气消耗率、氧化磷酸化以及电子传递链（ETC）中各种复合物的活性，通过呼吸测验法进行测量。ETC由四个复合体（I–IV）组成，嵌入于内线粒体膜（IMM）。这些复合物借助其他辅酶，将还原底物（如NADH和FADH2）的电子转移到最终电子受体_O2，O2再被还原为水。大多数现代呼吸测定，如Seahorse和Orobros O2k，都需要组织处理，因此限制了其在转化研究中的应用 ^4,5。 测量线粒体膜电位（MMP）是评估线粒体功能障碍的另一种方法，利用阳离子亲脂荧光团（如JC-1）以及显微成像，在其中，耦合（健康）和未耦合（受损）线粒体以不同波长发荧光⁶。然而，这些检测可能具有较低的灵敏度^5。染料本身在高浓度下也可能具有较高的细胞^毒性5。最后，与呼吸测量类似，该技术也需要组织处理。基于光谱学的技术近年来被用作非侵入性线粒体健康评估方法。例如，磷磁共振光谱（P-MRS）是一种通过测量含磷代谢物浓度来评估细胞代谢的方法，已被用于表征工程化的分化中脂肪生成组织⁷。然而，这种技术同样需要专业设备和培训。

我们团队最近展示了一种实时、非侵入性且高度特异性的技术，利用共振拉曼光谱（RRS）测量线粒体氧化还原状态，作为器官存活能力的标志。RRS利用光子的非弹性散射来定量线粒体细胞色素的氧化还原态。线粒体细胞色素、血红蛋白和肌红蛋白等分子血红素基中的卟啉环，在用441纳米波^长激光激发时，会根据氧化态产生特征性的拉曼光谱。虽然RRS系统使用441纳米波长，但也可使用420纳米和405纳米波长的激光，这两种激光器优先增强不同的细胞色素复合物。从未知感兴趣样本获得的光谱与预先录制的完全氧化或还原完整线粒体库交叉比对，得出还原粒线体与全粒线体的比例或原 位 ETC细胞色素的平均氧化还原状态。该比值定义为共振拉曼还原线粒体比（3RMR）。

3RMR有三种不同的计算类型：线粒体3RMR（mito-3RMR）、复合体III 3RMR（cIII-3RMR）和复合体IV 3RMR（cIV-3RMR）。这些指标均通过 的分数除以给定组成部分总数的比例计算得出。例如，cIII的3RMR是减少的cIII与组织中cIII总数的比值（cIII-R/（cIII-O+CIII-R）。同样的模式也适用于《文明IV》。因此，3RMR-cIII指的是减少cIII与cIII总量的比值，3RMR-cIV指的是减少cIV与cIV总量的比值。通过回归分析，可以利用完整线粒体的光谱库计算线粒体氧化还原态（mito-3RMR），或利用cIII和cIV光谱库计算单个复杂氧化还原态（cIII-3RMR和cIV-3RMR）。最近一篇第⁹ 期发表的文献表明，mito-3RMR代表cIII和cIV氧化还原状态（即cIII-3RMR和cIV-3RMR）的加权平均值。需要注意的是，cI和cII在441 nm波长内既不具拉曼活性，也不具有共振增强。因此，计算mito-3RMR时不会计算这些数值。

利用这些类型的3RMR，我们一直在定义3RMR的最优区间。在“健康”器官中，线粒体保持完整且氧气供应充足。相比之下，受损器官可能氧气输送或利用不足，导致ETC配合物积累电子。电子积累会导致“还原应力”，使线粒体从氧化状态转变为还原状态，并使3RMR值增加。多项研究8^{、9、10、11、12}涵盖心脏和肝脏，采用啮齿动物和猪模型，开始揭示3RMR的最佳“健康”范围，建议在10到30之间。例如，Perry等人对哺乳动物心脏进行了缺氧，3RMR达到30%后，检测缺^氧组织时敏感性和特异性达到最佳平衡。这一趋势在心脏组织^11、12和肝移植¹⁰的研究中得到了进一步证实。此外，Nyugen等人9证明，3RMR值在代谢停止的组织中降至极低（氧化）值，非可移植温缺血肝在正常体温机器灌注3小时后RMR为3.667（7.667±±4.926），而新鲜和可移植温缺血肝的RMR为3%超过10（~12–15^）。

除了展示3RMR如何测量组织存活能力外，RRS的灵敏性、特异性和易用性使其高度适用于许多其他影响细胞代谢和线粒体功能的研究类型。在此前的研究中，RRS已被用于检测小鼠黄斑变性和青光眼，通过评估视神经头视网膜神经节细胞未髓鞘轴突的代谢活性，¹³。此外，它还用于检测先天性心脏病大鼠模型中的主动脉凝缩（CoA），这一诊断在新生儿心脏筛查中常被遗^漏。该技术被用于理解器官移植领域中各种实验条件下的器官功能和存活能力，包括评估体外机器灌注器官存活能力的研究^10,11，评估静态冷藏后的再氧合¹⁴，或减轻温缺血肝脏再灌注损伤^{的研究9。}

本文旨在将RRS确立为实时、敏感的线粒体健康评估工具。大鼠模型中的全肝脏接受不同水平的缺血和氧气再灌注作为压力测试，以评估线粒体反应。在该氧气压力测试中，新鲜肝脏接受5分钟初始灌注、5分钟缺血和5分钟再灌注。在整个压力测试过程中，测量了3RMR，以及乳酸K+、氧分压（pO2）。相比传统血液气体分析物，3RMR对氧气变化的反应更快。通过这些实验，RRS不仅用于机制性研究，还被强调为诊断方法和治疗试验平台。因此，该共享协议对研究线粒体的多种研究者可能非常有用。总体而言，RRS以其非侵入性、实时且高度特异性，可能对细胞代谢产生重大影响。

