丹栀降糖胶囊（DJC）可能通过影响趋化因子信号通路和细胞焦亡标志物，减轻糖尿病肾病（DN），该结论得到生物信息学分析及实验验证的支持。 体内 验证
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丹栀降糖胶囊（DJC）可能通过影响趋化因子信号通路和细胞焦亡标志物，减轻糖尿病肾病（DN），该结论得到生物信息学分析及实验验证的支持。 体内 验证
尽管丹蛭降糖胶囊（DJC）是一种临床上用于治疗糖尿病的传统中药制剂，但其在糖尿病肾病（DN）中如何发挥肾脏保护作用尚未完全阐明。本研究旨在探讨DJC影响DN的潜在机制，重点关注NLR家族含吡啶结构域3（NLRP3）/Caspase-1/焦亡相关蛋白Gasdermin D（GSDMD）的焦亡信号通路。
采用整合网络药理学与机器学习的综合策略。利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）及中药分子机制生物信息学分析工具（BATMAN-TCM），筛选大黄甘草汤（DJC）的生物活性成分及其对应的蛋白靶点。从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）、GeneCards 和在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM）中获取糖尿病肾病相关基因。通过多种机器学习算法筛选并排序关键候选靶点。采用分子对接方法评估 DJC 活性成分与核心靶点之间的结合亲和力。最后，在 db/db 糖尿病小鼠模型中验证其治疗效果及预测的作用机制。
网络药理学分析鉴定出599个DJC靶点以及与DN共享的68个重叠基因。通过机器学习算法，筛选出C-C基序趋化因子配体2（CCL2）和CASP1作为优先候选靶点。分子对接预测显示，DJC活性成分与这些核心蛋白之间可能存在较强的结合亲和力。功能富集分析（GO/KEGG）表明，DJC的调控作用与炎症反应及MAPK通路相关。体内验证结果显示，DJC治疗可减轻肾损伤及纤维化标志物。这些发现提示，DJC可能部分通过调控CCL2/C-C基序趋化因子受体2（CCR2）相关的细胞焦亡信号通路来缓解DN。
糖尿病（DM）的全球负担持续加重，已成为严峻的公共卫生挑战。据估计，每年有520万人死于DM及其相关并发症1。糖尿病肾病（DN）是一种严重的微血管并发症，也是导致终末期肾病（ESRD）发生的主要因素之一，影响约30-40%的糖尿病患者2,3。多种相互交织的因素共同促进DN的病理进展，包括代谢功能障碍、血流动力学重塑以及持续性炎症反应。高糖和高脂血症等病理刺激可激活NLRP3/caspase-1/GSDMD介导的细胞焦亡通路，诱导肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞发生炎症性程序性死亡，进而导致进行性肾小管间质病变4。细胞焦亡的特征是细胞膜破裂，促使IL-1β和IL-18释放5。这些促炎因子可上调C-C趋化因子配体2（CCL2）的转录，促进巨噬细胞浸润，并进一步增强焦亡的激活，从而逐步加剧肾脏损伤6。在临床上，该疾病表现为进行性白蛋白尿以及肾小球滤过率逐渐下降，最终可能导致不可逆的肾损害，并显著降低患者的生活质量7,8。尽管医疗技术不断进步，目前的治疗策略主要集中在严格控制血糖和血压，但仍常无法完全阻止疾病的进展。虽然近年来一些新兴药物疗法（如SGLT2抑制剂、GLP-1受体激动剂、盐皮质激素受体拮抗剂）以及干细胞治疗和饮食干预受到广泛关注并日益应用于临床实践9，但DN的残余风险仍然较高。因此，开发创新性治疗药物仍是迫切的研究重点，尤其是来源于传统医学、可能同时靶向多个病理通路的治疗物质。
丹蛭降糖胶囊（Danzhi Jiangtang Capsule，DJC）是安徽中医药大学第一附属医院研制的院内制剂（安徽省医疗机构制剂批准文号：Z20090006；专利号：ZL200310112845.1；批号：20220427），具有良好的治疗前景。该制剂需密封，置于干燥、通风处保存，并避光。其处方由六味中药组成：Pseudostellaria heterophylla（太子参）、Whitmania pigra（水蛭）、Alisma orientale（泽泻）、Cuscuta chinensis（菟丝子）、Paeonia suffruticosa（牡丹皮）和Rehmannia glutinosa（熟地黄），配比为5:4:4:3:2:510。临床实践中，DJC已显示出显著的降血糖作用，并能降低糖尿病患者的肾损伤标志物水平11。既往研究表明，DJC可能通过调节血糖水平和脂质代谢发挥肾脏保护作用12,13,14。然而，以往对DJC的研究多集中于单一通路验证，靶点选择缺乏系统性。因此，本研究结合网络药理学与机器学习方法，筛选活性成分并识别核心枢纽基因，继而进行初步的in vivo验证，以增强分析的系统性与可靠性。
网络药理学为解析复杂的中药处方提供了一种有效策略。该框架整合了生物信息学与系统生物学方法、计算化学以及药理学，以阐释 "多组分、多靶点、多通路" 药物作用机制15,16,17这种整体性方法有助于系统性地探究中药化合物与疾病特异性网络之间的复杂相互作用，揭示中医药内在的协同效应18然而，传统的网络药理学有时会在数据中产生过多噪声。为克服这一问题，整合机器学习算法能够从大规模数据集中精确筛选核心特征基因。此外，分子对接可为预测潜在药物与生物分子之间的结合亲和力提供直观且动态的视角。19.
