发育与环境胁迫过程中细胞核形态及染色质动态的定量活细胞成像 拟南芥 根

摘要

该过程结合使用共聚焦显微镜与荧光标记的细胞核及染色质标记品系 拟南芥 同时记录细胞核与染色质动态 拟南芥 根部并研究这些动态变化如何响应发育和环境信号。

摘要

细胞核是真核生物的特征性细胞器。与传统教科书中静态细胞核的观点不同，活细胞中的细胞核形态是动态变化的。在动物细胞中，细胞核形态的改变或变形是癌症的标志之一，而在植物中则常见于环境胁迫条件下。核膜蛋白通过与染色质相互作用来调控基因表达。然而，目前对于非生物胁迫对细胞核形态、运动以及染色质动态的影响仍知之甚少。为解决这一问题，我们建立了一套基于共聚焦显微镜和粒子追踪软件的分析流程，用于量化拟南芥根部在正常条件和非生物胁迫条件下的细胞核和染色质动态。该共聚焦成像方法利用一种双荧光标记的报告基因株系——同时标记核膜蛋白和染色质——在模式植物拟南芥的根部进行活细胞成像，分别在正常条件和盐胁迫条件下开展实验。所获得的动态图像通过开源图像处理软件Fiji/ImageJ，并借助TrackMate插件进行分析，以量化细胞核和染色质的动态参数。为验证该方法的有效性，我们对正常和盐胁迫条件下的根部染色质运动进行了成像与量化，结果显示在盐胁迫条件下染色质运动速度下降。该方法实现了在植物发育和环境胁迫过程中对根部细胞核形态及染色质动态的定量活细胞成像，从而能够分析由非生物胁迫因素引起的细胞核和染色质动态变化。

引言

在拟南芥（Arabidopsis thaliana）根的不同细胞类型之间以及发育过程中，细胞核形态具有可变性^1,2。例如，在活跃分裂的分生组织区域，细胞核呈球形。与分生区相反，根的过渡区和伸长区的细胞核球形程度较低。此外，已分化的细胞（如根毛细胞）中的细胞核会穿过狭窄的根毛基部，并被主动转变为细长形的细胞核^3,4,5。细胞核形态和运动的动态变化对细胞功能至关重要^6,7。细胞核形态异常会导致功能受损，例如核运动能力下降^1,3。在哺乳动物细胞中，细胞和细胞核形态的变化与基因表达和蛋白质合成的变化直接相关⁸。

在间期，细胞的DNA以染色质形式存在。染色质中的DNA缠绕在组蛋白周围，组蛋白可通过收紧或松弛DNA来调控基因表达。同样，染色质相对于核膜的位置及其与核周区域的接近程度也对基因表达具有重要意义⁹。环境胁迫（如渗透胁迫）会改变细胞核的形态，从而影响拟南芥（A. thaliana）根中一组触敏基因的表达¹⁰。在此背景下，通过活细胞延时成像研究细胞核形态和染色质动态显得尤为重要。核动态的一个重要方面是细胞核移动的速度，因为细胞内核的定位影响基因表达，而核的重新定位依赖于核的运动¹¹。染色质在细胞核内的运动速度同样重要，因为基因在核内的空间定位对于决定其表达水平至关重要¹²。

以往，细胞核形态和染色质动态是分别成像和定量的，因此细胞核形态与染色质动态之间的关系一直未被探索。通过同时对细胞核和染色质进行成像，可以观察它们之间的相对位置，从而揭示诸如细胞核旋转和核内染色质运动等难以甚至无法单独检测到的运动现象。在本方法中，我们介绍了一种活细胞成像技术，可在对照和盐胁迫条件下，同时通过荧光标记的外层核膜蛋白WPP结构域互作蛋白1（WIP1）¹³ 可视化并量化细胞核形态，并通过着丝粒组蛋白H3（CENH3）¹⁴ 动态监测染色质状态，旨在实现对非生物胁迫因素引起的细胞核及染色质动态变化的分析。为实现该方法，我们构建了拟南芥（A. thaliana）的WIP1-GFP/CENH3-mRFP双荧光标记品系。此外，我们利用开源ImageJ/Fiji软件中的TrackMate插件，对染色质动态进行了定量分析。我们在盐胁迫条件下测试了该双荧光品系及染色质动态分析技术，发现胁迫条件导致着丝粒焦点的形态和动态发生改变。这一简单且可重复的方法非常适合在多种非生物胁迫条件下，对拟南芥（Arabidopsis）根部的细胞核和染色质动态进行高通量追踪研究。

