本文描述了一种大鼠皮肤伤口模型，可在组织修复的不同阶段，在生理或病理条件下评估各种治疗剂的效果。此外，还详细介绍了通过手动平面测量法监测组织修复过程中伤口收缩率的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
皮肤伤口愈合是一个复杂的生物学过程，涉及炎症、增殖和重塑等协调的阶段。为了更好地理解伤口愈合的潜在机制，切除性动物伤口模型被广泛用于加深对该过程的认识，并促进新型治疗策略的开发。在这些模型中，常采用打孔活检法诱导皮肤伤口，因其可产生标准化的损伤。然而，该技术将损伤限制为圆形，可能不适用于某些实验目的。在此背景下，本文介绍了一种简单且可重复的外科手术方案，用于在大鼠 flank 部位建立标准化的方形全层皮肤切除伤口模型。该方法能够创建不同大小和几何形状的损伤，为各项研究的具体目标提供更大的实验灵活性，并可在生理或病理条件下监测愈合过程。此外，还描述了一种通过手动平面测量法监测伤口收缩率的方法。尽管该方案的实施需要注重细节和技术熟练度，但并不要求高超的外科技能。
引言
皮肤伤口愈合是一个复杂且高度协调的生物学过程，包含多个有序事件，旨在恢复组织完整性。该过程经历一系列明确但相互重叠的阶段，包括止血与炎症期、增殖期以及重塑期1。炎症期在伤口形成后数分钟内开始，于受伤后24至48小时达到高峰，涉及免疫细胞的募集及炎症介质的释放。增殖期以再上皮化和肉芽组织形成为特征，通常在受伤后4至5天启动，可持续数周。最后，伤口进入重塑期，该阶段始于受伤后第三周，可持续数月甚至数年，其特征为组织的重新排列与重构2。当愈合过程无法正常进行时，可能形成慢性伤口，给患者及医疗系统带来沉重负担3，凸显了开发新型治疗策略的迫切需求。
通过手术切除动物全层皮肤（表皮、真皮和皮下组织）形成切除性伤口，可对炎症、肉芽组织形成、再上皮化、血管生成及组织重塑过程进行研究4。近几十年来，伤口愈合模型的广泛应用推动了多项发现，拓展了人们对促进该过程的分子与细胞事件的认识5。体内模型仍是研究人类伤口修复最具预测性的工具，因其包含多种细胞类型、环境信号及旁分泌相互作用，能更真实地再现完整的愈合微环境6。在此背景下，大鼠和小鼠因易于操作和饲养而被广泛使用4。
在这些模型中，通常采用打孔活检来诱导手术伤口，因为该方法可提供标准化的切除。因此，文献中描述的大多数实验模型均基于圆形病损的建立7—12。尽管该方法已被广泛接受，但采用其他几何形状可丰富伤口愈合研究中的方法学手段。在此方面，使用手术刀制造伤口能够产生不同大小、特定形状的病损，突破打孔活检所采用的标准圆形模式13,14,15,16,17,18。此外，动物模型中的比较研究表明，与其他技术相比，手术刀切口造成的初始组织损伤更小19。
本方案描述了一种在大鼠侧 flank 部位采用方形病损模型诱导全层皮肤缺损伤口的替代性外科手术方法。该方法有助于病损面积的标准化以及组织修复过程的监测。此外，该方法适用于旨在评估不同治疗策略和生物材料在生理或病理条件下对皮肤愈合各个阶段影响的研究。
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方案
所有实验操作均经圣克鲁斯州立大学（UESC）动物使用伦理委员会（CEUA）批准。实验所用Wistar大鼠（Rattus norvegicus）来自UESC的动物繁殖、饲养与实验实验室（LaBIO）/动物饲养设施，遵循CEUA/UESC第010/25号协议。所有动物操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行，并符合机构规定的动物福利与伦理使用准则。实验方案的整体设计见图1，本方案中所用材料与设备详见作为补充材料提供的材料表。
