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方法文章

人乳腺癌类器官的构建及基于彗星实验的阿霉素诱导DNA损伤定量分析

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DOI：

10.3791/71299

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2026年7月28日

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1College of Life Science, North China University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 3School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 4Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People's Hospital of Suzhou City, 5Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案建立了一种人乳腺癌类器官（BCOs）模型，并利用彗星实验定量评估多柔比星（doxorubicin）诱导的DNA损伤。研究证实了将彗星实验应用于BCOs的可行性，并提供了可重复、可扩展且操作性强的工作流程，用于检测BCOs中DOX诱导的DNA损伤。

摘要

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，具有显著的异质性。阿霉素（DOX）广泛用于乳腺癌治疗，其主要作用机制是诱导DNA双链断裂并触发细胞死亡。本方案中，建立了人源乳腺癌类器官（BCO）模型，用于定量评估阿霉素诱导的DNA损伤。通过机械和酶解离方法从患者来源的肿瘤组织中分离出原代乳腺癌细胞，并将其培养于三维基质中以生成BCO。随后，用8 μM DOX处理类器官2小时，并在处理2小时后评估DNA损伤。处理结束后，将类器官解离为单细胞，包埋于低熔点琼脂糖中，在碱性条件下进行电泳。电泳后，通过荧光显微镜观察DNA迁移模式，呈现为彗星结构，并使用OpenComet软件进行定量分析，以确定尾部DNA百分比（% Tail DNA）。彗星实验成功检测到了BCO中的DNA损伤。与对照组相比，经8 μM DOX处理2小时的BCO在类器官解离和电泳后显示出更长的彗星尾。定量分析显示，处理组的尾部DNA百分比显著升高，表明发生了DNA损伤。该高灵敏度方法可支持阿霉素的毒理学和药效动力学研究，并为评估患者来源BCO系统中的DNA损伤提供了可靠的技术平台。

引言

乳腺癌是一种源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，由遗传改变、激素失调及其他致病因素引起。它是全球女性中最常见的恶性肿瘤，具有独特的流行病学特征和显著的肿瘤内异质性1,2。多柔比星（DOX）是一种一线化疗药物，可插入DNA双链中，抑制拓扑异构酶II活性，诱导DNA链断裂，最终触发肿瘤细胞凋亡3。传统的二维细胞培养系统在模拟乳腺肿瘤复杂的细胞组织结构和异质性方面存在局限。相比之下，乳腺癌类器官（BCOs）是从患者肿瘤组织中获得的三维结构，保留了原始肿瘤的关键特征，包括细胞组成、组织架构和分子表型。值得注意的是，BCO模型与临床药物反应具有高度一致性；对于特定治疗药物，BCO与相应患者之间的负反应一致性可达100%，正反应一致性达98%4。

BCO 作为先进的体外模型，能够重现原发肿瘤的关键结构和功能特征，已被广泛用于研究肿瘤发生、疾病进展以及治疗耐药性5。乳腺癌中的肿瘤起始通常依赖于多个肿瘤抑制基因（如 TP53、PTEN、RB1 和 NF1）的协同失活，因为单个基因的改变不足以驱动正常乳腺上皮的恶性转化。该过程伴随着细胞极性的丧失、组织结构紊乱以及不受控制的增殖6,7,8。

彗星试验（又称单细胞凝胶电泳，SCGE）是一种在单细胞水平上评估DNA损伤的经典方法。该技术最初由Rydberg和Johanson于1978年提出，随后由Ostling和Johanson改进，建立了用于检测DNA双链断裂的中性彗星试验。1988年，Singh及其同事引入了碱性电泳条件，使得该方法能够检测DNA单链断裂、无碱基位点以及碱不稳定损伤，显著拓展了该试验的应用范围9。彗星试验的基本原理是DNA在电场中的迁移能力取决于其完整性。在将细胞包埋于琼脂糖并进行裂解以去除细胞膜和蛋白质后，受损的DNA片段在电泳过程中向阳极迁移，形成“彗尾”，而完整的DNA则保留在加样位置附近，形成“彗头”10。尾长、尾部DNA百分比（% tail DNA）和Olive尾矩等参数可用于对DNA损伤进行半定量或定量评估，而时间序列实验设计则可用于评价DNA修复能力。由于该方法具有高灵敏度、低样本量需求以及操作相对简便等优点，已被广泛应用于遗传毒理学、癌症生物学和药物反应研究中，尤其适用于评估化疗药物和放射治疗所诱导的DNA损伤以及肿瘤细胞的耐药机制。该试验对实验条件和操作流程的变异高度敏感，其可重复性和实验室间的可比性依赖于标准化的操作流程和自动化的图像分析11。近年来，随着高通量成像软件、类器官模型和基因编辑系统的引入，彗星试验在DNA损伤与修复机制研究以及肿瘤治疗反应评估中的应用价值进一步提升。

