数字分析经内路小梁消融术中人眼荧光素前房角造影

摘要

本研究提出了一种标准化的开源工作流程，用于量化经内路小梁消融术中术中荧光素血管造影，可用于评估房水外流模式，并可能预测术后眼压变化的手术效果。

摘要

经内路小梁消融术（AbiC）是一种微创青光眼手术，旨在通过环形扩张施莱姆管来增强生理性房水外流。尽管荧光素染色造影已用于经外路小梁消融术术中以可视化外流路径，但其在AbiC术中的定量应用尚未得到评估。本研究提出了一种在AbiC术中对荧光素染色造影进行定量分析的标准化流程，旨在评估房水外流模式及其对手术预后的潜在预测价值。为此，在AbiC手术中使用荧光素染色的粘弹剂，并在术中采集早期和晚期的染色造影图像。我们开发了一个基于开源图像分析软件的逐步图像分析流程，用于量化结膜下荧光素染色情况。采用了三种互补的方法：围绕角膜设置同心圆环以测量环形染色强度、基于象限的节段性染色分析，以及针对可能的小梁网结构改变部位的局灶性染色模式的定性评估。典型病例显示，多个象限内广泛且均匀的荧光素染色与持续的眼内压降低及无需药物治疗相关，而染色范围有限且不均一的情况则出现在预后较差的眼中。因此，该流程能够实现对AbiC术中房水外流的可重复、定量评估，且无需具备图像分析专业知识，可用于预测微创青光眼手术的成功率。

引言

青光眼是一种具有进行性视神经病变的多因素疾病，也是全球范围内导致失明的最常见病因之一^1,2。目前已确定多种与青光眼发病机制相关的因素，包括筛板的结构易损性、眼部灌注受损、遗传因素以及自身免疫过程等，但唯一可调节的危险因素仍是眼内压升高（IOP）^3,4,5,6,7,8。最常见的亚型是原发性开角型青光眼（POAG），其特征是房水外流阻力增加，导致房水外流减少，从而引起长期的眼内压升高⁹。随着疾病进展，这将导致视网膜神经纤维层的丧失以及视野缺损。

目前有多种治疗策略可供选择，具体方案需根据青光眼的严重程度、病程以及测量的眼内压（IOP）来确定。如果局部使用降眼压滴眼液治疗无效或患者无法耐受，可进行激光治疗或手术干预^10,11。除了小梁切除术等传统滤过性手术外，目前还出现了多种风险较低的微创青光眼手术（MIGS）¹²。其中包括经内路房角切开术（AbiC），与经外路房角切开术不同，该术式无需切开巩膜或制作结膜瓣¹³。经内路手术是一种创伤显著更小的术式，且不会遗留缝线等异物。研究还表明，该术式的效果与经外路手术相当，但操作更为简便，并发症更少^14,15。AbiC的另一优势在于必要时可保留结膜组织，为未来的干预措施提供可能。

在本操作中，通过角膜切口评估前房后，在房角镜辅助下将微导管插入Schlemm管，切开小梁网并沿360°环形路径通过。黏弹剂可扩张Schlemm管及集液管开口，并可能引起小梁网的局灶性微小破裂¹⁶。这些效应被认为可通过降低传统外流途径中的阻力，并改善对集液管的通达性，从而促进房水外流，这符合眼部的解剖与生理特点，尽管其确切机制尚未完全阐明¹⁷。此外，AbiC可与白内障手术联合进行，从而提供额外的眼压降低效果。在此情况下，术中对外流途径的可视化观察可能间接反映小梁网及远端外流系统的功能状态。

经外路的管通成形术已与术中荧光素造影技术联合应用，以可视化房水流出通路^18,19,20。术中巩膜染色范围更广、房水流出改善更明显的患眼，在术后一年表现出更低的眼压。因此，术中造影可用于预测手术效果¹⁹。据我们所知，该方法是否同样适用于AbiC尚未经研究。本研究旨在评估在AbiC术中进行术中造影分析的工作流程。我们开发了该流程，用于量化结膜下荧光素染色在早期和晚期阶段的强度与范围。这是首次对AbiC术中荧光素标记黏弹剂作用效果的评估。