方案

1. 培养 A. thaliana 幼苗

1. 培养基制备
   1. 将800 mL纯水倒入置于搅拌器上的1 L烧杯中，并向烧杯中加入一个搅拌子。
   2. 将搅拌器转速调至600 rpm。
   3. 向烧杯中加入10 g蔗糖。
   4. 向烧杯中加入2.16 g Murashige和Skoog（MS）培养基。
   5. 向两个1 L培养基瓶中各加入5 mg琼脂。
   6. 将其中一个瓶子标记为"1/2 MS"，另一个标记为"100 mM NaCl"。
   7. 用高压灭菌指示胶带标记两个瓶盖。
   8. 向标记为"100 mM NaCl"的瓶子中加入5.84 g NaCl。
   9. 用纯水将烧杯加满至1 L。
   10. 将烧杯放回搅拌器上，等待蔗糖和MS完全溶解。
   11. 将烧杯中的溶液倒入1 L量筒中。
   12. 将量筒中的溶液各取500 mL分别倒入两个瓶子中。
   13. 将培养基和250 mL纯水在121 °C条件下进行高压灭菌，液体循环时间为60分钟。
       注意：高压灭菌培养基和水时，应确保瓶盖松动，以防发生爆炸。
   14. 重新拧紧培养基瓶的瓶盖。
   15. 将培养基瓶倒置7次，确保琼脂均匀分布。
   16. 将培养基储存于4 °C冰箱中，使用前微波加热使其融化。
2. 制备培养皿和种子
   1. 在超净工作台内，使用移液枪将50 mL培养基分别加入十个培养皿中（图1A）。
   2. 在培养基凝固期间，在微量离心管中加入1 mL 70%乙醇浸泡WIP1-GFP x CENH3-mRFP种子10分钟，以进行清洗（图1B）。
      注意：操作乙醇时，应确保周围无明火。
   3. 10分钟后，在超净工作台内吸除乙醇，并用1 mL高压灭菌水清洗种子两次（图1C）。
   4. 待培养基完全凝固后，使用1000 µL移液器将清洗后的种子接种到培养皿中，每皿两行，每行14粒种子（图1D）。
   5. 用永久性记号笔标记培养皿，并在离开超净工作台前用透析胶带密封（图1E）。
3. 种子萌发
   1. 用铝箔纸包裹培养皿，并在4 °C冰箱中进行低温层积处理，至少2天（图1F）。
   2. 低温层积处理结束后，从冰箱中取出培养皿，垂直放置于生长灯下（光照强度约80 µmol/m²/s），至少培养4天（图1G）。
   3. 在超净工作台内，将一半的培养皿转移至100 mM NaCl培养基中，然后密封并标记培养皿（图1H）。
   4. 在成像前，将培养皿继续在生长灯下培养2天（图1I）。

2. 活细胞成像 拟南芥 根细胞核与染色质

1. 载玻片制备
   1. 用移液器将 60 µL 纯水滴加到玻璃载玻片上（图 2A）。
   2. 将 3 株 6 日龄的 A. thaliana 幼苗根部放入水中（图 2B）。
   3. 在根部上方加盖一块 22 mm × 22 mm #1.5 盖玻片，注意不要覆盖叶片（图 2C）。
2. 共聚焦显微镜设置
   1. 将激光曝光时间设置为 1000 ms（1 s）。
   2. 在激光合束器中，将 488 nm 激光设置为 50%，用于绿色荧光蛋白（GFP），将 561 nm 激光设置为 50%，用于红色荧光蛋白（RFP）（图 2D）。使用 20× 物镜成像，不进行光学放大。若记录时间超过 10 分钟，应降低激光强度以减少光漂白。
   3. 将 Z 轴切片步长设置为 0.3 µm。
   4. 将时间间隔设置为 1 分钟，总持续时间为 10 分钟。
3. 成像
   1. 定位根部，选择最多 20 个 Z 轴切片，并采集 16 位图像。
   2. 开始延时成像。
   3. 使用无损压缩方式将延时成像保存为 TIFF 文件。
   4. 将数据转移至计算机进行分析。