图 1： 大鼠模型中皮肤伤口诱导方案的实验设计。 （A）动物镇静后，剃除实验区域毛发；（B）在异氟烷麻醉舱中实施麻醉，待反射消失后，通过面罩维持适当的麻醉深度；（C）对剃毛区域进行消毒，使用卡尺标定病损范围，并用无菌手术刀制造外科伤口；（D）用透明薄膜敷料保护创面，并利用粘性衬纸进行手动平面测量；（E）术后每12小时给予盐酸曲马多镇痛，持续3天；（F）在伤口诱导后24小时施加实验性治疗；（G）在预先设定的实验时间点实施安乐死，并进行样本采集和平面测量描记，以供后续分析。本图由作者使用 BioRender 制作。Galvão, M. (2026) https://BioRender.com/jsiygmf。已附出版许可。 请点击此处查看此图的放大版本。
1. 动物与处理
- 使用2至3个月大的成年雄性Wistar大鼠。
- 手术前一天，确保动物笼具清洁并已消毒，并根据实验分组进行标记。
- 手术当天，使用电子天平称量每只动物的体重并记录数值。
- 将动物随机分配至先前已消毒并标记好的笼具中，遵守饲养容量规定，以保障动物福利条件。
- 使用细头永久性记号笔，在每只动物的尾部根据其所属实验组别及编号进行标识，确保整个实验过程中可追溯。
注意： 根据机构动物饲养设施的动物供应情况及研究的具体目标，本方案也可使用雌性动物。建议采用字母数字编号法对动物进行标识，其中字母代表实验组，数字代表个体动物。例如，A1表示A组第1号动物。
2. 术前操作
- 镇静
- 预先准备：棉球、70%乙醇、每只动物一个1 mL皮下注射器及针头、硫酸吗啡（10 mg/mL），并准备好CO₂麻醉室。
- 使用70%乙醇和棉球对动物腹部区域进行消毒。作为术前麻醉用药，在腹部右下象限以5 mg/kg（10 mg/mL）的剂量经腹腔注射给予硫酸吗啡。
- 给予术前麻醉药物10分钟后，将动物放入CO₂麻醉室。
警告：硫酸吗啡、针头、CO₂暴露系统和70%乙醇必须由经过培训的人员使用适当的个人防护装备（PPE）操作，包括手套、实验服和护目镜。针头和注射器必须丢弃在经批准的锐器容器中，化学和生物废弃物必须按照机构的生物安全和危险废物管理规定处理。
注意：在10分钟等待期间，应在CO₂麻醉室内完成麻醉操作，并准备手术区域。
- 麻醉程序
- 预先准备：异氟烷吸入麻醉剂4 V%（体积百分比）、CO₂麻醉室和1个加热毯。
- 在CO₂麻醉室内以4 V%浓度的异氟烷诱导麻醉。
- 动物反射消失后，将其从CO₂麻醉室转移至面罩。
- 以2 V%异氟烷或维持适当外科麻醉深度所需的浓度维持动物麻醉状态，新鲜气体流速为50 mL/min。
- 在整个操作过程中，使用加热毯维持动物体温。
注意：当动物无反射反应（包括对趾间机械刺激无回缩反应）、呼吸规律且整个过程中无自主体动时，视为达到适当的外科麻醉深度。
警告：异氟烷为挥发性麻醉剂，存在吸入暴露风险，因此强烈建议使用具备充分排气通风的麻醉系统进行给药。此外，操作人员必须穿戴个人防护装备，包括防护服、手套、口罩和帽子。必须在整个过程中持续监测麻醉深度和体温。残留麻醉材料和受污染的一次性物品必须按照机构的化学和生物废弃物管理规定处理。
- 伤口部位准备
- 预先准备：纱布块、不锈钢刀片、70%乙醇以及10%聚维酮碘或0.2%水性氯己定。
- 使用纱布块和肥皂清洁动物左侧 flank 区域。
- 在手术台上将动物置于右侧卧位。
- 使用不锈钢刀片或电动剃须刀剃除左侧 flank 的毛发。
- 使用纱布块和70%乙醇对剃毛区域进行术前消毒（三次），随后使用纱布块和10%聚维酮碘或0.2%水性氯己定再消毒三次。
警告：锐器应小心操作，使用后应放入合适的硬质容器中。此外，所述化学品应使用推荐的个人防护装备操作，并避免接触眼睛和黏膜。使用过的刀片必须丢弃在经批准的锐器容器中，受污染的纱布、消毒剂残留物和生物材料必须按照机构的生物安全和危险废物管理规定处理。
