拟南芥根部核形和染色质动态的定量活细胞成像

摘要

该过程结合共軛焦显微镜配合拟 南芥 中荧光标记的核和染色质标记线，同时记录拟 南芥 根部的核和染色质动态，并研究这些动态随发育和环境信号变化。

摘要

核是真核生物的特征细胞器。与经典教科书中静态核的观点不同，活细胞的核形是动态的。细胞核形状的改变或变形是动物细胞癌症和植物环境压力的典型特征。核膜蛋白与染色质相互作用以调控基因表达。遗憾的是，关于非生物应力对核形状、运动和染色质动力学的影响知之甚少。为应对这一问题，我们开发了一套利用共焦显微镜和粒子跟踪软件的流程，在受控和非生物胁迫条件下量化拟南南花根部的核动态和染色质动态。该共焦成像方法利用双荧光标记线——核膜蛋白和染色质——在对照和盐应力条件下对模式植物拟南芥根部进行活细胞成像。这些捕获的影片通过开源图像处理软件Fiji/ImageJ和TrackMate插件进行分析，以量化核动力学和染色质动力学。为验证该方法，我们对对照和盐应力根的染色质运动进行了成像和量化，揭示了盐应力条件下染色质速度的下降。该方法能够定量活细胞成像根核形状和染色质动态，从而在植物发育和环境胁迫期间分析核和染色质动态的变化。

引言

在拟南芥的根^1,2中，不同细胞类型和发育过程中核形状各异。例如，核形状在积极分化的分生组织区域呈球形。与分生组织区不同，根过渡区和伸长区的核球形较小。此外，分化细胞中的细胞核，如根毛，会穿过紧密的根毛基底，积极转化为细长的细胞核^3,4,5。核形状和运动的动态变化^对细胞6,7的功能至关重要。核形缺陷会导致功能损伤，如核运动减少^1,3。在哺乳动物细胞中，细胞和细胞核形状的变化与基因表达和蛋白质合成的变化直接^相关8。

在间期，细胞的DNA被组织为染色质。染色质中的DNA包裹在组蛋白周围，组蛋白可以收紧或松弛DNA以改变表达。同样，染色质相对于核膜的位置以及与核外周的接近也对基因表达9^{非常重要。}环境应激，如渗透应力，会改变核状结构，进而改变A. thaliana根部中一组触感基因的^表达。在此背景下，通过活细胞延时摄影研究核形和染色质动态非常重要。核动力学的一个重要方面是细胞核运动的速度，因为细胞内的核位置驱动基因表达，而核重新定位则需要核的运动¹¹。染色质在细胞核内的运动速度同样重要，因为基因在细胞核内的位置对于决定基因表达^{至关重要。}

此前，核形和染色质动力学是分开成像和定量的;因此，核形与染色质动力学之间的关系仍未被探索。通过同时成像核和染色质，可以观察它们彼此之间的相对位置，这可能揭示如核旋转和核内染色质运动等难以证明的运动。在该方法中，我们提出了一种活细胞成像技术，通过荧光标记的外核膜蛋白WPP结构域相互作用蛋白1（WIP1）¹³ 和染色质通过着丝粒组蛋白H3（CENH3）¹⁴ 动力学，在对照和盐应激条件下同时可视化和定量核状结构，旨在分析由非生物胁迫物引起的核和染色质动力学变化。为实现该方法，我们生成了A . thaliana的WIP1-GFP/CENH3-mRFP系。此外，我们通过使用开源ImageJ/Fiji软件中的TrackMate插件，定量研究了染色质动力学。我们在盐应力条件下测试了双荧光线和染色质动力学技术，发现着丝粒焦点形态和动力学因应力条件而发生变化。这种简单且可重复的方法非常适合在各种非生物应激条件下高通量追踪 拟南芥 根部的核动态和染色质动态。