随后可以研究染色区域的定量结果与个体房水外流程度以及术后眼内压（IOP）降低程度或IOP降低药物使用量之间是否存在相关性。我们假设染色越强，即房水外流越明显，则眼内压降低幅度越大，药物使用量也越少。将按象限划分，以检验不同解剖位置的房水外流是否存在显著差异。

从长远来看，该研究流程将用于明确是否可以根据荧光素染色来预测AbiC手术的成功率，并且还可用于其他必要的外科治疗。

方案

伦理声明：

本研究遵循《赫尔辛基宣言》进行。由于本研究是对常规医疗实践中收集的患者数据进行的回顾性审查，因此被视为非干预性研究。研究未采用前瞻性的治疗方案，所有治疗均为标准医疗护理中的常规措施。波恩伦理委员会审查了研究方案，并基于其非干预性设计免除了知情同意要求（编号：2026-220）。在数据分析前，患者数据已进行去标识化处理。

1. AbiC 与术中导管造影

注意：使用基于微导管的管腔成形术系统对每只眼进行 AbiC 操作。以下步骤描述了该器械的使用方法。AbiC 可作为独立手术进行，也可在顺利的超声乳化白内障手术结束后一并实施。

1. 调整开睑器位置，使尽可能多的巩膜组织暴露，以便后续分析。
2. 使用局部麻醉剂，如盐酸丙美卡因。用碘伏对术眼进行消毒。给予球周麻醉。
3. 为所有患者标准化显微镜设置。
   注意：对于AbiC手术，将显微镜设置为20% LED光照、100%眼底反光、0%周围光照；对于房角成像（channelography），将显微镜设置为100% LED光照、0%眼底反光、100–0%周围光照。
4. 将上述设置应用于蔡司Lumera手术显微镜。其他型号显微镜的设置可能有所不同。
   注意：无论手术是单独进行还是联合其他手术，均采用颞侧入路。
5. 在距离颞侧手术位置约2个钟点处，创建一个或两个1.0 mm的侧切口，切口深度约为进入透明角膜1 mm。
6. 用粘弹剂填充前房。
7. 将患者头部向远离术者的一侧倾斜约30°角，同时将显微镜也倾斜约30°角。聚焦于周边虹膜组织，使前房角结构进入视野。
8. 将粘弹剂与荧光素染料混合。
   1. 使用无菌套管极其缓慢地将0.05 mL荧光素吸入粘弹剂中，使粘弹剂内部形成一个独立的空腔。
   2. 让荧光素扩散5–10分钟。
   3. 缓慢推动粘弹剂注射器的推杆，完全排出含荧光素的空腔内容物。
9. 用含荧光素的粘弹剂填充微导管装置。
10. 通过将微导管推出注射装置的尖端来测试设备是否通畅。
11. 在角膜表面涂抹羟甲基纤维素。经侧切口将AbiC微导管插入前房。将房角镜（如Swan-Jacob房角镜）置于角膜上。
12. 使用装置的尖端切开小梁网。使用装置上的蓝色执行按钮将微导管推进至Schlemm管内。
13. 在旋转粘弹剂注射器的同时，将微导管沿Schlemm管完成360°推进，并分12次注入每次2.5 µL的染色粘弹剂团注。
14. 每1个钟点位置注入一次2.5 µL的团注剂量。
15. 在回撤微导管360°的过程中，同时分12次注入每次2.5 µL的粘弹剂团注。
16. 将微导管从前房中取出。从眼球表面移除房角镜。
17. 将患者头部和显微镜重新调整至正中位置，以获得标准化的正视眼图像。冲洗角膜以去除染料和羟甲基纤维素。
    注意：如有必要，使用棉签清除任何表面染色，避免将表层着色误判为病理改变。
18. 切换至蓝光滤镜。使用视频或系列照片记录房角成像的早期相。
19. 放大视野以尽可能多地观察巩膜组织，并确保图像聚焦清晰。
20. 完成后，关闭蓝光滤镜。
    警告：使用双手操作的灌注/抽吸探头从前房中清除粘弹剂。在整个操作过程中持续用平衡盐溶液灌注前房，直至侧切口闭合，以防止血液反流。
21. 向眼前房内注射头孢呋辛。
22. 重新开启蓝光滤镜，在早期相拍摄后约2分钟，使用视频或系列照片记录房角成像的晚期相。
23. 放大视野以尽可能多地观察巩膜组织，并确保图像聚焦清晰。
24. 关闭蓝光滤镜，并在结膜下注射地塞米松。