方案

所有实验动物均按照国家研究委员会的指导方针进行饲养，并获得美国麻省总医院（波士顿，美国）机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 建立并利用RRS

1. 设备描述：
   注意：便携式RRS系统（Pendar Technologies;产品仅供科研用途）使用441纳米激光，是因为对线粒体细胞色素的拉曼光谱进行了共振增强。激光器的功率在4毫瓦到8毫瓦之间。
   1. 通过光纤电缆将激光激发源连接到定制探头。探针在组织上照射直径2毫米的激光点，并收集发射的光谱。频谱随后通过带通滤波器，并被电荷耦合器件（CCD）阵列收集。在180秒的时间范围内，每秒收集一次光谱，并进行平均，生成一个原始、噪声减少的光谱用于分析。
   2. 该软件通过回归分析将获得的频谱与预先测量的频谱库进行比较。
2. 预录库程序
   注：本文中提出的实验创建并利用了还原和氧化的线粒体、复合体III和复合体IV的血红蛋白和肌红蛋白文库。所有文库的RRS信号均在室温（21°C）的黑匣子中采集。这些库文件由分析软件单独提供。然而，根据感兴趣的组织及其他拉曼活性分子的存在，也可以通过适当调整以下方案创建其他文库。血红蛋白、肌红蛋白及氧化/还原的III/IV复合物文库的原始RRS光谱提供于 补充图1。
   1. 血红蛋白文库（补充图1C）：
      1. 通过动物放血采集新鲜啮齿动物血液。用100%氧气加氧收集的血液，或用100%氮气脱氧，放入玻璃杯中，加入二硫代酸钠。
      2. 通过玻璃壁测量每个状态的RRS10分钟，RRS探头距离玻璃Cuvette9毫米。
      3. 使用1356 ^cm-1 的光谱峰值验证缺氧状态，使用1376 ^cm-1 的峰值确认含氧状态。
   2. 还原/氧化线粒体文库（图1）
      1. 在玻璃杯中从均质纯化的啮齿动物心脏中分离线粒体。将拉曼探针放置在距离玻璃角球9毫米处，测量这些线粒体透过玻璃壁的光谱。
      2. 通过为线粒体提供100%的氧气流量，创造完全氧化的条件。通过1357 ^cm-1处没有还原的RR峰来验证氧化态。
      3. 通过将线粒体暴露在含有少量硫化氢的100%氮中，创造完全减少的条件。通过1371 ^cm-1处无氧化RR标记峰验证还原条件。
   3. 氧化/还原复合物III/IV（补充图1A，B）：
      1. 分离其他地方描述的复合体III和IV，编号^{9、15、16、17}。简而言之，使用分离出的线粒体样本（相当于200纳摩尔细胞色素a）作为起始材料。
      2. 将线粒体稀释为10 nmol细胞色素A/mL，置于冰冷缓冲液C（50 mM Tris，1 mM MgSO_4，pH 8.45）。然后，在冰上轻轻混合，滴滴加入10%的n-β-D-十二烷基麦芽苷（DM），最终浓度为1%。
      3. 在40,000 × g下离心，40分钟，温度为4°C。 将上清液涂抹在2.5厘米×20厘米玻璃柱上，该柱先填充了与5柱缓冲液C（含0.02% w/v DM）平衡的交换树脂。
      4. 用两柱体积的缓冲液C洗涤后，在同一缓冲液中施加0–400 mM的线性NaCl梯度洗脱线粒体复合物，并以4 mL组分收集洗脱液。
      5. 含有复合物IV的绿色组分在梯度中部附近（~180 mL NaCl）洗脱，随后是含有复合体III的红色组分。将包含每个复合物的聚集组分浓缩至20–30 nmole的细胞色素a/mL。
      6. 分离出单个配合物后，分别暴露于氧化和还原条件下。用2毫升抗坏血酸（1 M）还原11毫毫米的Tris缓冲液中，还原细胞色素c1,2毫升HS（亚硫酸氢），完全还原细胞色素b、_L和b_。
      7. 在Tris缓冲液中还原18.67毫米的IV样品，因为IV复合物经历多步催化氧化过程。要完全还原IV复合体，加入两份2毫升H₂O₂（10 mM），随后加入2毫升HS。
      8. 每次添加后收集库谱，以捕捉循环的每一步。将完全氧化和还原的光谱加入最终参考库，以表示复杂物IV的稳态。
      9. 将所有样品装入1毫升玻璃瓶中，固定置于探针透镜9毫米处，并装入黑匣子以防止光线污染。收集每个复合物和氧化态的RRS光谱600秒。
      10. 验证^前述分离的cIII和cIV纯度，并验证分离的cIII和cIV光谱库在解释完整线粒体光谱方面的能力，如近期论文⁹。
   4. 肌红蛋白文库（补充图1D）：
      1. 利用类似的氧气和氮气（含溶解的二硫代酸钠）流量，将心肌肌红蛋白提取物的氧髓红蛋白饱和度在0%到100%之间变化。通过1355 ^cm-1 和1376 ^cm-1的标记峰值验证拉曼光谱。