与传统的DNA损伤检测方法（如γ-H2AX免疫荧光染色或流式细胞术）相比，彗星实验（comet assay）能够直接在单细胞水平上定量检测物理性DNA链断裂。由于该方法不依赖于特定蛋白的表达或抗体的特异性，因此可有效避免因细胞周期状态差异或DNA损伤应答通路异常而导致的假阴性结果12。此外，与传统的二维单层细胞培养相比，本研究采用的三维类器官模型能更真实地模拟体内肿瘤复杂的空间结构、细胞外基质相互作用以及药物渗透梯度。传统细胞系模型常因药物人为过度暴露而高估遗传毒性，而类器官平台则可在更接近临床生理条件的微环境中评估多柔比星（DOX）诱导的DNA损伤，从而显著提高该筛选范式的可靠性和转化价值13。

尽管本研究建立的类器官整合彗星实验在评估DNA损伤方面具有显著优势，但其实际应用仍需仔细考虑与样本输入相关的若干技术局限性和适用参数。该方案需要对类器官进行彻底而温和的酶解离，以获得高活力的单细胞悬液。每100 µL基底膜基质中接种15,000–20,000个原代乳腺癌细胞（约200个细胞/1 µL）的密度，可在维持细胞间旁分泌信号传导以支持球体有效形成的同时，避免因密度过高和营养快速耗竭导致的中心坏死。在治疗窗口方面，该实验需谨慎校准阿霉素（DOX）的浓度和暴露时间，以防止细胞死亡过度（>20–30%）。超致死剂量的药物暴露会产生大量“刺猬状”彗星，掩盖真实的DNA损伤信号，干扰数据分析。就实验本身的局限性而言，标准碱性彗星实验本身通量较低，难以适用于高通量药物筛选。此外，该技术要求对实验操作进行严格标准化，包括凝胶附着稳定性、碱性解旋时间以及电泳均一性等，因为即使微小的操作偏差也可能引入显著的系统性误差。

综上所述，本方案建立了人源脑类器官（BCOs），并证明了采用彗星实验检测多柔比星（DOX）诱导的DNA损伤的可行性。在对完全建立的BCOs使用8 µM DOX处理后，通过彗星实验评估了DNA损伤。该方法可实现对DOX诱导的DNA损伤进行稳定且直接的评估。