2. 图像导出与数据存储

1. 从您的显微镜软件 Zeiss Forum 下载图像。
2. 在显微镜软件中打开对应患者编号的患者文件夹，并使用“导出”按钮将图像保存至选定的文件夹。
3. 将导出的图像分别归入早期相和晚期相文件夹。
4. 按照“患者编号_眼别_图像编号”的格式为每幅图像命名，并以 JPEG 格式保存图像。

3. 利用FIJI定量分析结膜下流出

注意：将此工作流程应用于通道图谱的早期和晚期阶段。

1. 在 FIJI 中加载通道图像²¹（开源图像分析软件）。裁剪图像，使仅手术眼可见。使用“矩形”工具绘制一个矩形矩形工具”并选择“图像 > 作物” 从菜单中。
2. 使用“白对白”角膜直径在图像上进行绘制直线工具。从鼻侧到角膜缘外侧水平测量。使用术前生物测量已知的角膜直径，将角膜白色到白色直径设定为标尺 分析 > 设置比例尺 > 已知距离（单位)”.
3. 使用“多边形工具” 使用至少24个点标记角膜与巩膜之间的边界。如有必要，可回顾手术视频或其他时相的图像，以更准确地识别角膜边缘。在早期时相，可利用结膜血管和小梁微破裂基底部等解剖标志进行定位。
4. 按压“T” 键盘上的“ 或选择“图像 > 覆盖 > 到 ROI 管理器”打开 ROI 管理器，并将角膜标记保存为 ROI。如有需要，保存图像以供后续分析。
5. 按压“删除” 键盘上的按钮或选择“ROI 管理器 > 更多 > 填充”以切除角膜。
   注意：确保裁剪区域显示为黑色。如有必要，使用“颜色选择器”工具。
6. 使用“将静态图像转换为二值黑白图像颜色阈值”工具在“图像 > 调节”。打开工具后，选择“默认”作为阈值分割方法，“黑色 & 白色” 作为阈值颜色，以及 “HSB”作为颜色空间。取消勾选“刻度”选项。通过” 每个设置的框以及从 “暗背景”盒
7. 确保白色区域与荧光粘弹剂显示的黄色染色相对应。如有必要，可使用“颜色选择器”工具。
8. 使用以下三种设置选项之一对二值化图像进行标准化，以提高图像间的可比性。
   1. 为整个患者群体设置完全标准化的参数时，将上方选项设置为““色相” = 140，“饱和度” = 205，“亮度” = 205. 将下部横杆设置为“色相”、“饱和度”和“亮度” = 255.
   2. 对于部分标准化设置，请选择上方的横条“色调”分别进行，并设置上杆““饱和度”和“亮度” = 255。将下方的“色相”、“饱和度”和“亮度”均设为 255。
   3. 对于完全自定义的设置，可为每幅图像单独选择上方工具栏中的各项设置。设置下方工具栏的“色调、饱和度和亮度” = 255.
9. 使用二值化图像与原始图像进行比较 “堆栈” 功能或直接比较。
10. 为部分标准化和完全自定义设置选择一个最小化设定，该设定应能代表染色较浅的区域，同时避免强染色区域的过度呈现。如有必要，删除光线反射或表面染料。使用“多边形工具”，然后按 “Del” 或选择 “ROI 管理器 > 更多 > 填充”.
11. 在“填充颜色”下选择黑色图像 > 颜色 > 颜色选择器以避免将裁剪区域误计为染料。
12. 将图像类型更改为 32 位 通过“图像 > 类型”。通过“”来标准化设置过程 > 增强对比度”，并设置 饱和像素百分比 = 0.35%.
13. 使用下述方法1、方法2或方法3定量测量房水外流的量。
    1. 量化方法一：角膜外全周区域中荧光素染色所占百分比
       注意：使用此方法记录角膜外环形区域总面积极的荧光素染色百分比。
       1. 根据图像切面和眼睑开合的宽度，在先前绘制的角膜分界线周围投射三个环，每个环宽1 mm。
       2. 在ROI管理器中选择角膜标记，然后选择“编辑 > 选择 > 制作条带：1”.
       3. 获取第一环中染色区域的百分比。选择“分析 > 设置测量 > 平均灰度值 > 好的”，然后按“Ctrl + M” 键盘上的“ 或选择“分析 > 测量”.
       4. 记录打开的表格中的数值。
       5. 按压“T” 键盘上的按钮或选择“图像 > 叠加 > 到 ROI 管理器”以将第一个环保存到ROI管理器中。
       6. 使用2个或3个单位作为环的延伸，从角膜标记处或从前一个已绘制环的1个单位处开始，对第二和第三个环重复步骤3.13.1.2至3.13.1.5。
       7. 检查原始图像，确认环状组织仅包含结膜。
       8. 将二值化图像保存为“文件 > 另存为 > Tiff”，并使用格式“患者ID_阶段_环形
