人乳腺癌类器官的构建及基于彗星实验的阿霉素诱导DNA损伤定量分析

摘要

本方案建立了一种人乳腺癌类器官（BCOs）模型，并利用彗星实验定量评估多柔比星（doxorubicin）诱导的DNA损伤。研究证实了将彗星实验应用于BCOs的可行性，并提供了可重复、可扩展且操作性强的工作流程，用于检测BCOs中DOX诱导的DNA损伤。

摘要

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，具有显著的异质性。阿霉素（DOX）广泛用于乳腺癌治疗，其主要作用机制是诱导DNA双链断裂并触发细胞死亡。本方案中，建立了人源乳腺癌类器官（BCO）模型，用于定量评估阿霉素诱导的DNA损伤。通过机械和酶解离方法从患者来源的肿瘤组织中分离出原代乳腺癌细胞，并将其培养于三维基质中以生成BCO。随后，用8 μM DOX处理类器官2小时，并在处理2小时后评估DNA损伤。处理结束后，将类器官解离为单细胞，包埋于低熔点琼脂糖中，在碱性条件下进行电泳。电泳后，通过荧光显微镜观察DNA迁移模式，呈现为彗星结构，并使用OpenComet软件进行定量分析，以确定尾部DNA百分比（% Tail DNA）。彗星实验成功检测到了BCO中的DNA损伤。与对照组相比，经8 μM DOX处理2小时的BCO在类器官解离和电泳后显示出更长的彗星尾。定量分析显示，处理组的尾部DNA百分比显著升高，表明发生了DNA损伤。该高灵敏度方法可支持阿霉素的毒理学和药效动力学研究，并为评估患者来源BCO系统中的DNA损伤提供了可靠的技术平台。

引言

乳腺癌是一种源于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，由遗传改变、激素失调及其他致病因素引起。它是全球女性中最常见的恶性肿瘤，具有独特的流行病学特征和显著的肿瘤内异质性^1,2。多柔比星（DOX）是一种一线化疗药物，可插入DNA双链中，抑制拓扑异构酶II活性，诱导DNA链断裂，最终触发肿瘤细胞凋亡³。传统的二维细胞培养系统在模拟乳腺肿瘤复杂的细胞组织结构和异质性方面存在局限。相比之下，乳腺癌类器官（BCOs）是从患者肿瘤组织中获得的三维结构，保留了原始肿瘤的关键特征，包括细胞组成、组织架构和分子表型。值得注意的是，BCO模型与临床药物反应具有高度一致性；对于特定治疗药物，BCO与相应患者之间的负反应一致性可达100%，正反应一致性达98%⁴。

BCO 作为先进的体外模型，能够重现原发肿瘤的关键结构和功能特征，已被广泛用于研究肿瘤发生、疾病进展以及治疗耐药性⁵。乳腺癌中的肿瘤起始通常依赖于多个肿瘤抑制基因（如 TP53、PTEN、RB1 和 NF1）的协同失活，因为单个基因的改变不足以驱动正常乳腺上皮的恶性转化。该过程伴随着细胞极性的丧失、组织结构紊乱以及不受控制的增殖^6,

方案

本研究经苏州吴中人民医院伦理委员会批准（批准号：20251w03），并依照医学伦理标准进行。本研究中所有受试者均签署了书面知情同意书。

1. 人脑类器官的构建

1. 乳腺癌组织的运输与保存
   1. 将新切除的人类乳腺癌组织立即放入预冷的组织保存液中（4 °C）。
      注意：确保组织在运输过程中完全浸没。
2. 乳腺癌组织的机械解离
   1. 所有操作均在生物安全柜中进行。将乳腺癌组织置于6 cm培养皿中，使用无菌手术刀和镊子去除可见的脂肪组织。
   2. 向6 cm培养皿中加入3 mL PBS，并洗涤组织三次。
   3. 吸除并弃去磷酸盐缓冲液（PBS）。
   4. 重复步骤1.2.2和1.2.3两次。
   5. 使用无菌手术剪将乳腺癌组织转移至1.5 mL微量离心管中，并将其剪切成约2 × 5 mm大小的小片段。
3. 乳腺癌组织的酶消化
   1. 向1.5 mL微量离心管中加入1 mL类器官解离液，然后将悬液转移至15 mL离心管中。
   2. 向15 mL离心管中再加入8 mL类器官解离液。
   3. 将15 mL离心管在37 °C下孵育40分钟。
   4. 消化期间每10分钟在摇床上振荡管子1分钟....