注意：上述大多数光谱成分，如血红蛋白或氧化/还原线粒体，都是含血红素分子，并被相同波长激发。该RRS系统通过为每个分子创建基于其独特的光谱信号的回归库，避免了信号重叠。获得的散射光谱会通过回归算法对所选文库进行分析。回归算法为每个文库谱谱生成一个因子，代表其在记录谱谱中相对贡献的最佳拟合估计，从而得到其在组织中的相对浓度。由于算法在波数范围内使用最佳拟合，各文库组成部分光谱峰位置或强度的微小差异使回归能够识别出即使是密切相关的发色团。通过回归算法和频谱库，RRS系统可以根据信号独特的光谱峰将总散射信号分解为不同组分，避免含血红素分子的信号重叠。为展示血红蛋白与线粒体之间的关系，附有 补充图2 ，展示了肝脏灌注所得的光谱图像，分为测量信号、最佳拟合线以及因单个光谱峰差异产生的未解释残余。在A面板中，选取还原和氧化的血红蛋白以及还原和氧化的线粒体回归文库。通过图书馆和回归分析整理出的最佳拟合线与测量信号完美重叠，且几乎没有未解释的残余。在面板B中，仅选择氧化和还原的线粒体文库。由于存在一个巨大的未解释残留结构，线粒体光谱峰与未纳入回归分析的血红蛋白峰相差数波数。此外，在Nguyen等人的补充图9^中，作者解释了线粒体与单个复合体（cIII和cIV）之间的关系，以及单个复合体¹⁶之间的关系，即复合体III表现出更明显的低频峰值，而复合体IV表现出更宽且向上移的带。此外，作者表明还原的III和IV复合体文库完全解释了还原的整个线粒体的测量光谱，导致未解释残余极少。

图1：完全氧化和还原的线粒体光谱库。 在分离的线粒体分别以（A）100%氧气或100%氮（B）达到氧化和还原状态后，获得了RRS文库光谱。这些状态通过RR（C）含氧和减少（D）标记峰的存在得到确认。这些峰的偏移对应于氧气存在下分子振动模式的变化。每个峰的强度被归一化为任意强度单位（AU），因为使用这个441纳米激发波长，还原态的增强更大。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 利用RRS进行数据收集