方案

1. A . thaliana 幼苗的生长

1. 培养基制备
   1. 将800毫升纯水放入1升烧杯中，放在搅拌盘上。在烧杯上加一根搅拌棒。
   2. 在600转/分钟打开搅拌板。
   3. 往烧杯中加入10克蔗糖。
   4. 在烧杯中加入2.16克Murashige和Skoog（MS）培养基。
   5. 在两瓶1升培养液中各加入5毫克琼脂。
   6. 一瓶标注为“1/2 MS”，另一瓶标注“100 mM NaCl”。
   7. 用高压灭菌胶带贴上两个瓶盖。
   8. 在标有“100 mM NaCl”的瓶子中加入5.84克NaCl。
   9. 用1升纯水装满烧杯。
   10. 将烧杯放回搅拌盘，等待蔗糖和MS溶解。
   11. 将烧杯内容倒入一个1升的分量圆筒中。
   12. 将500毫升分量的圆筒内容倒入每个瓶子。
   13. 高压灭菌培养基和250毫升纯水，液体循环60分钟，温度为121°C。
       注意：高压灭菌时，确保盖子松动以避免爆炸。
   14. 重新拧紧培养基盖。
   15. 将培养基瓶倒置7次，确保琼脂均匀分布。
   16. 将培养基存放在4°C的冰箱中，直到需要时再用微波炉液化。
2. 种植生长板和种子
   1. 在流罩中，使用移液枪将50毫升培养基移液到十个板中的每个（见图1A）。
   2. 培养基凝固期间，通过在微离心管中注入1毫升70%乙醇，浸泡10分钟，净化WIP1-GFP×CENH3-mRFP种子（见图1B）。
      注意：处理乙醇时，确保周围没有明火。
   3. 10分钟后，在流动罩中去除乙醇，并用1毫升高压灭菌水冲洗种子两次（见图1C）。
   4. 培养基凝固后，使用1000微升移液器将清洗后的种子分成两排，每排14颗种子，放置在生长板上（见图1D）。
   5. 用永久性记号笔标记板块，并在离开流动罩前用微孔胶带封口（见图1E）。
3. 萌芽幼苗
   1. 用铝箔包裹生长板，并在4°C冰箱冷层保存至少2天（见图1F）。
   2. 冷层积后，取出冰箱中的板材，竖置在生长灯下（~80 μmol/^{m 2}/s），至少4天（见图1G）。
   3. 将一半板转移到流动罩内的100 mM NaCl生长培养基中，然后封闭并标记板块（见图1H）。
   4. 成像前，将培养板置于生长灯下2天（见图1I）。

2. 活细胞成像对 A. thaliana 根核和染色质

1. 载玻片准备
   1. 将60微升纯水移液器移液到玻璃载玻片上（图2A）。
   2. 将3根6天龄 的A. thaliana 幼苗根放入水中（图2B）。
   3. 在根部覆盖22毫米×22毫米#1.5滑套，但不覆盖叶片（见图2C）。
2. 共焦点显微镜设置
   1. 将激光曝光时间设置为1000毫秒（1秒）。
   2. 在激光合路器中，将488 nm激光设置为50%用于绿色荧光蛋白（GFP），将561 nm设置为50%用于红色荧光蛋白（RFP）（见图2D）。使用20×物镜无光学变焦的图像。如果录制超过10分钟，应降低强度以减少光漂白。
   3. 将Z切片步长设为0.3微米。
   4. 将间隔设为1分钟，总时长为10分钟。
3. 成像
   1. 定位根节点，选择最多20个z片，捕捉16位图像。
   2. 开始延时摄影。
   3. 使用无损压缩保存延时动画为TIFF文件。
   4. 将数据转移到计算机进行分析。

3. 数据跟踪与分析

注意：用户需要使用斐济版的开源软件ImageJ（推荐版本1.54），该软件预装了TrackMate。

1. 初始化
   1. Open ImageJ/斐济。
   2. 点击并拖动一个 .vsi 文件到 ImageJ/Fiji 应用主窗口（图 3A）。
   3. 会出现一个名为“ 生物格式导入选项 ”的提示;点击右下角的 确定 （图3B）。
   4. 将出现一个题为“ Bio-Formats Series Options” 的提示。确保选中 了系列1 ，并在左下角点击 确定 （图3C）。
      注意：文件加载可能需要一分钟，尤其是当文件有多个Z层或时间点时。
   5. 图像打开后（见图3D），通过主ImageJ窗口导航到图像>色彩>分频道（图3E）。这将创建两个独立窗口，一个用于GFP标记的核，另一个用于RFP标记的染色质（见图3F）。
2. 预处理染色质
   1. 确定两个窗口中哪个对应染色质。
   2. 点击染色质窗口（图3F），通过主ImageJ窗口导航到Z项目>>图像堆栈（图4A）应用Z项目操作。
   3. 将投影类型改为 最大强度 ，确保 所有时间帧 都已激活，然后点击 确定 （图4B）。
   4. 通过按Ctrl+Shift+C打开对比度菜单，或在主ImageJ窗口导航到图像>>调整亮度/对比度（图4C）。
   5. 将第二条横线（标注 为最大值）向左滑动，直到染色质清晰可见（图4D）。
3. 追踪染色质
   1. 导航到 插件 （见图5A）。
   2. 点击插件菜单中的向下箭头，滚动到 追踪 选项（图5A）。
   3. 点击 追踪，然后 点击TrackMate。
   4. 初始设置会显示出来。确认校准设置准确，然后点击 下一步 （图5B）。
   5. 选择阈 值检测器 并点击 “下一步 ”（图5C）。
   6. 在图像窗口中，移动到延时摄影的最后一帧（图5D）。
   7. 在强度阈值旁边，点击 自动，然后点击 预览。
   8. 调整强度阈值并点击 预览。反复调整和预览阈值，直到预览包含所有染色质且噪音最小，然后点击 “下一步 ”（图5D）。
   9. 初始阈值检测将进行;点击 “下一页 ”（图5E）。
   10. 手动将阈值调整到只可见染色质，然后点击 “下一步 ”（见图5F）。
   11. 此页面允许筛选位置。忽略此项，点击 “下一步 ”（图6A）。
   12. 选择 简单的LAP跟踪器 ，点击 下一步 （图6B）。LAP跟踪器适用于被追踪对象未合并或未分割的情况。
   13. 将 连接最大距离 设为 5微米，最大 闭合 距离为 15微米，闭 合最大帧距 设为 1。点击 下一步 （图6C）。
   14. 追踪将会进行。轨道会显示在原始图像窗口中。点击 下一步 （图6D）。
   15. 该页面允许曲目筛选。按下左下角 的绿色+ 键创建滤波器，然后选择轨道模式中的 点数 ，按下 自动 （见图6E）。
   16. 确保模式设置为 “以上”。这样可以消除那些快速出现又消失的斑点。
   17. 点击 下一步 （图6E）。
   18. 显示选项页面允许导出数据为csv文件。在页面底部，点击 “轨道” 按钮，然后导出 为CSV （见图7A）。
   19. 该页面支持内置绘图功能;忽略它，点击 “下一步”。
   20. 在最后一页，用 Capture叠加 保存视频并按 执行。点击它，然后导航到 文件 ，> 保存为 > GIF （图7B）。
4. 基本速度分析
   1. 在电子表格软件中打开赛道CSV。
   2. 删除除 TRACK_ID、 POSITION_X、 POSITION_Y、 POSITION_T、 帧和 半径外的所有列。
   3. 每条赛道的时段顺序会不一样。要排序它们，首先冻结最上面的四行，然后创建一个名为 TRACK_FRAME 的新列，并将该公式复制粘贴到列中：=concatenate（A4， “_”， if（E4>9， E4， concatenate（“0”， E4）））。
   4. 选择 TRACK_FRAME 列，右键点击，然后点击 排序表A–Z。每条赛道中的位置现在应该都已排好。
   5. 为了确认轨道中间没有缺失，创建一个新列并使用以下公式：=if（E4>E3， E4-E3， “NA”）。确保每首曲目的第一点返回“NA”，其余位置为1。
   6. 创建一列速度（微米/帧），并粘贴以下公式：=if（H4=“NA”， “NA”， sqrt（（（B4-B3）^2 + （C4-C3）^2））。这将利用毕达哥拉斯定理计算两点之间的距离。
   7. 要将此转换为速度（微米/秒），创建一个新列并粘贴以下公式：=IF（I5=“NA”， “NA”， I5/（D5/E5））。这样可以找到每帧的秒数，并相应地平移每帧的微米。