3. 数据追踪与分析

注意：需要使用开源软件 ImageJ 的 Fiji 版本（推荐版本 v. 1.54），该版本已预装 TrackMate。

1. 初始化
   1. 打开 ImageJ/Fiji。
   2. 将 .vsi 文件点击并拖拽至主 ImageJ/Fiji 应用程序窗口（图 3A）。
   3. 将弹出标题为 Bio-Formats Import Options 的提示框；点击右下角的 Ok（图 3B）。
   4. 将弹出标题为 Bio-Formats Series Options 的提示框。确保已选择 Series 1，然后点击左下角的 Ok（图 3C）。
      注意：文件加载可能需要一分钟时间，尤其是当其包含大量 Z 层或时间点时。
   5. 图像打开后（图 3D），在主 ImageJ 窗口中依次导航至 Image > color > split channels（图 3E），以分离信号。这将生成两个独立窗口，一个用于 GFP 标记的细胞核，另一个用于 RFP 标记的染色质（图 3F）。
2. 染色质预处理
   1. 确定两个窗口中哪一个对应染色质图像。
   2. 点击染色质窗口（图 3F），然后在主 ImageJ 窗口中依次导航至 image > stacks > Z project，执行 Z 投影操作（图 4A）。
   3. 将投影类型更改为 Max Intensity，并确保 All Time Frames 处于激活状态，然后点击 Ok（图 4B）。
   4. 通过按下 Ctrl+Shift+C 或在主 ImageJ 窗口中依次导航至 image > adjust > Brightness/Contrast，打开对比度调节菜单（图 4C）。
   5. 向左滑动第二个滑块（标记为 Maximum），直到染色质清晰可见（图 4D）。
3. 染色质追踪
   1. 导航至 plugins 菜单（图 5A）。
   2. 点击插件菜单中的下拉箭头，滚动至 tracking 选项（图 5A）。
   3. 点击 tracking，然后选择 TrackMate。
   4. 初始设置界面将出现。确认校准设置准确无误后，点击 Next（图 5B）。
   5. 选择 Thresholding Detector，然后点击 Next（图 5C）。
   6. 在图像窗口中，跳转至延时序列的最后一帧（图 5D）。
   7. 在强度阈值旁，点击 Auto，然后点击 Preview。
   8. 调整强度阈值并点击 Preview。反复调整并预览阈值，直到预览中包含所有染色质且噪声最小，然后点击 Next（图 5D）。
   9. 将执行初步的阈值检测；完成后点击 Next（图 5E）。
   10. 手动调整阈值，直到仅染色质可见，然后点击 Next（图 5F）。
   11. 此页面允许对检测点进行筛选。忽略此步骤，直接点击 Next（图 6A）。
   12. 选择 Simple LAP tracker，然后点击 Next（图 6B）。当被追踪对象不发生融合或分裂时，可使用 LAP 追踪器。
   13. 将 linking max distance 设置为 5 microns，gap-closing max distance 设置为 15 microns，gap-closing max frame gap 设置为 1。然后点击 Next（图 6C）。
   14. 开始追踪。轨迹将显示在原始图像窗口中。完成后点击 Next（图 6D）。
   15. 此页面允许对轨迹进行筛选。点击左下角的 绿色 + 按钮创建筛选条件，选择 Number of spots in track 模式，然后点击 Auto（图 6E）。
   16. 确保模式设置为 Above。这将剔除快速出现和消失的点。
   17. 点击 Next（图 6E）。
   18. 在显示选项页面中可导出数据为 CSV 文件。在页面底部点击 Tracks 按钮，然后选择 Export to CSV（图 7A）。
   19. 此页面支持内置绘图功能；忽略此功能，直接点击 Next。
   20. 在最后一页，使用 Capture overlay 功能并点击 execute 保存视频。点击后，依次导航至 file > save as > GIF 保存文件（图 7B）。
4. 基本速度分析
   1. 在电子表格软件中打开轨迹 CSV 文件。
   2. 删除除 TRACK_ID、POSITION_X、POSITION_Y、POSITION_T、FRAME 和 RADIUS 之外的所有列。
   3. 每条轨迹中的点可能顺序混乱。为排序，首先冻结前四行，然后新建一列命名为 TRACK_FRAME，并将以下公式复制粘贴至该列：=concatenate(A4, "_", if(E4>9, E4, concatenate("0", E4)))。
   4. 选中 TRACK_FRAME 列，右键点击，然后选择 Sort sheet A–Z。此时每条轨迹内的点应已按顺序排列。
   5. 为确认任意轨迹中间无缺失点，新建一列并输入以下公式：=if(E4>E3, E4-E3, "NA")。确保每条轨迹的第一个点返回 "NA"，其余为 1。
   6. 新建一列用于计算速度（单位：micron/frame），并输入以下公式：=if(H4="NA", "NA", sqrt((B4-B3)^2 + (C4-C3)^2))。该公式将使用勾股定理计算两点之间的距离。
   7. 为转换为速度（单位：micron/second），新建一列并输入以下公式：=IF(I5="NA", "NA", I5/(D5/E5))。该公式将计算每帧对应的秒数，并相应地将 micron/frame 转换为 micron/second。