1. 设备设置：
   1. 将光谱仪单元（装在紧凑的盒子内）连接到直流（DC）电源，并使用附带的电缆连接到电源适配器。光谱仪单元有一个带校准凹槽的圆形插头。
   2. 将圆形插头的凹槽与连接电源适配器的线缆对齐。连接端口前无需清洁（见图2）。
   3. 将运行分析的计算机连接到连接光谱仪和电源的电源适配器，使用提供的电缆。
   4. 把激光探针放进探针架里。在实验开始时调整该探头的位置。
   5. 打开光谱仪控制软件（细胞能量软件）。
2. 软件设置：
   注意：系统随系统提供不同类型组织的设置文件和回归库。这些文件包括RRS系统应包含哪些库、回归窗口包含多少光谱，以及激光功率等参数的信息。默认设置可以更改，并保存一个新的设置文件以供未来实验使用。下文详细软件的截图见 补充图3。
   1. 打开光谱仪控制软件后，会出现显示3RMR、血氧饱和度（StO₂）和肌红蛋白饱和度百分比的图表。如果选择这些指标，这些指标将在测量过程中实时显示于此界面。点击页面左下角 的设置 标签。
   2. 在 “信息 ”标签下，在 “会话名称”下输入会话信息，在 “会话描述 ”标签下输入必要的信息。
   3. 有两种数据收集方式。使用 抽点检查 模式积累光谱，直到满足指定的质量指标（例如目标σ或回归窗口/光谱数量），然后停止录制。使用 连续模式 记录光谱直到按下停止按钮。在这两种模式下，所有数据，包括3RMR结果和单个光谱，都会自动存储。本实验采用 连续模式。
   4. 输入完所有会话信息后，点击 系统 标签。
   5. 在 设置文件中，选择适合项目的方案（对于无细胞大鼠肝脏灌注，选择 大鼠肝无细胞 协议）。这会自动调整测量类型、平均测量长度（回归窗口）以及目标σ。
      1. 要创建新的设置文件，请调整上述任一组件，然后点击 保存 按钮。这样可以把这些参数保存成单独的设置文件，然后导入系统。
      2. 要导入新的设置文件，点击默认（ 模组 ）旁边的下拉菜单，选择 导入新设置文件。点击新的 设置文件 导入。
   6. 在 回归库中，选择并确认用于数据采集和分析的库组合。本实验选用了还原和氧化线粒体（仅有丝粒体）的文库。其他用户也可以选择使用包含血红蛋白、肌红蛋白或其他高级 文库中其他复合物的库。
   7. 选择并确认首选 的窗口宽度模式。
      1. 自适应宽度模式：使用 自适应宽度 模式将单个光谱添加到平均光谱中，直到达到最大σ目标。如果未达到σ目标，记录将在达到设定回归窗口上限（即被指示记录的最大光谱数）时停止。达到最小西格玛目标后，测量结果将显示在屏幕上。
      2. 固定宽度模式：使用 固定宽度 模式向平均频谱中添加单个光谱，直到包含目标频谱数量（设定为平均长度以下）。
   8. 系统设置完成后，点击 “情节 ”标签。
   9. 在 主系列中，选择测量时要绘制并在屏幕上显示的组件。
   10. 确认所选所有测量成分均符合相关协议。
3. 数据采集：
   注意：拉曼测量应在黑暗空间内进行。在开始数据采集之前，确保工作区尽可能遮挡光线。如果房间无法完全遮挡光线，RRS系统配有黑色盖板，中间有一个矩形开口（如图所示） 图2），激光探针可以穿过。箱子可以覆盖样本或器官中进行RRS测量的区域。使用RRS激光时，避免直接或长时间的眼睛暴露。不要直接将激光照射到眼睛或反光表面。只有当激光直接放置在目标组织上时才会激活。RRS激光器在4毫瓦时属于3R类激光器，10毫瓦时属于3B类激光器。激光对组织接触是安全的。
   1. 选择相应的预先保存的设置、录制参数和库文件。
   2. 将激光探头直接放置在目标组织/器官上方。探头尽可能垂直，距离组织1厘米。用尺子准确测量距离器官表面1厘米的距离。如果信号不清晰，请将探针调整到距离不超过1厘米。但要确保探头绝不接触组织。
      注意：探头可以手持，但建议使用可调节且保持稳定的探头支架。探头尽可能垂直，距离组织1厘米。用尺子可以精确测量距离器官表面1厘米的距离。如果信号不清晰，探针可以调整到比1厘米更近的位置。然而，探头绝不应接触组织。
   3. 确认激光斑点位于左侧外叶，尽量靠近门静脉。
   4. 确认所有选定的文库、回归设置、目标σ、回归窗口和采集模式均正确且符合要求。
      1. 确保房间尽可能黑暗。确认探针窗户上没有任何污染物，尤其是血迹。如有污染，使用无绒、非磨蚀性、含70%异丙醇的湿巾清洁石英窗户，然后用干湿巾彻底干燥后再进行。
      2. 如遇严重污染，请如上所述尽可能彻底地擦拭探头。然后，将激光器放入贴有黑色胶带的暗色外壳中，按下 “Take Dark ”按钮来校准设备。校准大约需要5到10分钟。无论是否污染，每月校准一次设备，它会自动发送提醒信息。
         注：各质量控制指标的解释、此类质量控制指标示例，以及从最优和次优记录中获得的原始频谱信号（补充文件1， 图3， 补充图3）。这些质量控制标准针对大鼠模型的全肝进行了优化。任何使用不同器官/动物模型的新方案都应相应优化和调整这些指标。
   5. 在主页点击 开始 按钮开始获取数据。根据所选设置，软件会持续录制，直到达到目标误差值（sigma）或180秒。数据采集现已完成。
      1. 从这些图和数值推断RRS信号质量，以便调整探针位置或测量条件（见图3）。如果获得的RRS信号不符合这些质量控制标准，请将探针调整至尽可能垂直，且距离探针窗面约9毫米。
   6. 数据采集/实验方案完成后，将整个肝脏/组织丢弃到生物危害箱中。用70%乙醇清洁任何与器官/组织接触的系统或表面。
      1. 如果使用灌注系统，先用去离子水混合酶清洁剂（7.8毫升稀释于1升去离子水），然后用干净的去离子水。
         注意：每个录音都会作为一个独立的分析文件保存，放在新的会话文件下。3RMR和线粒体信号强度（r3RMR）的结果绘制在主窗口中。原始光谱也可以显示。其他质量检查指标，如残余信号强度和总信号强度，将显示在 频谱 标签下。
4. 数据分析：
   1. 数据采集完成后，点击屏幕底部的 评审 文件夹打开实验文件并查看结果。
   2. 或者，打开包含结果的文本文件。选择感兴趣的会话文件。将打开包含所有测量数据的分析文件。每个参数及其σ值都有自己的列。例如，每秒获得的3RMR值会显示在“3RMR”列下，其sigma值会显示在“sigma_3RMR”栏下。
   3. 每列的最后一行将包含该会话文件每个参数的最终值。用这个数值来绘制。
   4. 对每个会话文件/每个录音重复步骤。情节获得了所需的数值。

图2：RRS设备设置。 RRS系统设置示意图。探头通过光纤电缆连接到包含激光激发源和光谱仪的RRS系统。该设备随后连接到任何包含光谱仪控制应用的笔记本电脑，用于数据收集和分析。计算机和光谱仪单元都连接到电源插座。RRS测量应在黑暗中进行。如果房间无法完全遮挡光线，RRS系统配有黑色盖子，中间有一个矩形开口，激光探针可以放置于此。盒子覆盖了采集RRS测量的器官样本或部位。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：次优质量和最优质量痕迹的示例及质量控制指标。 残余信号（噪声）用橙色括号标记，线粒体信号用绿色括号标记。（A） 来自次优拉曼信号的示范迹。残余信号太大，无法与线粒体信号区分开来。在测量信号中，频谱峰是无法区分的。（B） 最优拉曼信号的示范迹。线粒体信号明显更大且与残余信号区分开来。从所得测量中可以区分光谱峰。（C）从每个信号中获得的质量控制指标。总体而言，次优读数获得的总信号小于最优读数。与次优记录相比，最优记录中测量到的线粒体信号更多，线粒体信号分别占总信号的17%和14%。信号测量时，最优读数误差为4.3%，而次优读数误差为18.5%。同样，未解释的残余信号占次优记录总信号的11%，而最优记录中占3.6%。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 利用RRS评估线粒体健康

注：共振拉曼光谱（RRS）技术被用于开发线粒体存活率指标（3RMR），以指示移植器官的存活性。本研究旨在展示氧合变化——进而细胞呼吸的变化——如何与传统损伤生物标志物（如乳酸和K⁺）相比，反映在3RMR趋势中。此处采用氧应激测试，连续灌注5分钟后，含氧灌注流暂停5分钟，然后恢复5分钟。在整个压力测试过程中，会进行回流压力测量以及流入和流出的灌注样品。