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DJC 生物活性化合物及其潜在靶点的筛选
DJC 中六味药材的生物活性成分，即孩儿参（Pseudostellaria heterophylla，太子参）、牡丹（Paeonia suffruticosa，丹皮）、菟丝子（Cuscuta chinensis，菟丝子）、东方泽泻（Alisma orientale，泽泻）、地黄（Rehmannia glutinosa，熟地黄）和水蛭（Whitmania pigra，水蛭），均从 TCMSP 数据库中获取。筛选依据药代动力学参数：口服生物利用度（OB）≥ 30% 且类药性（DL）≥ 0.18。对于 TCMSP 中缺乏数据的 Whitmania pigra，其活性成分和靶点通过 BATMAN-TCM 数据库获取，筛选标准为评分 ≥ 20 且 P-值 < 0.05。所有收集到的靶点通过 UniProt 数据库统一转换为标准基因命名。
获取与DN相关的基因
DN相关基因从三个来源收集。首先，使用GeneCards和OMIM进行检索 "糖尿病肾病" 作为搜索词。来自 GeneCards 且具有相关性评分的基因 > 1被保留。其次，从GEO数据库中获取了三个芯片表达谱（GSE30529、GSE104948、GSE96804）。GSE30529中的样本来源于肾小管，而GSE104948和GSE96804中的样本来源于肾小球。所有数据库检索均于2024年12月15日完成。利用R软件中的limma包，鉴定GSE30529数据集中糖尿病肾病（DN）患者与健康对照之间的差异表达基因（DEGs）。筛选标准设定为校正后p值 < 0.05 和 |log2(倍数变化)| > 0.5. 火山图和热图展示了差异表达基因。
鉴定DJC治疗DN的潜在治疗靶点
维恩图分析确定了DJC靶向基因库与GeneCards、OMIM及GSE30529差异表达基因中与DN相关基因之间的共有位点。这些共有位点作为所有下游研究步骤的候选治疗基因。
蛋白质相互作用（PPI）网络的构建与分析
将推定的治疗靶点位点上传至STRING数据库以构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，相互作用阈值设定为置信度值大于0.4。使用Cytoscape对网络数据进行处理以实现可视化呈现。通过CytoNCA插件计算度（Degree）等拓扑学指数，以识别网络中的核心节点。
富集分析
为了阐明候选靶点相关的生物学功能及信号通路，使用R语言中的clusterProfiler包进行功能富集分析，并利用org.Hs.eg.db进行注释，ggplot2用于可视化。基因本体（Gene Ontology, GO）术语在生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）三个类别中进行评估。当富集p值小于< 0.05时，保留京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路。
CytoHubba 算法的应用
使用 Cytoscape 中的 CytoHubba 插件计算每个网络节点的四种拓扑中心性指数。度（Degree）指直接相连的邻居数量，反映每个蛋白质相互作用的广度。最大邻域组分（Maximum neighborhood component, MNC）是一种量化节点邻域子图中最大连通组分大小的指标，用于衡量局部调控影响力。边渗透组分（Edge percolated component, EPC）通过模拟随机边移除并量化平均连通组分大小来评估节点的全局结构重要性。对每种指数排名前 20 的基因取交集，得到最终的枢纽基因。
基于机器学习的核心基因筛选
采用三种机器学习方法分析GSE30529数据集的表达谱，以在候选靶基因中鉴定可靠的枢纽基因。
（1）LASSO（最小绝对收缩与选择算子）：通过五折交叉验证对正则化参数 λ 进行调优，并根据各折的平均性能确定最优值。输入的基因表达特征经过自动的 Z 分数标准化处理，以消除表达量级的影响。将惩罚参数 α 固定为 1，以实现纯粹的 LASSO 正则化，并使用预定义的 100 个 λ 值进行筛选。L1 惩罚将低相关性特征的系数压缩至零，从而实现特征选择与模型复杂度控制的同步进行，而通过交叉验证调优的正则化强度可有效降低过拟合风险。