结果

活细胞成像观察核膜与染色质动态
我们构建了一个双荧光标记品系，包含外核膜蛋白WIP1-GFP和着丝粒染色质CENH3-mRFP（图8）。将4天大的幼苗转移至对照平板或含100 mM NaCl的平板中培养2天。培养2天后，盐处理组明显出现根生长抑制现象，与先前报道一致¹⁵。分别对对照组和盐处理组的根进行活细胞成像，采集5–10分钟的时间序列图像，图像采集间隔为1分钟（补充视频1和补充视频2）。与对照组相比，盐处理的根细胞表现出应激状态，且着丝粒焦点比对照条件下更大（图8）。这些结果明确表明盐胁迫在细胞水平上对根部产生了影响。

从活细胞动态影像中量化染色质动态
获取的影像通过 ImageJ/Fiji 软件进行处理。第一步也是最关键的一步是染色质的分割，该过程通过简单的强度阈值法实现（补充视...

讨论

本文介绍的方法非常适合追踪染色质动态。与以往分别成像的活细胞成像方法相比，同时对细胞核和染色质进行成像，有助于探究细胞核动态与染色质动态之间的关系。该方法可能揭示诸如细胞核旋转和核内染色质运动等难以直接展示的现象。

作为一种活细胞成像方法，最重要的是在整个过程中保持荧光信号的稳定性。如果在延时成像过程中发生光漂白导致信号中断，则应降低激光功率和曝光时间。这一点在对方法进行修改以延长延时成像持续时间时尤为重要。在图像采集方面，与激光扫描共聚焦显微镜相比，转盘共聚焦显微镜具有更高的帧率并能减少光漂白，因此更适用于活细胞成像。在图像处理过程中，染色质的分割是另一个关键步骤¹⁶。因此，用户必须确保染色质斑点在所有时间点均被正确分割。在输入TrackMate之前增加高斯滤波步骤有助于提高分割效果。如果未进行此步骤，则应重新分割染色质，以确保所有染色质都被包含在分割结果中，即使同时也会将部分噪声分割出来，因为噪声可在后续追踪过程中被过滤掉。如果某条轨迹无法延续到特定时间点之后，可能是由于该时间点的染色质斑点未被分割所致。如果某条轨迹从一个斑点跳转...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
½ Murashige 和 Skoog (MS) 培养基	bioWorld	30630058
3M 微孔胶带	Amazon	A-1530-0
图像采集软件	Olympus/Evident	CellSens
琼脂	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
盖玻片	Genesee	29-116
载玻片	Genesee	29-101
Image/Fiji	开源软件	https://imagej.net/software/fiji/downloads
显微镜	Olympus/Evident	IX83
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-212
转盘式共聚焦系统	Yokogawa	CSU-W1
方形培养皿	Simport	26-275
蔗糖	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987