3. 皮肤伤口诱导
- 提前准备：1 把游标卡尺、1 支细头永久性记号笔、纱布和无菌外科器械（23 号手术刀片、梅奥剪刀和解剖镊）
- 使用游标卡尺和永久性记号笔，在皮肤上标记四个等距点，勾画出一个 1 × 1 cm 的正方形区域。
- 使用无菌 23 号手术刀片、梅奥剪刀和无菌解剖镊，完全切除标记区域内皮肤，形成手术伤口，暴露皮下组织及下方肌肉层。
- 使用无菌纱布对伤口部位进行压迫止血，轻柔施加压力直至出血停止。
注意：血液和组织必须视为可能具有感染性的生物废弃物。操作结束后，应按照机构生物安全标准进行妥善处置。
备注： 在整个创口诱导过程中，必须严格执行适当的无菌技术。工作人员必须佩戴个人防护装备（PPE），包括发帽、手套、口罩和实验服，并使用无菌外科器械。
4. 伤口面积的手动平面测量法
- 提前准备：透明薄膜敷料、白色纸张（8.5 × 11 英寸）、细头永久性记号笔和透明胶带。
- 裁剪尺寸为 5 × 3.5 cm 的透明薄膜敷料，并完全覆盖伤口。
- 在白色纸张上标注组别（例如，A组）、动物编号（例如，A1、A2、A3、A4）以及伤口描记采集日期。将伤口诱导当天获得的描记记为 D0，将相应安乐死日采集的描记记为 DX（例如，D3、D7、D14、D21）。
- 使用透明薄膜敷料记录伤口面积，并将其转移至打印纸。具体操作为：将薄膜敷料置于伤口上方，用细头永久性记号笔沿伤口边缘手动描记整个伤口轮廓。
- 使用透明胶带将获得的描记图按对应的标识信息（组别/动物编号/日期）粘贴到打印纸上。这些描记图将用于监测伤口面积，并确定整个实验过程中的伤口收缩率。
注意：建议使用敷料以防止动物之间打斗、过度舔舐受伤区域以及同类相食行为，这些行为可能加重伤口或干扰愈合过程。D0 对应伤口诱导当天（基线）。透明薄膜敷料在使用前立即从原包装中取出，并直接放置于伤口上以获取描记图。根据机构规程和实验要求，也可使用无菌薄膜敷料。时间点 D3、D7、D14 和 D21 分别表示伤口诱导后的第 3、7、14 和 21 天，在这些时间点进行动物安乐死和描记图采集，以便在炎症期、增殖期和重塑期监测伤口愈合的各个阶段。
5. 术后即刻护理
- 预先准备好盐酸曲马多，并为每只动物各准备一支无菌的1 mL皮下注射器及针头，确保严格的无菌条件。同时，准备弹力绷带和医用胶带以保护伤口。
- 以5 mg/kg剂量的盐酸曲马多（50 mg/mL）皮下注射，每12小时一次，持续3天，以启动镇痛。
- 用弹力绷带包扎手术伤口区域，并使用医用胶带固定，以保护伤口部位。
- 将大鼠放入单独的笼子中，并进行监测，确保其从麻醉和手术中恢复。
- 恢复后，将动物放回其相应的笼子中。
6. 治疗
- 伤口诱导 24 小时后，开始实施所需的实验处理，每天更换敷料。
注意：处理持续时间将取决于每个具体的实验方案。
7. 安乐死
- 根据动物伦理委员会批准的方案，对每组指定的样本实施安乐死。
- 确认死亡后，按照步骤4所述方法进行伤口的手动平面测量。
注意：本研究中，安乐死由经过培训的人员使用适用于啮齿类动物的断头器装置进行断头处死，操作过程严格遵守机构的伦理和动物福利指南。死亡的确认依据是操作后无呼吸运动、心跳及反射反应。
8. 病变区域的测量
- 需要图像分析软件来评估病损面积。此外，还需手动伤口描记法和毫米尺用于伤口的测量与监测。
- 下载选定的图像分析软件 如有需要，请注册并创建账户以访问该平台。
- 开始分析前，在平面图上选择两个固定点（例如 A 和 B），使用毫米尺测量这两点之间的距离，并将测得的数值单独记录下来（图2，步骤 A）。
- 拍摄先前划定的平面图及其上述各点，将文件保存为相应的实验分组标识图2，步骤 B）。
- 打开图像分析平台并启动伤口区域评估。
- 在软件中打开图像后，使用光标或智能手机触摸屏标记新的点，并将其叠加在先前标记的点上，将其标识为区域 A 和 B（图2，步骤 B）。