结果

脑类器官的建立

本研究成功地从原发性肿瘤组织标本中建立了乳腺癌类器官。在培养的初期阶段，可明显观察到大量单个细胞或小的细胞簇，细胞分布相对分散，缺乏明显的三维球状结构。部分细胞呈现圆形或近似圆形的形态，表明肿瘤来源的细胞已存活并适应了细胞外基质环境，但尚未形成稳定的类器官结构（图1A–C）。

在24天的培养期间，脑类器官内出现了细胞密度增加的区域，表明存在不同的细胞生长状态图1D).

通过组织病理学和免疫组织化学评估，确定了亲本原发肿瘤的基础特征，该肿瘤表现出复杂的形态结构和特定的分子亚型。利用这一特征明确的临床标本，我们成功建立了一种三维类器官模型，可作为下游应用的临床相关研究平台（图1E、F.......

讨论

彗星试验法代表了遗传毒性评估方法的重要进步。由于该技术具有单细胞分辨率，并能基于电泳迁移直接观察DNA损伤模式，因此相较于传统的遗传毒性检测方法具有明显优势¹⁵。

实验过程中有几个关键步骤会影响结果的可重复性和数据分析。首先，裂解条件和裂解时间必须保持一致，以尽量减少批次间的变异性。处理原代乳腺癌细胞时，研究人员应避免将其暴露于光线下，以防造成额外的DNA损伤。琼脂糖凝胶必须完全覆盖载玻片区域并保持水平，以防止凝胶脱落。低熔点琼脂糖应在冰上操作，避免提前凝固。类器官的大小以及细胞解离效率的差异可能影响电泳迁移和信号解读，因此在样品制备过程中需严格控制。

尽管彗星试验具有高灵敏度和操作简便的优点，但仍存在若干局限性。该试验的通量受限于载玻片数量，限制了其在大规模筛查应用中的适用性。彗星试验主要检测DNA链断裂，而无法有效识别碱基修饰或大体积DNA加合物。研究人员应将碱性或酶修饰的彗星试验条件与互补方法（如Western blotting、γ-H2AX检测或基于液相色谱-质谱联用的分.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 μm 细胞筛	BIOLOGIX	15-1100
15 mL 离心管	BIOFIL	无	15 mL 离心管
1 mL 移液器吸头	浙江百迪生物科技有限公司	H808633
200 μL 移液器吸头	浙江百迪生物科技有限公司	H808214
24 孔板	康宁公司	3524
50 mL 离心管	BIOFIL	无	50 mL 离心管
乳腺癌类器官培养试剂盒 Plus	摩亘尔生物科技	MA-0807T011LP	BCO 培养基
彗星电泳载玻片	R&D SYSTEMS	4250-050-03
干式恒温器	杭州瑞易科技贸易有限公司	DH100-2	加热块
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基	gibco	C11995500BT	完全细胞培养基
EDTA	TREVIGEN	4250-050-04
电热恒温水浴锅	上海慕朗仪器制造有限公司	MSY-24	水浴锅
电泳仪	BIO-RAD	1645052
胎牛血清	EallBio	03.U16001DC
荧光显微镜	WEIDA	IM-300LD4
镊子	碧云天	FS019
GelRed	碧云天	D0140
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		统计分析软件
ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）	1.54p	图像处理软件 / 图像分析
LMA 琼脂糖	R&D SYSTEMS	4250-050-02	低熔点琼脂糖
低温高速离心机	安徽中科中佳科学仪器有限公司	KDC-40	离心机
裂解液	TREVIGEN	4250-050-01	裂解溶液
Matrigel	摩亘尔生物科技	82755	基底膜基质
NaOH	大茂	1588
OpenComet 软件	开源 ImageJ 插件，新加坡国立大学，新加坡	v1.3.1
类器官解离溶液	摩亘尔生物科技	MB-0818L01L
青霉素–链霉素	碧云天	CO22
磷酸盐缓冲液（1x PBS）	富道生物技术有限公司	FD7032	PBS
移液器	Rainin	Pipet-Lite XLS
剪刀	碧云天	FS001
组织消化液	摩亘尔生物科技	MB-0818L06L/MB-0818L06S	类器官解离溶液