（2）SVM-RFE（支持向量机-递归特征消除）：采用双层5折交叉验证框架以确保特征筛选的稳健性。将整个数据集随机划分为五个互不重叠的子集，每次迭代使用其中四个子集进行训练，一个子集用于测试，共进行五次迭代；通过各折结果的平均值来降低单次样本划分带来的偏差。应用递归特征消除方法以降低特征维度并限制模型复杂度，从而缓解过拟合。以分类错误率和准确率作为性能评估指标，确定最优特征数量。
（3）随机森林（RF）：首先构建一个包含500棵树的初始随机森林模型，通过袋外分类误差率最小时所对应的树的数量确定最优参数，用于重新训练最终模型。所有其余超参数，包括每次节点分裂时的随机特征子集大小，均保持软件包默认设置。根据最终模型输出的基因重要性得分，按降序排列生成疾病特征基因集。最终的核心基因集合通过整合上述三种算法的结果取交集确定。
基于独立数据集的枢纽基因表达验证
采用两个独立的外部数据集 GSE104948 和 GSE96804 来验证核心基因的转录水平。基因表达数据集经过标准化处理；使用 R 语言的 ggplot2 和 ggsignif 工具包绘制糖尿病肾病病例与健康受试者之间的表达差异。
分子对接
枢纽靶点蛋白（CASP1，PDB ID：3E4C；CCL2，PDB ID：7S00）的三维构象从蛋白质数据库（Protein Data Bank）中获取。生物活性化合物的三维构象通过PubChem获取。选择熊果酸（ursolic acid）、3β-羟基乌苏-12-烯-28-酸（3β-hydroxyurs-12-en-28-oic acid）和槲皮素（quercetin）进行分子对接，因为网络药理学预测这些活性成分与核心靶点CCL2或CASP1之间存在相互作用。蛋白结构经预处理，去除天然配体和水分子，添加极性氢原子，随后使用AutoDock Vina进行分子对接。对接评分（单位为kcal/mol）所表示的结合亲和力用于评估相互作用的强度。设定−5.0 kcal/mol的结合能阈值以定义稳定的分子间相互作用。对接后的构象使用PyMOL进行可视化。
动物与实验设计
本研究使用了30只8周龄的雄性db/db小鼠，均为特定病原体阴性（SPF）级，同时使用了10只年龄匹配的雄性SPF级db/m小鼠。所有实验小鼠均饲养在SPF级动物设施中，光照周期为12小时光照-12小时黑暗，环境条件保持稳定：温度22 ± 2 °C，相对湿度50–70%，可自由摄取常规饲料和饮用水。所有体内实验方案均已获得安徽中医药大学动物伦理委员会的伦理批准（批准号：AHUCM-mouse-2023059）。
啮齿类动物在随机分组（每组6只）前进行为期7天的适应期，并接受8周的每日干预。对所有实验动物测定空腹血糖；采用随机数字表进行动物分组，组织学、免疫组化以及蛋白质印迹定量分析均在盲法评估下进行。
正常对照（CTL）组： db/m 小鼠通过口服灌胃给予生理盐水。
模型（M）组： db/db 小鼠通过口服灌胃给予生理盐水。
DJC中剂量（DJC-M）组： 接受0.78 g/kg DJC（相当于成人临床日剂量）的db/db小鼠。
DJC高剂量（DJC-H）组： 接受1.56 g/kg DJC（成人临床日剂量的两倍）的db/db小鼠。
给药制剂的制备
人到小鼠的剂量换算采用《药理学实验方法》中所述的体表面积归一化法进行，转换系数为9.1。DJC的临床日剂量为70 kg成人6 g（0.0857 g/kg），换算后得到小鼠等效剂量为0.78 g/kg（1倍临床剂量）和1.56 g/kg（2倍临床剂量）。所有小鼠均以10 mL/kg的恒定体积进行灌胃给药。精确称取DJC粉末，用0.5% CMC-Na溶液悬浮，配制成浓度分别为78 mg/mL（中剂量）和156 mg/mL（高剂量）的均匀混悬液。
连续给药8周后，使用1%戊巴比妥钠对所有实验小鼠进行麻醉。通过腹主动脉采集血液样本，离心后取上清液用于基于试剂盒的生化检测。使用代谢笼收集小鼠尿液样本。部分肾组织用4%多聚甲醛固定，用于苏木精-伊红（HE）染色和Masson染色。剩余肾组织经液氮速冻后于−80 °C保存，用于后续分析检测。
组织学分析
经4%多聚甲醛固定后，肾组织依次进行梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋，并切成4 µm连续切片，用于后续苏木精-伊红（HE）染色和马松三色染色。HE染色按照标准流程进行（脱蜡、复水、苏木精核染、酸性乙醇分化与返蓝、伊红复染、脱水、透明及中性树胶封片），以观察肾脏组织病理学改变。切片先用苏木精染色3分钟，再用伊红复染15秒。马松三色染色过程中，切片经脱蜡、复水后，依次进行染色、分化及乙酸显色分离，随后脱水、透明并封片，以评估肾组织胶原沉积及纤维化改变。采用明场显微镜在200×放大倍数下观察并拍摄所有染色切片。HE染色切片采用肾小球硬化指数（Glomerular Sclerosis Index, GSI）进行评分。对于马松三色染色，应用马松三色预设程序分离蓝色胶原通道，并计算胶原面积与红色染色组织面积的比值。