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方案

本研究经苏州吴中人民医院伦理委员会批准（批准号：20251w03），并依照医学伦理标准进行。本研究中所有受试者均签署了书面知情同意书。

1. 人脑类器官的构建

  1. 乳腺癌组织的运输与保存
    1. 将新切除的人类乳腺癌组织立即放入预冷的组织保存液中（4 °C）。
      注意：确保组织在运输过程中完全浸没。
  2. 乳腺癌组织的机械解离
    1. 所有操作均在生物安全柜中进行。将乳腺癌组织置于6 cm培养皿中，使用无菌手术刀和镊子去除可见的脂肪组织。
    2. 向6 cm培养皿中加入3 mL PBS，并洗涤组织三次。
    3. 吸除并弃去磷酸盐缓冲液（PBS）。
    4. 重复步骤1.2.2和1.2.3两次。
    5. 使用无菌手术剪将乳腺癌组织转移至1.5 mL微量离心管中，并将其剪切成约2 × 5 mm大小的小片段。
  3. 乳腺癌组织的酶消化
    1. 向1.5 mL微量离心管中加入1 mL类器官解离液，然后将悬液转移至15 mL离心管中。
    2. 向15 mL离心管中再加入8 mL类器官解离液。
    3. 将15 mL离心管在37 °C下孵育40分钟。
    4. 消化期间每10分钟在摇床上振荡管子1分钟。
    5. 40分钟后，向15 mL离心管中加入6 mL PBS以终止消化。
      ​注意：直接将PBS加入消化混合物中以停止酶活性。
  4. 原代乳腺肿瘤细胞的分离及类器官包埋
    1. 将100 µm细胞筛置于50 mL离心管上。
    2. 向细胞筛上加入1 mL完全细胞培养基。
      注意：使用500 mL基础培养基、50 mL胎牛血清和5 mL青霉素-链霉素配制完全细胞培养基。
    3. 从15 mL离心管中吸取1 mL消化后的组织悬液，加至细胞筛上。
    4. 重复步骤1.4.3，直至全部悬液通过细胞筛。
    5. 用额外的1 mL完全细胞培养基冲洗细胞筛。
    6. 将50 mL离心管在4 °C下以350 × g离心3分钟。
    7. 吸除并弃去上清液。
    8. 将细胞沉淀重悬于1 mL完全细胞培养基中，并转移至1.5 mL微量离心管中。
    9. 将悬液在4 °C下以370 × g离心5分钟。
    10. 吸除并弃去上清液。
    11. 向1.5 mL微量离心管中加入100 µL基底膜基质，并充分混匀。
      注意：维持每100 µL基底膜基质中接种15,000–20,000个原代乳腺癌细胞的密度（200个细胞/1 µL）。这有助于维持细胞间的旁分泌信号传导，促进球体良好形成，并防止中心坏死。
    12. 将25 µL基底膜基质-细胞混合物分装至24孔板的每个孔中。
    13. 将24孔板倒置，在37 °C下孵育10分钟，以促进基底膜基质聚合。
    14. 向24孔板的每孔中加入500 µL BCO培养基。
      注意：使用市售即用型、具有专有配方的培养基培养BCO。
    15. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中孵育。
      注意：在细胞外基质中接种后，BCO培养7–10天以实现适当的三维结构发育。当类器官呈现致密、球形的三维形态，平均直径达到约50–100 µm且无中心坏死迹象时，视为已完全建立，可进行药物处理。一旦达到上述终点标准，即对BCO进行DOX处理。

2. 利用彗星实验检测DOX诱导的BCO中DNA损伤

实验方案改编自既定指南，并进一步优化以适应特定的实验室条件14。

警告：所有多柔比星（DOX）操作步骤——包括干粉称量、储备液配制以及工作液的系列稀释——必须仅在经认证的II级生物安全柜或化学通风橱内进行。严禁在开放的实验台面上进行任何操作。操作过程中需佩戴双层腈手套，并全程避光保护药物。最后，所有被DOX污染的一次性耗材（如移液器吸头和微量离心管）必须严格作为“细胞毒性废弃物”单独分类，交由专业机构处置；切勿将其与常规生物危害废弃物混合。