1. 肝脏获取：
   1. 在诱导腔体内使用3%–5%异氟醚进行镇静动物。用活性炭过滤多余的蒸汽。
   2. 对雄性刘易斯鼠进行全肝切除术（150克）。结扎门静脉的分支。通过下腔静脉注射50微便尔钠肝素。手术时用16克导管穿过门静脉，并用50毫升生理盐水冲洗肝脏。
   3. 将采集的肝脏放入含有30毫升威斯康星大学（UW）溶液的培养皿中冰敷。
2. 亚母膜机器灌注（SNMP）装置及共振拉曼测量：
   1. 按照之前描述的设置RRS设备。在光谱仪控制软件中设置 无细胞大鼠肝协议 ，该协议自动将 宽度模式 设置为 自适应宽度，平均长度为180，目标σ为1.5。它还选择 3RMR 和 荧光 作为测量参数， 仅选择Mito 作为回归库。将采集模式设置为 连续模式。
   2. 按照其他地方描述的设置SNMP系统¹⁸。
      1. 简而言之，确保灌注装置包括灌流室、蠕动泵、膜氧合器和气泡陷阱。
      2. 用大气混合气（95_%氧气 和5%二氧化碳）输送_氧气;保持2氧化_钾在 400–500 mmHg之间。用压力传感器监测肝内压，保持在3–5 mmHg之间。通过采样口采集样本。
   3. 软件和灌注系统设置好后，将穿透PV的导管连接到灌流机的流入管。保持器官、灌注和灌注设备在室温（21°C）下，无需水浴。
   4. 通过蠕动泵将灌注液通过静脉导管输送到器官。
      1. 准备该灌注液时，将500毫升无酚红的威廉姆斯培养基与5克牛血清白蛋白（BSA）、12毫克水溶性地塞米松、5毫升青霉素链霉素、5毫升L-谷氨酰胺、2.5微升胰岛素和1000微型肝素混合。
      2. 在搅拌盘上搅拌所有成分约20分钟，或直到所有成分溶解为止。增加灌注流量，使压力达到3–5毫米汞柱。
   5. 然后，将RRS激光源放入探针支架，并放置在肝脏最大叶上方1厘米处，尽可能靠近肝脏的PV。在第5分钟（T₅）暂停灌注，10分钟（_T10）恢复。15分钟（T₁₅）进行应力测试。
   6. 在整个应力测试过程中进行RRS测量;每5分钟测量一次进出流量，从T₀开始（见图4）。绘制3RMR值，以及T₀、T₅、T₁₀、T₁₅的出流K⁺水平和乳酸水平（n = 3）（见图5）。
   7. 通过将氧气的进出分压（pO₂）乘以等离子体中氧气的溶解系数（0.00314），计算T₀、T₅、T₁₀、T₁₅处的氧消耗率（OCR）。绘制T₀、T₅、T₁₀、T₁₅的OCR（图5）。
      注：图6显示了一肝在灌注状态（T₅）、缺血状态（T₁₀）和再灌注状态（T₁₅）的典型共振拉曼光谱痕迹（见图6）

图4：展示实验流程的示意图。对雌性刘易斯大鼠进行了全肝切除术。采集的肝脏被置于亚母电台输注，并在最初5分钟内注入含氧灌注液。灌注液通过门静脉流入肝脏，并通过蠕动泵循环（灌注流以蓝色箭头表示）。氧气灌注在T5暂停5分钟，T10再开始5分钟。3RMR测量，贯穿整个应力测试（以激光表示）。在T0、T5、T10和T15处采集了灌注样品。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

新鲜肝脏通过氧应激测试进行缺血和再灌注。随后，在压力测试过程中，3RMR的实时变化与T₀、T₅、T₁₀、T₁₅时通过灌流分析获得的氧气消耗率、乳酸流出和钾进行比较。在健康条件下，3RMR值预计在10%至30%之间（见图5A）。如预期，T₀和_{T 5}的3RMR值落在这个范围内，因为肝脏在这两点之间持续供应含氧灌注液（见图5A）。然而，缺血期结束时的3RMR值（T₁₀）超出了最佳范围（图5A）。这种增加表明线粒体正在向还原态转变，因为电子在输运链中因脱氧而不断积累。在_T10时，含氧流动恢复;再灌注期开始。在再灌注期结束（T₁₅）时，3RMR值恢复至最佳水平（见图5A），ETC活性恢复，重新引入氧气作为最终电子受体。这些氧气流动的变化在原始光谱中也能观察到。T₀和T₁₅的原始RRS光谱具有类似于氧化线粒体的光谱特征（图6A，C），例如在1371 ^cm-1处有光谱标记峰（图6D，F）。同样，T₁₀的原始拉曼光谱（图6B）显示出降低的RR标记，如1357 ^cm-1处的光谱标记峰（图6E）。总之，RRS实时识别线粒体氧化还原状态的变化，这既体现在原始光谱信号中，也作为线粒体健康指标（3RMR）。