免疫组织化学（IHC）
组织样本经4%多聚甲醛固定24小时后，依次通过梯度乙醇脱水，随后进行石蜡包埋并连续切片至5 µm厚度。脱蜡后，切片进行抗原修复及内源性过氧化物酶阻断。阻断完成后，组织切片在湿盒中与稀释的一抗于4 °C孵育过夜。经PBS洗涤后，切片在室温下与二抗孵育，随后进行DAB显色反应，直至达到理想的染色强度。随后，切片依次进行苏木精复染、分化、蓝化、脱水、透明、封片，并进行明场显微成像。抗原修复通过高压灭菌处理10分钟实现，随后自然冷却至室温。用5%山羊血清在室温下封闭60分钟后，切片依次与一抗（1:200稀释）和HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:300稀释）在室温下各孵育60分钟。DAB显色反应在室温下进行3–5分钟，显微镜下监控反应进程，并通过蒸馏水冲洗终止反应。图像在×200放大倍数下采集，使用ImageJ软件定量分析阳性染色区域的百分比。
ELISA 检测
实验步骤遵循试剂盒供应商提供的官方方案。预先配制洗涤缓冲液和系列稀释的标准品。向空白孔、标准品孔和样本孔中加入试剂，并在避光条件下孵育。孵育结束后彻底洗涤酶标板，然后加入酶结合物并在避光条件下再次孵育。洗涤后加入显色底物，进行避光显色反应，当标准品孔中出现明显的蓝色梯度时，用终止液终止反应。使用酶标仪在目标波长下测定各孔的吸光度（OD）。根据标准品浓度的吸光度值绘制的标准曲线，定量血清中IL-1β和IL-18的浓度（血清样本未稀释；在450 nm波长下测定吸光度；每个样本设八个技术重复孔）。尿肌酐和24小时尿蛋白在使用24小时代谢笼收集的未稀释尿液样本中测定（在546 nm波长下读取吸光度；每份标本设八个技术重复孔）。
实时定量 PCR（RT-qPCR）
从肾组织中提取总RNA，并通过分光光度法测定其纯度和浓度。将纯化的RNA进行逆转录，以生成cDNA模板。在实时PCR仪上进行RT-qPCR，热循环程序如下：95 °C预变性5分钟，随后进行40个扩增循环：95 °C 15秒，60 °C 1分钟。RT-qPCR反应体系为10 µL，包含5 µL SYBR Green Master Mix、0.2 µL上游引物、0.2 µL下游引物、1 µL cDNA模板和3.6 µL无RNase水。cDNA合成的逆转录反应总体积为20 µL。通过熔解曲线分析确认扩增特异性，每个样本均设置三个技术重复。以β-actin为内参，采用2⁻ΔΔCq法对转录水平进行归一化分析，所有引物序列见表1。
Western印迹分析
从小鼠各组中采集约 40 mg 肾脏组织样本，在冰上剪碎后，用蛋白裂解缓冲液充分匀浆。4 °C 条件下以 12,000 rpm 离心 15 分钟后，收集组织匀浆液中含总蛋白的上清液，分装并保存于 −80 °C 冻存。将蛋白上清液与上样缓冲液混合后，在水浴中煮沸变性。每条泳道上样约 10 µL 经标准化处理的蛋白样品，在 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。目标蛋白通过湿式电转印法转移至硝酸纤维素膜上。转膜过程在冰浴中以恒定电流 400 mA 进行 30–45 分钟。转膜完成后，将膜在冷的脱脂牛奶中封闭 2 小时，随后在 4 °C 与 1:1,000 稀释的一抗孵育过夜。洗膜后，在 4 °C 与相应二抗（1:10,000 稀释）孵育 2 小时，使用 ImageJ 软件对印迹图像中的发光条带信号进行记录和定量分析。对于 GSDMD-N 的检测，选用 Tubulin 作为上样对照，因其预期分子量（约 35 kDa）与 GAPDH（约 36 kDa）重叠。所有 Western 印迹实验均进行了三次独立的生物学重复。
统计学分析
定量数据以均值 ± 标准差（SD）表示。两组之间的差异采用非配对 Student’s t 检验进行分析。 t检验，而多组间的比较则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）后接Tukey事后检验。p值 < 0.05 被视为具有统计学意义。
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DJC 生物活性成分及靶点鉴定