       9. 通过“保存相应的结果文件 > 另存为”，并相应命名。
       10. 单击“保存相应的 ROI 管理器”取消选择”，然后“更多 > 保存”，并相应命名。
    2. 定量方法2：基于象限的染色百分比分析
       注意：使用此方法可分别对每个象限的染色百分比进行分析。
       1. 在开始象限分析之前，完成步骤 3.1–3.13.1.10。
       2. 使用“绘制一个矩形矩形工具使其恰好代表图像的一半。
       3. 按压“删除” 键盘上的按钮或选择“ROI 管理器 > 更多 > 填充使得只有一半的图像保留下来。
       4. 绘制第二个矩形，表示剩余图像的一半。
       5. 按压“删除” 键盘上的按钮或选择“ROI 管理器 > 更多 > 填充” 再次执行，使得原始二值化图像的四分之一区域保留。
       6. 即使所选角膜并非完全圆形，也应先将其分为两个完全相等的半圆，再尝试确定一个面积尽可能接近0.25的象限。
       7. 取消选择 通过 ROI 管理器从第一种方法获得的三个环。
       8. 点击“更多 > 多参数检测 > 每切片一行以确定染色比例。
       9. 记录打开的表格中的结果。
       10. 对剩余的三个象限重复步骤 3.13.2.2 至 3.13.2.9。
       11. 将所有二值化的象限图像保存在“文件 > 另存为 > Tiff”，并使用格式“患者编号_阶段_象限”.
       12. 通过“文件 > 另存为”，并相应命名。
       13. 单击“保存相应的 ROI 管理器”取消选择”，然后“更多 > 保存”，并相应命名。
    3. 定量方法3：局灶性染色模式分析以对应局部小梁网结构改变
       注意：使用此方法评估可能对应于小梁网局部改变的局灶性染色模式。在施莱姆管内推进导管时，可能会导致小梁网内壁发生微小破裂，并影响小梁网内壁向集液管开口处的疝出。因此，应使用此方法分析早期相图像。
       1. 完成步骤 3.1 至 3.4。
       2. 点击“编辑 > 制作倒置图像”.
       3. 按压“删除” 键盘上的按钮或选择“ROI 管理器 > 更多 > 填充”以切除巩膜组织，仅分析位于角膜环内的小梁微破裂。
       4. 确保角膜环外区域为黑色。如有必要，使用“颜色选择器”工具。
       5. 在 ROI 管理器中首先选择角膜 ROI，然后在其内部绘制一个稍小的环形区域。
       6. 点击 编辑 > 选择 > 放大 > -0.2以便在角膜环内出现一个窄0.2 mm的环状结构。
       7. 按压“T” 键盘上的“ 或选择“图像 > 覆盖 > 到 ROI 管理器”.
       8. 点击“编辑 > 选择 > 制作胶带 > 0.2以便出现一个宽0.2 mm的环。
       9. 将此环置于角膜环上，以提供外边界，从而仅可分析两环之间的区域。
       10. 按压“T” 键盘上的“” 以将环形区域保存为感兴趣区域（ROI）。
       11. 打开“图像 > 调节 > 颜色阈值”以检查阈值设置。
       12. 使用部分标准化的设置。选择上方工具栏的“色调”分别设置上杆“饱和度” 和 “亮度” = 255，并设置下限值“色调，饱和度”，以及“亮度” = 255.
       13. 选择颜色设置，使颜色填充内环中显示小梁断裂的区域。
       14. 确保染色区域在二值化图像中呈现为白色。
       15. 如有必要，删除伪影及穿刺部位。使用“多边形工具”，然后按“删除”.
       16. 选择黑色作为“填充颜色”图像 > 颜色 > 颜色选择器以避免将裁剪区域误计为染料。
       17. 点击“更多 > 多参数检测 > 每切片一行”.
       18. 记录打开的表格中的结果。
       19. 将二值化图像保存在“文件 > 另存为 > Tiff”，并使用格式“患者ID_阶段_微破裂”.
       20. 通过“文件 > 另存为”，并相应命名。
       21. 通过点击“保存相应的 ROI 管理器”取消选择”，然后“更多 > 保存”，并相应命名。
14. 用于数据汇编时，打开一个 Excel 电子表格。
15. 将所有先前收集的结果表格复制到一个电子表格中。
16. 对于象限分析结果，将每个数值乘以四，以便数值代表完整图像中的染色情况，并可与其他方法进行比较。

