本研究结合大鼠眼压升高模型以及在人巩膜成纤维细胞中进行的体外机械应变、激动剂/抑制剂和siRNA实验，证明Piezo1的表达在巩膜细胞外基质重塑过程中升高，并在功能上参与了肌成纤维细胞的分化。
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研究文章
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本研究结合大鼠眼压升高模型以及在人巩膜成纤维细胞中进行的体外机械应变、激动剂/抑制剂和siRNA实验，证明Piezo1的表达在巩膜细胞外基质重塑过程中升高，并在功能上参与了肌成纤维细胞的分化。
机械应变诱导的肌成纤维细胞分化是青光眼中小梁细胞外基质（ECM）重塑的关键机制。然而，机械应变在巩膜成纤维细胞内转化为生化信号的过程仍不明确。本研究旨在探讨Piezo1在机械应变诱导的巩膜ECM重塑过程中对细胞增殖与分化的作用。研究设计结合了一周大鼠高眼压模型的体内表达观察，以及在原代人巩膜成纤维细胞（HSF细胞）中进行的体外力学机制实验，后者包括周期性机械拉伸（10%拉伸幅度，0.5 Hz，最长24小时）和Piezo1的药理学调控（激动剂Yoda1、抑制剂GsMTx4及siRNA敲低）。研究结果显示，Piezo1在巩膜组织和HSF细胞中均有表达。在体内实验部分，高眼压大鼠巩膜中Piezo1蛋白水平在一周后显著升高，同时伴随Ⅰ型胶原（COL1）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达上调。在体外实验中，机械拉伸（8–24小时）可上调HSF细胞中Piezo1的表达。此外，使用Yoda1激活Piezo1（24小时）可促进HSF细胞增殖，并增强α-SMA和COL1的表达；相反，敲低或抑制Piezo1则会抑制COL1表达，并阻碍机械应变下的肌成纤维细胞分化。此外，Piezo1的激活导致Yes相关蛋白（YAP）表达上调，而敲低或抑制Piezo1则减弱了机械应变诱导的YAP表达。综上所述，本研究结果提示Piezo1在青光眼背景下参与调控机械应变诱导的巩膜关键ECM成分的表达，可能成为潜在的治疗靶点，但仍需进一步的体内验证。
青光眼是全球不可逆失明的主要原因，其特征是视网膜神经节细胞（RGCs）和视神经乳头（ONH）轴突进行性退变，2020年全球约有7600万人受此影响1,2眼内压升高是青光眼最重要的危险因素3 目前，降低眼压是延缓青光眼发生和进展的唯一有效手段4视神经乳头（ONH）是视网膜神经节细胞（RGC）轴突离开眼球的结构，也是青光眼中主要的损伤部位。眼内压（IOP）升高会在ONH处引起机械应变和位移，导致筛板（LC）内RGC轴突发生退变，最终引发青光眼性视神经病变。5,6.
视盘周围巩膜（PPS）是视神经乳头（ONH）主要的承重组织，其力学特性决定了ONH对眼内压（IOP）引起的机械应变的响应7,8。有限元建模和离体研究表明，筛板（LC）的生物力学应变依赖于巩膜的刚度，而PPS刚度的增加有助于降低LC中的应变9,10。因此，PPS刚度11,12和厚度13的变化可改变ONH与IOP相关的生物力学特性，进一步影响视神经对青光眼性损伤的易感性14,15。在生物力学研究中，青光眼患者死后人眼的巩膜眼刚度高于正常巩膜16,17，且在人类青光眼以及实验性动物模型中均一致观察到视盘周围巩膜的硬化现象18,19,20。这些数据提示，巩膜硬化可能是一种保护性反应，通过减少青光眼期间IOP引起的ONH形变而发挥作用。
巩膜组织的生物力学特性源于成纤维细胞合成的细胞外基质的组成21。最近的研究表明，由眼内压（IOP）升高引起的机械应变能够激活巩膜内驻留的巩膜成纤维细胞22，促进肌成纤维细胞分化23，并导致细胞外基质（ECM）重塑24,25。机械应变诱导的肌成纤维细胞转化是青光眼过程中巩膜ECM重塑的关键环节，但目前尚不清楚机械应变是如何在巩膜成纤维细胞中转化为生化信号和细胞反应的。
Piezo1 是一种新型非选择性阳离子机械敏感通道家族的成员之一，参与包括心脏、肺和皮肤在内的多个器官的纤维化过程26,27。机械应变可激活细胞中的 Piezo1 通道，导致 Ca2+ 内流增加28，从而通过钙依赖性信号通路调控多种细胞活动，包括成纤维细胞的增殖、迁移和分化29,30。近期研究表明，在机械应变条件下，Piezo1 通过促进成纤维细胞的增殖、迁移和分化，推动皮肤纤维化过程31。本研究包含两个互补部分：一是在大鼠高眼压模型中对 Piezo1 表达进行描述性的体内研究，二是在原代人巩膜成纤维细胞上施加周期性机械应变的机制性体外研究。我们假设机械应变可激活 Piezo1，进而促进巩膜成纤维细胞向肌成纤维细胞分化以及细胞外基质成分的表达，这一过程可能通过 YAP 信号通路介导。