  1. BCO的DOX处理
    1. 吸弃旧的培养基。
    2. 向每个孔中加入 500 µL 新鲜的 BCOs 培养基
    3. 从每个孔中移除并弃去 4 µL 培养基
    4. 向每个孔中加入 4 µL 的 1 mM DOX 储存液。
      注意：为达到 8 µM 的终工作浓度，使用标准稀释公式计算所需的储备液体积：C1V1 = C2V2. 其中 C1 表示初始阿霉素储备液浓度（1 mM），C2 为目标浓度（8 µM），且 V2 为最终孔体积（500 µL）。求解 V1 得到4 µL。因此，该方案要求向每孔剩余的496 µL培养基中加入4 µL的1 mM DOX储备液，然后充分混匀以确保均匀分布。
    5. 将培养板置于37°C、5% CO₂培养箱中孵育2小时。
  2. BCO的解离
    1. 吸出并弃去24孔板中的BCO培养基。
    2. 向每个孔中加入 500 µL 类器官解离溶液。
    3. 反复吹打以彻底破坏基底膜基质和类器官结构。
    4. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育平板10分钟。
    5. 从每个孔中转移500 µL上述悬浮液至15 mL离心管中。
    6. 在 4 °C 条件下，以 350 × g 离心 3 分钟。
    7. 吸出并弃去上清液。
    8. 向15 mL离心管中加入1 mL完全培养基以重悬细胞沉淀，随后将所得悬液转移至1.5 mL微量离心管中。
    9. 在 4 °C 条件下，以 350 × g 离心 3 分钟。
    10. 吸出并弃去上清液。
      注意：离心后，类器官沉淀仍留在离心管中。
  3. 细胞重悬与琼脂糖包埋
    1. 将金属加热块预热至 95 °C。
    2. 将1 mL低熔点琼脂糖放入金属加热块中，孵育10分钟，以确保完全融化。
    3. 将100 µL熔融的0.5%低熔点琼脂糖加入含有BCOs的1.5 mL微量离心管中。
    4. 立即将样品转移至37 °C水浴中，并平衡10分钟。
    5. 充分混匀后，立即用移液器吸取50 µL细胞–琼脂糖悬液至显微镜载玻片上。
  4. 细胞裂解与DNA解旋
    1. 将载玻片浸入预冷的裂解液中，于4 °C避光孵育12 h。
    2. 将载玻片从裂解液中取出，立即浸入碱性解旋液中。
      注意：配制碱性解旋溶液时，将0.6 g NaOH溶解于4.975 mL超纯水中，然后加入250 µL 200 mM EDTA。配制碱性电泳缓冲液时，将12 g NaOH溶解于995 mL超纯水中，然后加入5 mL 200 mM EDTA。
      ​警告：彗星实验缓冲液中的 NaOH 是一种强腐蚀性的强碱，可导致严重的皮肤和眼部灼伤。配制溶液时，应将固体 NaOH 颗粒缓慢、分批加入水中，并持续磁力搅拌。切勿将水直接倒入干燥颗粒中，因为剧烈的放热反应可能导致腐蚀性液体沸腾并飞溅。此外，所有干粉称量操作必须在化学通风橱内进行，以避免吸入腐蚀性粉尘。
    3. 将载玻片浸入裂解液中，于4 °C避光孵育1小时。
  5. 电泳
    1. 将载玻片从碱性解旋液转移至电泳槽中。
    2. 向电泳槽中加入1 L碱性电泳缓冲液，确保载玻片完全浸没。
    3. 以25 V、300 mA电泳30分钟。
  6. 载玻片清洗与固定
    1. 将载玻片浸入5 mL 70%乙醇中，室温孵育5分钟。
      注意：乙醇具有高度易燃性。在进行大体积样品制备或组织脱水操作时，实验环境应保持良好通风。操作区域必须严格远离所有点火源，包括明火（如酒精灯）和静电火花。使用后应立即密封试剂容器，并将其存放于专用的防爆易燃品储存柜中。
    2. 将载玻片置于37 °C培养箱中，干燥15 min。
  7. DNA染色与成像
    1. 向10 mL超纯水中加入1 µL核酸荧光染料。
      警告：请将这些核酸嵌入性染料视为潜在的致突变剂，并严格采取预防措施进行操作。为防止常规工作区域发生交叉污染，应设立专用的“核酸染色区”，并配备专用移液器。若需向熔融琼脂糖中添加染料，应先将凝胶冷却至约 60 °C 后再加入，以避免吸入含有染料的有害蒸气。最后，所有使用过的染色液及废弃凝胶必须严格丢弃至指定的核酸危害废物容器中。
    2. 将载玻片浸入步骤2.7.1中配制的染色液中，于室温避光孵育30分钟。
    3. 用5 mL超纯水进行一次5分钟的洗涤。
    4. 在37 °C培养箱中将载玻片干燥15分钟。
    5. 使用配备绿色激发滤光片的荧光显微镜观察彗星结构，并检测红色荧光。

3. 数据处理

  1. 使用 Fiji（官方发行版）中的 OpenComet 插件对彗星实验图像进行自动定量分析，以获得与 DNA 损伤相关的参数。
    ​注意：在统计分析中，本研究仅严格纳入具有高分辨率、成像清晰、形态完整且无重叠的彗星图像。相反，筛选流程排除了“刺猬状”或“鬼影状”彗星（其头部减小且尾部广泛，提示严重的细胞凋亡或坏死），以及边缘模糊、细胞聚集或存在背景伪影的图像。
    1. 打开 Fiji 软件（补充图 1A）。
    2. 点击菜单栏中的 Plugins（插件）（补充图 1A）。
    3. 选择 OpenComet（补充图 1B）。
    4. 点击 Input files（输入文件）下方的 Browse（浏览），并选择用于分析的彗星实验图像（补充图 1C）。
    5. 点击 Output directory（输出目录）下方的 Browse（浏览），并定义输出文件的保存文件夹（补充图 1C）。
    6. 点击 Run（运行）以启动自动分析（补充图 1C）。此步骤标志着数据处理与分析流程的结束。
      注意：对于每个实验组，本研究从至少 50 个随机选择的细胞中量化了尾部 DNA 百分比（%Tail DNA）。后续统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）比较各组均值，以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。

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结果

脑类器官的建立

本研究成功地从原发性肿瘤组织标本中建立了乳腺癌类器官。在培养的初期阶段，可明显观察到大量单个细胞或小的细胞簇，细胞分布相对分散，缺乏明显的三维球状结构。部分细胞呈现圆形或近似圆形的形态，表明肿瘤来源的细胞已存活并适应了细胞外基质环境，但尚未形成稳定的类器官结构（图1A–C）。

在24天的培养期间，脑类器官内出现了细胞密度增加的区域，表明存在不同的细胞生长状态图1D).