图1展示了工作流程的概览。

图1：用于量化经内路小管成形术（AbiC）后房水外流的实验流程示意图。该流程包括术中荧光素管路造影图像采集、使用开源图像分析软件进行图像处理、图像的二值化与标准化，以及对荧光素染色模式的定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

纳入年龄超过18岁、诊断为青光眼并接受过单独小梁消融术（AbiC）或联合白内障手术的患者。此外，必须至少具备早期或晚期的通道造影图像。与其它青光眼手术不同，既往接受过选择性激光小梁成形术不作为排除标准。此外，本研究未纳入患有晚期青光眼损害的患者。

截至目前，在2022年3月至2024年6月期间的分析中，我们共纳入了62例患者的86只眼。其中，82只眼接受了小梁消融术联合白内障手术。本文报告了两只眼的代表性结果，一例为荧光素染色明显，另一例染色较局限（图2）。第一位患者手术时年龄为63岁，术前接受含两种活性成分的局部降眼压药物治疗，术前眼压为20 mmHg。AbiC术后即刻进行荧光素管路造影显示，三个同心圆环及四个象限均呈现明显染色。对各环的分析显示，第二环染色比例最高，达88.1%（第一环为87.9%，第三环为85.2%）。各象限的检测结果显示，颞上象限染色比例最高，为94.4%（其他象限分别为：TI 93.6%、NS 93.9%、NI 66.4%）。术后18个月眼压成功降至14 mmHg，术后24个月为15 mmHg。相...

讨论

本工作流程提供了使用开源图像分析软件量化AbiC术后房水流出量的逐步操作指南。开源图像分析软件的功能提供了易于使用的模板，无需任何编程知识，临床医生在无技术支援的情况下亦可应用。该方法将有助于评估AbiC术后房水流出情况，以探讨其对手术预后的潜在预测价值。该工作流程并非直接的功能性测量，而是旨在系统性地表征术中荧光素分布模式，并实现不同病例间的可重复比较。应特别注意显微镜的对准、标准化照明设置、图像居中以及角膜边界的准确定义，因为这些因素会显著影响定量分析的可重复性。我们长期目标是确定术后眼压（IOP）的更大程度降低是否与通道造影期间更高的荧光素流出量相关。

多年来，许多研究聚焦于使用荧光素对房水引流系统进行成像^19,22,23,24。将荧光素直接注射至施莱姆管（本研究中在AbiC手术期间进行）的优势在于仅需少量荧光素即可实现对...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
平衡盐溶液	Bausch & Lomb	货号：BL705004
双手操作灌注/抽吸探头	Zeiss	货号：303060-0165-000
头孢呋辛	Laboratoires Théa	药品编号：09755705	由药房预先配制
地塞米松	Dr. Winzer	药品编号：02192162
FIJI（ImageJ）	不适用	不适用	开源图像分析软件
荧光素染料	Alcon	药品编号：01467007
Healon Pro 粘弹剂	Johnson & Johnson	货号：10-3100-12
羟甲基纤维素	Johnson & Johnson	货号：10310012
碘溶液	Mundipharma	药品编号：03930490
iPrism S 房角镜透镜	Glaukos	货号：OTB/LH-2
iTrack Advance 小管成形术系统	Nova Eye Medical	货号：Track-ADS	基于微导管的小管成形术系统
Lumera 700 手术显微镜 + Calysto	Zeiss	货号：6726521526	眼科手术显微镜
盐酸丙氧麻黄酮	PUREN Pharma GmbH & Co. KG	药品编号：11055866
无菌套管针	Braun	货号：4657683