- 程序将自动在A点和B点之间建立一条直线，并提示输入使用直尺测得的以毫米或厘米为单位的数值。将该测量值输入软件，然后点击“测量”。
- 该程序将自动检测伤口区域，并提供伤口长度、宽度、周长、面积和深度的数据。在平面测量法中，将不提供“深度”信息。图2，步骤 C）。
- 将生成分析结果的图像保存，并导出至指定位置。
注意：本方案中所述的创面面积评估是使用下列材料表中列出的商用图像分析软件进行的 材料列表然而，根据用户偏好和机构条件，也可使用其他具备创面测量和数字平面测量功能的图像分析平台。如果软件无法自动识别平面测量图像，或识别出的轮廓与平面测量中实际观察到的轮廓不符，建议强化轮廓以帮助软件准确识别区域。可通过使用对比色（如红色）并对外部区域施加纹理来实现，覆盖范围约为4 cm²。2平面图描记的图像可直接从设备的相册上传，或通过相机拍摄后用于后续的软件分析。
图 2： 使用 ImitoWound 测量病灶面积。 （A）在手动平面测量中，标记两个点（A 和 B），并使用毫米尺测量它们之间的距离（x）；（B）将病灶图像上传至软件，划定先前定义的相同两点（A 和 B），使其与原始位置重合；输入先前测得的距离值（x）以进行比例校准；（C）提示软件继续进行病灶面积测量；等待系统自动计算并提供面积数值。本图由作者使用 BioRender 制作。Lessa da Silva, M. (2026) https://BioRender.com/dzko62t。已附出版许可。 请点击此处查看此图的放大版本。
9. 伤口收缩率的测定
- 在确定各评估时间点的创面面积后，利用以下公式计算创面收缩率20：
FF (%) = [(A0 - Ax) ÷ A0 ] × 100 (1)
其中 A₀ = 第0天的创面面积；Ax = 安乐死当天的创面面积；FF = 创面闭合率
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结果
在本实验中，采用磺胺嘧啶银作为对照治疗。在造模后24小时，将该产品局部应用于创面。选择磺胺嘧啶银是基于其作为抗菌剂以及在皮肤创面管理中的明确临床应用。数据以中位数和四分位距表示，每个实验时间点包含5只动物。图3A展示了皮肤创面在造模当天（D0）以及第3、7、14和21天的宏观变化，这些时间点分别对应各动物的安乐死时间。图3B展示了通过ImitoWound软件进行手动创面平面测量所获得的数据，从而实现对创面面积随时间变化的定量分析。
图3
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讨论
尽管人类伤口愈合的研究已取得显著进展，但由于存在固有的困难和局限性，实验模型的使用在该领域的研究中仍不可或缺4。在此背景下，本实验方案旨在描述一种在大鼠侧 flank 部位使用手术刀制造全层切除性伤口的模型，作为传统技术的一种替代方法。背部区域结合圆形打孔活检技术是皮肤愈合研究中最广泛使用的方法。然而，将 flank 部位作为替代解剖区域的应用也有充分文献记载，证明其在组织修复评估中具有同等的适用性21,22,23。与其他小鼠模型类似，该方案也受到伤口收缩过程的影响，这一现象与肉膜（panniculus carnosus）直接相关；肉膜是一层肌肉结构，负责损伤后皮肤的收缩24。尽管在伤口周围使用硅胶夹板可减轻这种收缩效应，但该技术需要更高的外科操作技能24,
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