通过组织病理学和免疫组织化学评估，确定了亲本原发肿瘤的基础特征，该肿瘤表现出复杂的形态结构和特定的分子亚型。利用这一特征明确的临床标本，我们成功建立了一种三维类器官模型，可作为下游应用的临床相关研究平台（图1E、F...

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讨论

彗星试验法代表了遗传毒性评估方法的重要进步。由于该技术具有单细胞分辨率，并能基于电泳迁移直接观察DNA损伤模式，因此相较于传统的遗传毒性检测方法具有明显优势15。

实验过程中有几个关键步骤会影响结果的可重复性和数据分析。首先，裂解条件和裂解时间必须保持一致，以尽量减少批次间的变异性。处理原代乳腺癌细胞时，研究人员应避免将其暴露于光线下，以防造成额外的DNA损伤。琼脂糖凝胶必须完全覆盖载玻片区域并保持水平，以防止凝胶脱落。低熔点琼脂糖应在冰上操作，避免提前凝固。类器官的大小以及细胞解离效率的差异可能影响电泳迁移和信号解读，因此在样品制备过程中需严格控制。

尽管彗星试验具有高灵敏度和操作简便的优点，但仍存在若干局限性。该试验的通量受限于载玻片数量，限制了其在大规模筛查应用中的适用性。彗星试验主要检测DNA链断裂，而无法有效识别碱基修饰或大体积DNA加合物。研究人员应将碱性或酶修饰的彗星试验条件与互补方法（如Western blotting、γ-H2AX检测或基于液相色谱-质谱联用的分...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由江苏省肿瘤分子靶向治疗与伴随诊断工程研究中心项目（SGK2202319）、江苏省高校科学技术创新研究团队项目（2021）、江苏省高职院校工程技术研究开发中心项目（2023）、中国江苏省高等教育机构自然科学重点基金（项目编号：24KJA310008）、苏州卫生职业技术学院重点项目（szwzy202406）、苏州大学放射医学与防护国家重点实验室项目（编号：GZK1202506）以及东吴卫生人才计划（DWWS2024002、DWWS2025009、DWWS2025013）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 μm 细胞筛BIOLOGIX15-1100
15 mL 离心管BIOFIL无15 mL 离心管
1 mL 移液器吸头浙江百迪生物科技有限公司H808633
200 μL 移液器吸头浙江百迪生物科技有限公司H808214
24 孔板康宁公司3524
50 mL 离心管BIOFIL无50 mL 离心管
乳腺癌类器官培养试剂盒 Plus摩亘尔生物科技 MA-0807T011LPBCO 培养基
彗星电泳载玻片R&D SYSTEMS4250-050-03
干式恒温器杭州瑞易科技贸易有限公司DH100-2加热块
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基gibcoC11995500BT完全细胞培养基
EDTATREVIGEN4250-050-04
电热恒温水浴锅上海慕朗仪器制造有限公司MSY-24水浴锅
电泳仪BIO-RAD1645052
胎牛血清EallBio03.U16001DC
荧光显微镜WEIDAIM-300LD4
镊子碧云天FS019
GelRed碧云天D0140
GraphPad Prism 8.0GraphPad Software统计分析软件
ImageJ美国国立卫生研究院（NIH）1.54p图像处理软件 / 图像分析
LMA 琼脂糖R&D SYSTEMS4250-050-02低熔点琼脂糖 
低温高速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司KDC-40离心机
裂解液TREVIGEN4250-050-01裂解溶液
Matrigel摩亘尔生物科技82755基底膜基质
NaOH大茂1588
OpenComet 软件开源 ImageJ 插件，新加坡国立大学，新加坡v1.3.1
类器官解离溶液摩亘尔生物科技MB-0818L01L
青霉素–链霉素碧云天CO22
磷酸盐缓冲液（1x PBS）富道生物技术有限公司FD7032PBS
移液器RaininPipet-Lite XLS
剪刀碧云天FS001
组织消化液摩亘尔生物科技MB-0818L06L/MB-0818L06S类器官解离溶液

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