RRS还可以根据cIII和cIV的氧化还原态计算3RMR值。cIII和cIV的3RMR值也观察到类似模式（见图5B）。在T₀时，cIV的3RMR完全氧化，cIII的3RMR值处于最佳范围内。这种配合物间的氧化还原平衡是生理的，因为电子从cIII流向cIV以迅速氧化。缺血发作时，观察到每个复合体的RMR水平增加3。在缺血期，电子通过ETC积累增加了cIII和cIV的还原应力，进而增加cIII-3RMR和cIV-3RMR。 然而，重新引入氧气后，两种配合物的3RMR值均回落至最佳水平：完全氧化的cIV和生理还原的cIII（见图5B）。两个复合体的3RMR趋势表明，氧气停止会影响整个ETC，且没有哪个复合体特别容易感染无流缺血。

另一方面，氧合动态的变化并未反映在通过灌注液分析获得的损伤生物标志物和血气分析物中。缺血发作时，乳酸和K⁺ 预计会上升，因为细胞开始依赖有氧呼吸，并缓慢降解以释放细胞间K⁺。我们还预计OCR会下降，因为细胞产生的能量不足以继续细胞呼吸。即使在一段时间内无血流缺血，氧气消耗率也没有显示出损伤迹象。尽管氧合发生变化，出流乳酸和K⁺ 水平在整个压力测试中保持相对稳定（图5D–E）。

图5：氧应激测试中3RMR和损伤生物标志物的变化。 缺血开始和再灌注期分别在第5分钟和第10分钟用虚线表示。此外，含氧流动期用蓝线表示，缺血期用红线表示。（A） 线粒体检测中3RMR值。当含氧流暂停时，3RMR值会增加，重新开始流流时会回落至最佳水平。（B） 3RMR值为III和IV复合体。流动停止会导致两个复合物的减少。（C）应力测试期间的平均流出K⁺ 值。尽管氧合动力学发生变化，K⁺ 值在整个应力测试过程中保持稳定。（D）压力测试期间乳酸流出的平均水平。乳酸产出在整个负荷测试过程中保持稳定。（E）T₀、T₁₀、T₁₅时的氧气消耗率。由于_pO2 值是基于流量的测量，无法计算无流缺血期间的OUR。未观察到显著变化（p值：0.2500）（n = 3）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：新大鼠肝脏在压力测试中样本的原始光谱痕迹。 肝脏在（A）氧化状态、（B）缺血状态和（C）再灌注状态的完整光谱剖面。当放大到线粒体的光谱峰值时，从含氧RR标记到还原RR标记的转变可见，每个光谱谱中都标有一个红色方框。（D–F）氧化后的RR标记峰（1371 ^cm-1）存在于（D）氧化态和（F）再灌注态，并以红色虚线标记。降低的RR标志峰值（1357 ^cm-1）出现在（E）缺血状态，并以蓝色虚线标记。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：还原和氧化复合体III、复合体IV、血红蛋白和肌红蛋白的光谱痕迹。 （A） C复合体III，（B）复合体IV，（C）血红蛋白，（D）肌红蛋白。 回归分析会将收集到的光谱与这些光谱库（如被选中）进行比对，为每个文库谱计算出一个因子，代表其在记录光谱中的相对贡献的最佳拟合估计，从而推算其在组织中的相对浓度。请点击这里下载此文件。

补充图2：利用回归文库分解重叠的含血红素分子（血红蛋白和氧化/还原线粒体）的示例。 （A）选取了肝组织中细胞灌注的原始光谱痕迹，具有所有必要的回归文库，如血红蛋白、氧化血红蛋白、还原线粒体和氧化线粒体。显然，通过库和回归分析推导的最佳拟合线与测量信号完美重叠，几乎没有未解释的残差。（b）来自同一组织的原始光谱痕迹，但仅选取氧化和还原的线粒体文库。由于存在大量未解释的残留结构，可以确定线粒体光谱峰值与未纳入回归分析的血红蛋白峰相差数波数。图示显示，高分辨率光谱仪和对整个光谱的回归分析能够区分密切相关的光谱。请点击这里下载此文件。

补充图3：软件屏幕截图。 （A） 显示测量值的主窗口。测量时，3RMR、StO2及其他选定系列将在此显示。此外，每个系列的信号强度会以虚线显示在图表上，并在屏幕右侧下方显示一个数值。例如，这里捕捉的实线表示组织的3RMR，虚线表示r3RMR（3RMR信号强度）。如果想查看录制光谱的质量，可以点击“ 显示频谱 ”标签（用紫色圈出）。（B）显示组织原始光谱的屏幕。这是通过测量频谱强度与残余噪声来评估信号质量的标签页。（C） 显示实验中序列趋势的制表符。例如，如果在实验过程中多次进行3RMR测量，每个测量值会在这个标签页中显示时间跨度。如果选择其他系列的趋势，也将在这里显示。该标签可通过点击主屏幕上的 趋势 按钮（在 A上用绿色圈出）进入。（D） 信息 标签，可输入实验信息，如会话名称和描述。（E） 系统 标签页，可以上传预加载的协议。例如，选择 LiverContAcell 协议时，该协议将根据大鼠肝脏的无细胞灌注协议设定回归文库、目标回归窗口和 sigma。要导入协议，可以点击 “从文件导入设置 ”并导入感兴趣的协议。如果想创建自己的协议，可以从（F）回 归库 下拉菜单中选择必要的库，调整目标σ和回归窗口，以及警报，然后点击左下角的 保存 （以光盘表示）。（F） 剧 情 标签页，用户可以选择在主窗口显示哪个系列。如果需要重新分析一个频谱，并且想在之前的测量基础上添加更多系列，可以在 Recal 部分下选择感兴趣的系列。在重新校准（Recal）过程中，软件会重新分析测量到的原始光谱，并显示新选定序列的结果。也可以选择从该标签中显示所选系列的信号强度。请点击此处下载此文件。