我们衷心感谢巴伊亚州研究支持基金会（FAPESB）和高等教育人员进修协调办公室（CAPES）提供的奖学金支持；感谢南巴伊亚联邦大学研究与研究生副校长办公室（PROPP/UESC）以及微生物学与微生物生物技术研究生项目（PPGBBM/UESC）提供的经费支持。同时，我们感谢南巴伊亚联邦大学兽医院（HVET/UESC）提供手术室和设备。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酒精（70% 乙醇） | Dinâmica | P.01.0024.006.06.81 | 消毒 |
| 解剖镊 | Sigma-Aldrich | F3892 | 不锈钢 |
| 绷带 | 任意品牌 | 不适用 | 伤口保护 |
| 游标卡尺 | Mitutoyo | 530-104 | 伤口边界界定 |
| 0.2% 氯己定水性消毒液 | Riohex | 不适用 | 消毒 |
| CO2 麻醉舱 | Bonther | D149F1LYSZ | 麻醉诱导 |
| 弹性绷带 | Cremer | 818765 | 15 cm × 1.25 m |
| 一次性乳胶手套 | Descarpak | e0530101 | 非无菌 |
| 纱布垫 | Cremer | 819342 | 7.5 cm × 7.5 cm |
| 皮下注射器 | Dercarpack | e0324201 | 1 mL 带针头 |
| ImageJ | Image J | https://imagej.net/ij/ | 平面测量 |
| ImitoWound | ImitoWound | https://imito.io/pt/imitowound | 平面测量 |
| 层叠纸巾 | Scott Smart | 48260 | 常规清洁 |
| 异氟烷 | Cristália | 7.89668E+12 | 吸入性麻醉剂 |
| 操作用乳胶手套 | Latex gloves for procedure Latex gloves for procedure | 个人防护装备 | |
| 液体肥皂 | 任意品牌 | 不适用 | 伤口区域清洁 |
| 直型尖-尖梅奥剪刀 | Fine Science Tools | 14001-12 | 不锈钢 |
| 毫米尺 | 任意品牌 | 不适用 | |
| 硫酸吗啡 | Sigma-Aldrich | M8777 | 注射液 1 mg/mL |
| 纸张 | 任意品牌 | 不适用 | |
| 永久性记号笔 | 任意品牌 | 不适用 | 皮肤标记 |
| 聚维酮碘 | Rioquimica | ZK48BN72E | 消毒剂 |
| 23 号手术刀片 | Descarpak | 740801 | 不锈钢 |
| 4 号手术刀柄 | Sigma-Aldrich | 不适用 | 不锈钢 |
| 不锈钢剃刀刀片 | Wilkinson | N/A | 脱毛 |
| 无菌外科手套 | Descarpak | e0212101 | 无菌 |
| 外科口罩 | 任意品牌 | 不适用 | 非无菌 |
| 盐酸曲马多 | UniãoQuímica | 7.89601E+12 | 注射液 50 mg/mLção injetável 50 mg/mL |
| 透明薄膜敷料 | Vital derme | 1503 | 15 cm × 10 m |
| 透明聚丙烯胶带 | Transparent polypropylene adhesive tape Transparent polypropylene adhesive tape | 伤口保护 | |
| 带 PVC 外套的兽用保温毯 | Prevtech | MSO2VT001 | 体温维持 |
| 防水胶带 | Cremer | 819113 | 10 cm × 4.5 m |
参考文献
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