结果

核包膜和染色质动力学的活细胞成像
我们生成了一条双荧光标记线，包括外核包膜蛋白WIP1-GFP和着丝粒染色质CENH3-mRFP（见图8）。4天龄幼苗移植至对照板或含100 mM钠盐板，进行2天的检测。潜伏2天后，盐处理中明显出现根系生长抑制，如先前报道的¹⁵。对照根和盐处理根均用于进行活细胞成像，并拍摄5–10分钟的延时影片，采集间隔一分钟（补充视频1和补充视频2）。与对照组不同，盐处理的根细胞表现出应力，着丝粒焦点比对照条件更大（见图8）。这些观察清楚地表明盐胁迫在细胞层面对根部的影响。

从活细胞薄膜定量化染色质动力学
购入的电影由ImageJ/Fiji处理。第一步也是最重要的步骤是染色质的切割，通过简单的强度阈值检测（

讨论

这里提出的方法非常适合追踪染色质动力学。与以往采用分离成像的活细胞成像方法相比，细胞核和染色质的同时成像使得探索核动力学与染色质动力学之间的关系成为可能。这可能揭示诸如核旋转和核内染色质运动等难以证明的运动。

作为活细胞成像方法，在整个过程中保持一致的荧光线非常重要。如果光漂白在延时过程中干扰信号，则应减少激光功率和曝光时间。如果方法被修改以延长时间流逝时长，这一点尤为重要。在图像采集方面，旋转盘共聚焦显微镜的高帧率和减少的光漂白使其成为活细胞成像的理想选择，区别于激光扫描共聚焦显微镜。在图像处理过程中，染色质的分割是另一个关键步骤¹⁶。因此，用户必须确保分段的染色质点在所有时间点中都被分割。在进入TrackMate前添加高斯过滤步骤有助于改善分割。如果没有，染色质应重新分段，使所有染色质都包含在分段中，即使噪声也被分段，因为噪声可以在追踪过程中被滤除。如果一条线路在某个时间段内无法继续，可能是因为该时间段内染色质点未分割。如果一条线路从一个点跳到另一个点，这可能表明...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
½ Murashige and Skoog (MS) media	bioWorld	30630058
3M micropore tapes	Amazon	A-1530-0
Acqusition software	Olympus/Evident	CellSens
Agar	bioWorld	40100072
CENH3-mRFP	ABRC	CS799459
Cover slip	Genesee	29-116
Glass slide	Genesee	29-101
Image/Fiji	开源软件	https://imagej.net/software/fiji/downloads
Microscope	Olympus/Evident	IX83
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-212
Spinning disk	Yokogawa	CSU-W1
Square petri dishes	Simport	26-275
Sucrose	bioWorld	41900152
WIP1-GFP	ABRC	CS39987