补充文件1：各质量控制指标的说明。请点击这里下载此文件。

讨论

本研究强调了一种非侵入式、实时且高度灵敏的线粒体健康定量方法，该系统由一台激光组成的紧凑探头中，通过光纤电缆连接到激光泵。该方法使用441纳米激光激发线粒体，线粒体根据其氧化态产生独特的光谱信号。因此，RRS能够通过线粒体的光谱特征来量化其每个状态，并通过回归分析将发射的光谱与预先测量的光谱库进行比较。随后，基于减少粒线体与总粒线体比值创建了线粒体健康指标：减少共振拉曼线粒体比（3RMR）。

本文重点展示3RMR在与原生组织含氧过程中的实时变化，无需样品处理。该测试通过氧气压力测试实现：连续氧气灌注5分钟后，灌注流暂停5分钟，再重新启动5分钟。整个压力测试过程中测量3RMR。通过压力测试模型，我们在缺血期和含氧期之间切换，可以追踪线粒体氧化还原状态的连续变化——进而追踪线粒体功能。换句话说，氧气压力测试使我们能够追踪3RMR随氧合的趋势。我们团队将3RMR值升高归因于缺血状况，扰乱灌流，导致通过ETC的电子积累，_因为氧气 不可作为最终电子受体。电子的积累导致还原态，转化为3RMR值的增加。然而，随着_O2的重新引入，健康的线粒体预计将恢复ETC活性并恢复生理氧化还原状态，因为其结构和功能元素依然完整。

正如预期，本文在缺血期观察到3RMR的实时持续上升（图5A）。同样，3RMR在再灌注期间逐渐恢复至最佳水平（见图5A）。线粒体氧化还原状态的实时变化也在谱图中可见，因为线粒体峰在缺血期内从氧化状态（1371 ^cm-1）转变为还原状态（1357 ^cm-1），并在再灌注结束时恢复为氧化状态（见图6）。其他降低RR标志峰也会出现在缺血期。与传统线粒体健康检测不同，共振拉曼足够灵敏，能够量化复合物III和复合体IV的氧化还原状态，这能够并且已经为缺血再灌注损伤对ETC的具体影响提供了机制性见解。在健康的线粒体中，电子会从复合物I开始，经过ETC中的各种复合物，直到到达_O2作为最终电子受体。氧气流动暂停会使每个配合物进入还原态，因为电子会沿ET循环被滞留。如预期，缺血发作时cIII和cIV的3RMR值实时上升。这表明氧气的_{缺乏影响的是}整个ETC系统，而非特定复合物（图5B）。正如我们将在下文讨论的，RRS的敏感性促进了详细的机制研究，并为IRI靶向疗法的开发提供参考。

传统上，我们也预期缺血器官乳酸水平升高，因为它们依赖无氧代谢产生ATP。同样，受损器官中K⁺水平预期会上升，因为细胞膜完整性被破坏，允许细胞间K⁺的外流。 最后，严重受损的细胞可能代谢率较低，因为其代谢通路受缺血诱发的代谢废物和活性氧影响，导致氧气消耗减少。然而，缺血期内及之后乳酸、K⁺或氧气消耗没有变化。事实上，这些数值并不表示氧气流动是否停止，因为它们在整个应力测试过程中保持相对稳定（图5B–D）。本研究本研究通过氧应激测试表明，3RMR值在缺血再灌注过程中，比传统损伤生物标志物更快地、实时且更敏感地反映了线粒体氧化还原状态的变化（见图5）。我们认识到，本研究比较了3RMR动态与线粒体健康的间接指标，如乳酸和OCR，而非更直接的下游对照指标，如NAD+/NADH和ATP。尽管本研究未明确将3RMR的变化与ATP/NADH浓度相关，但^{先前的研究9,14}已显示3RMR能够预测这些下游生物标志物的变化。例如，Nguyen等^人9证明，3小时温缺血（WI）肝脏3RMR值较低（<10%）的ATP浓度和NAD/NADH比显著低于1小时温缺血肝（3RMR值~15%）。此外，Jain等人在3RMR无显著差异的^组中，NAD+/NADH比值或EC无显著差异。他们还观察到，24小时冷缺血（CI）肝脏在无细胞灌注时的NAD+/NADH比值和EC与细胞灌注有显著差异，后者同样显示出统计学显著的3RMR值。综合来看，这些结果显示了3RMR值，反映了线粒体和ETC功能更直接测量的变化。

尽管本文在15分钟灌注期间利用RRS来展示系统的性能，但其他已发表的研究已证明RRS在纵向研究中的实用性。更具体地说，在之前的研究中，我们证明了RRS在较长器官灌注中补充传统生物标志物，因为它提供了线粒体健康和功能的洞见，这些洞察与传统方法有显著不同。例如，研究利用RRS评估可移植（24小时SCS）和不可移植（72小时SCS）冷缺血大鼠肝脏在亚脑膜灌注期间的可^行性。尽管两组对氧气的初始反应相似，但非移植肝脏的3RMR在灌注下增加，而可移植肝脏的3RMR通过SNMP保持稳定。同样，72小时置信区间肝脏的钾水平和整体体重增加在SNMP中均高于24小时置信区间肝脏。该研究展示了RRS在长期灌注中补充传统生物标志物的实用性。在另一项研究中，我们利用RRS来了解冷缺血（CI）大鼠肝脏的再氧化动力学和代谢恢复¹⁴。我们对轻度缺血（15分钟冷缺血）和24小时冷缺血肝脏进行灌注，使用无细胞或红细胞填充灌注剂（pRBC）。当24小时CI肝脏用无细胞灌注时，观察到3RMR的潜在下降，相较于pRBC灌注时。研究将3RMR延迟上升归因于冷缺血期间线粒体细胞色素上的电子积累，这些电子能迅速转移到基于pRBC的渗出液中丰富的氧分子。然而，结合其他损伤标志物，我们观察到24小时置信区间充血pRBC肝脏的肝损伤更大。研究结论认为，通过RRS实时测量线粒体氧合，可以洞察线粒体恢复情况，有助于优化长期灌注策略。本质上，研究结果表明，将传统生物标志物（如乳酸、OCR、ATP）与RRS驱动的线粒体氧化还原状态和氧合动态洞察相结合，能够更全面地评估线粒体恢复。