从组成DJC的六味中药中，共鉴定出66种符合筛选标准（OB ≥ 30% 且 DL ≥ 0.18）的生物活性成分，其中包括26种来自Pseudostellaria heterophylla的成分、6种来自Paeonia suffruticosa的成分、8种来自Cuscuta chinensis的成分、6种来自Alisma orientale的成分、10种来自Rehmannia glutinosa的成分，以及10种来自Whitmania pigra的成分。通过对靶点名称进行标准化处理并去除重复项，共获得599个与DJC相关的非重复候选蛋白靶点。我们构建了化合物-靶点相互作用网络图以展示这些相互关系(图1)。
与糖尿病肾...
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糖尿病肾病（DN）仍是终末期肾病（ESRD）的主要病因之一，其发病机制复杂且呈多因素性，目前尚未完全阐明20,21。尽管丹参滴丸（DJC）在改善DN方面已显示出良好的临床疗效，但其潜在的分子机制在很大程度上仍不清楚22。在本研究中，我们采用了一种整合网络药理学、机器学习工具、结合模拟实验和体内验证的多组学分析策略，以探究DJC的药理作用。这种多角度的研究方法使我们能够筛选潜在作用靶点，通过计算方法优先确定核心通路，并对关键结果进行实验验证，从而加强了探索性结论的科学基础。
初步的网络药理学分析确定了68个与DJC在糖尿病肾病（DN）中作用相关的潜在靶点，提示其具有典型的多靶点作用机制，这是中药（TCM）的显著特征23,24。随后的功能富集分析显示，这些靶点显著富集于炎症反应、细胞应激和...
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作由安徽省高校重点科研项目（资助号：2024AH050968）资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肌酐（CRE）检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | C011-2-1 | |
| ECL | Biosharp | BL520B | |
| 伊红染色试剂盒 | Servicebio | G1002 | |
| 山羊抗兔 IgG-HRP 标记二抗 | Abbkine | A21020 | |
| 苏木精染色试剂盒 | Servicebio | G1004 | |
| Masson 三色染色试剂盒 | Servicebio | G1006 | |
| 小鼠 IL-1β ELISA 检测试剂盒 | 美美生物 | MM-0040M1 | |
| 小鼠 IL-18 ELISA 检测试剂盒 | 美美生物 | MM-0169M1 | |
| 兔抗小鼠 Caspase1 抗体 | Affinity | AF5418 | |
| 兔抗小鼠 CCL2 抗体 | Abcam | ab315478 | |
| 兔抗小鼠 cleaved-Caspase-1 抗体 | Affinity | AF4005 | |
| 兔抗小鼠 GAPDH 抗体 | Zenbio | R380626 | |
| 兔抗小鼠 GSDMD-N 抗体 | Abcam | ab219800 | |
| 兔抗小鼠 NLRP3 抗体 | Abcam | ab263899 | |
| 兔抗小鼠 Tubulin 抗体 | Affinity | AF7011 | |
| 逆转录试剂盒 | Biosharp | BL696A | |
| RIPA 裂解缓冲液 | 碧云天生物技术 | P0013 | |
| RIPA 裂解缓冲液 | Leagene | PS0013 | |
| RNA 提取试剂 | Servicebio | G3013-100ML | |
| SYBR Green Master Mix | Servicebio | G3326-05 | |
| 尿蛋白定量检测试剂盒 | 南京建成生物工程研究所 | C035-2-1 | |
| 软件名称 | 版本 | ||
| AutoDock Vina | 1.2.3 | ||
| Cytoscape 软件 | 3.10.0 | ||
| GraphPad Prism | 9.0 | ||
| ImageJ | java 1.8.0_345 | ||
| PyMOL | 2.5 | ||
| R 软件 | 4.2.0 |
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