其他研究则将RRS作为治疗试验平台，以减轻ETC^的缺血再灌注损伤。在长期缺血中，电子会在ETC内积累，电子有能力通过各种配合物逃逸，尤其是在再灌注过程中。将单个复合物的氧化还原状态作为缺血再灌注的函数，有助于更深入地了解损伤部位，并为更具针对性的干预措施提供潜力。例如，我们团队利用RRS开发了针对热缺血猪肝复杂III功能障碍的治疗干预。Nguyen等人（2026^）进行的一项研究中，1小时和3小时的WI肝脏被置于SNMP中3小时。如前所述，三小时白细胞肝脏已知会受到ETC损伤，导致过度氧化和代谢减退。尽管新鲜肝脏和1小时WI肝脏的3RMR值在整个灌注过程中均处于最佳范围，但我们观察到3小时WI肝脏的3RMR值持续下降，3小时时降至最优范围（10%）以下。此外，我们观察到两组cIV的3RMR值均无差异，且每组cIV均完全氧化。cIII的过氧化，加上cIV中观察到的健康氧化还原状态，表明复合物III存在再灌注诱导的过度氧化。凭借这些知识，Nyugen等人（2026^）9成功选择了一种能够克服cIII功能障碍的治疗方法：亚甲蓝（MB），它作为cI和细胞色素c之间的电子穿梭，绕过cIII，将电子直接转移到cIV。3RMR结果反映了MB对线粒体的治疗效果，3小时WI肝脏SNMP中的3RMR值升高，反映电子直接转运至cIV及肝脏代谢重新启动。MB的缓解效果也得到了验证，通过减少乳酸流出和改善氧气消耗率。本质上，RRS的特异性使得热缺血后线粒体需求的治疗途径得以开发。

本文中，我们将共振拉曼光谱学介绍为一种非侵入性、实时且高度特异性地测量线粒体健康的方法。该研究展示了RRS如何在不扰动组织的情况下测量氧化还原态的细微变化，避免这些生理变化产生下行影响。然而，需要注意共振拉曼系统的若干局限性。首先，RRS要求在回归中识别并考虑所有在组织中共振增强的分子，每个分子都有不同的增强因子以考虑相对信号强度。虽然我们已为所有此类成分在特定波长和组织创建了光谱库，但用户可能需要为每个感兴趣的组织和波长创建并验证新的文库。此外，某些组织可能含有复杂的光谱元素，这使得测量低浓度线粒体细胞色素变得困难。例如，猪肝或人类肝脏含有β-胡萝卜素，血液中含有血红蛋白，这两者都有强烈的光谱信号，增加了RRS在回归中需要考虑的光谱特征数量。最后，用于这些测量的441纳米激光束直径为2毫米，穿透深度小于1毫米。这种局部的表面测量可能促进采样误差，因为器官其他部位的氧化还原状态差异可能被忽视。为克服这些挑战，可以通过器官核心的活检进行测量，或者多激光装置实现更大表面积的测量，从而更全面地了解整个器官的健康状况。

总之，我们表明共振拉曼光谱对线粒体动态的细微变化相比血气分析物更为敏感。这里提供了系统的详细设置和操作说明。我们强调RRS的非侵入性、高度特异性和实时评估特性，并解释其如何作为诊断和机制性方法使用。我们还强调其在开发线粒体功能障碍特定治疗通路方面的应用。未来的研究可能重点是调整RRS系统，以评估线粒体健康，包括活检、精确切割的组织切片或其他组织衍生产物，包括用于转化研究的人体组织。RRS的采用为代谢研究提供了一种强大的方法，使我们比传统方法更容易地加深对细胞生物能量过程的理解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16 G导管	BD Insyte Authoguard	381454	用于门静脉插管
活性炭	Vet Equip Vapor Guard 活性炭	931401	用于麻醉期间过滤多余的蒸汽
BSA	Sigma-Aldrich	A7906	灌流液组成
泡沫陷阱	Radnoti	130149
地塞米松	Sigma-Aldrich	D2915	灌流液组成
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061	灌流液组成
Masterflex L/S 精密泵管（24 G）	Fisher Scientific	13-200-292	用于灌流液流过肝脏
Masterflex 蠕动泵	Cole Parmer, Vernon Hill, IL	7528-30	用于灌流液流过肝脏
膜式氧合器	Radnoti	130144	用于灌流液的氧合。
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4458	灌流液组成
RAPIDPoint 500 血气分析仪	Siemens Healthineers	41115805	用于血气分析
共振拉曼系统	Pendar Technologies	A4D441	关于该产品的询问请联系 Pendar Technologies