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雄性Sprague-Dawley大鼠（8周龄）来自复旦大学附属儿童医院实验动物中心。所有大鼠均自由进食饮水，在22±1 ℃、12小时昼夜循环的SPF条件下饲养。所有动物实验均遵循ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用的规定，并经复旦大学附属儿童医院机构审查委员会和伦理委员会批准（2022JS-EKYY-019）。用于分离原代人巩膜成纤维细胞的人体巩膜组织，根据机构指南从供体巩膜获取，所有相关操作均经复旦大学机构审查委员会批准（2024-YS-187）。
实验设计
本研究采用体内和体外方法，通过机械应变这一共同概念，探讨Piezo1在巩膜细胞外基质重塑中的作用。在体内实验中，我们利用大鼠高眼压模型检测眼内压升高条件下Piezo1的表达情况。在体外实验中，我们对原代人巩膜成纤维细胞施加周期性机械拉伸，以模拟青光眼状态下巩膜所受的机械应变，并通过药理学激动剂（Yoda1）、抑制剂（GsMTx4）以及siRNA敲低手段调控Piezo1活性。
实验性慢性眼高压（OHT）模型
共使用18只雄性SD大鼠。在每只大鼠中，右眼注射卡波姆以诱导眼内高压（OHT），对侧左眼作为对照组（NT）。整个实验独立重复三次，每组共18只眼。实验单位为单个眼睛。进行眼压（IOP）测量和蛋白质印迹分析的研究人员对分组情况设盲。
按照先前所述方法在大鼠中建立实验性慢性高眼压模型25。简言之，使用10%水合氯醛对大鼠进行麻醉，经托吡卡胺散瞳后，将0.3%卡波姆溶液（20 µL）注入眼前房。使用盐酸氯四环素预防感染。在造模后第3天和第7天使用回弹式眼压计测量眼压。模型建立一周后采集巩膜组织。
巩膜组织的分离方法如前所述25。麻醉后，经心脏灌注含4%甲醛的PBS溶液。去除眼球周围多余的眶内组织，小心移除眼前段结构（角膜、虹膜、晶状体）以及玻璃体。从巩膜内壁轻轻刮除视网膜和脉络膜。收集后部巩膜组织，并通过病理学H&E染色进行鉴定。
细胞培养
原代人巩膜成纤维细胞（HSF细胞）是一种先前建立的人供体巩膜来源的细胞系32每个实验均使用三个独立的生物学重复（来自三位不同供体的细胞）。HSF细胞在DMEM培养基中培养，培养基中添加15%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，培养条件为标准环境（37 °C，5% CO₂，湿润 atmosphere）。每四天传代一次，所有实验均使用第5至第9代之间的HSF细胞。通过免疫荧光检测I型胶原和α-平滑肌肌动蛋白细胞标志物对HSF细胞进行鉴定确认。
机械刺激的应用
采用循环机械拉伸系统产生机械性循环拉伸。人皮肤成纤维细胞（HSF细胞）以2×105 cells/mL的接种密度接种于底部涂有胶原蛋白的六孔板中。拉伸组细胞接受10%幅度、0.5 Hz频率的循环拉伸，具体参数如我们先前研究所述32。接种于拉伸板中但未施加拉伸的细胞作为静态对照组。Piezo1 siRNA敲低实验：在机械拉伸前，细胞预先转染Piezo1 siRNA或阴性对照siRNA，持续48小时。转染完成后，细胞接受24小时循环机械拉伸。实验共设四组：（A）转染对照siRNA且无拉伸的细胞；（B）转染对照siRNA并施加拉伸的细胞；（C）转染Piezo1 siRNA且无拉伸的细胞；（D）转染Piezo1 siRNA并施加拉伸的细胞。Piezo1抑制剂（GsMTx4）实验：在机械拉伸前及拉伸过程中，细胞用5 µM GsMTx4处理。实验共设四组：（A）未经处理且无拉伸的细胞；（B）未经处理但施加拉伸的细胞；（C）经GsMTx4处理且无拉伸的细胞；（D）经GsMTx4处理并施加拉伸的细胞（GsMTx4全程存在）。Piezo1激动剂（Yoda1）实验：细胞在含5 µM Yoda1的培养基中培养24小时。实验设两组：（A）未经处理（溶剂对照）的对照组；（B）经Yoda1处理的细胞。
蛋白质印迹法
采用Western印迹法按照常规步骤检测蛋白水平。简言之，使用RIPA缓冲液裂解巩膜组织或培养的成纤维细胞样本。取20 µg蛋白进行SDS-PAGE分离，随后转至硝酸纤维素膜上。将膜在常温下用5% BSA封闭1小时，然后在4 °C下与相应的一抗抗体孵育过夜。所用抗体包括Piezo1、I型胶原、α-平滑肌肌动蛋白、YAP和GAPDH。Piezo1抗体已由生产商验证可用于大鼠和人组织的Western印迹及免疫荧光实验，产品说明书提供了基因敲除/敲低的验证数据。用TBST缓冲液洗涤三次后，将膜与相应的HRP标记的二抗（抗兔或抗鼠）在室温下孵育1小时。使用图像分析软件测定条带强度，并将每个目标条带的信号相对于同一泳道的GAPDH信号进行归一化处理。最终数据以相对于对照组条件的倍数变化形式呈现。
细胞增殖
按照提供的说明书，通过比色法活力检测评估细胞增殖。向每个孔中加入四唑化合物（10 µL/mL），在标准培养条件下（37 °C，5% CO2）孵育 2 小时。随后在 450 nm 处测定吸光度。
小干扰RNA 转染
Piezo1 siRNA 转染操作按先前所述方法进行31。序列如下：Piezo1-siRNA，5’-AGAAGAAGAUCGUCAAGUATT-3’（正义链）和 5’-UACUUGACGAUCUUCUUCUTT-3’（反义链）；阴性对照（NC）siRNA，5’-GUGAGCGUCUAUAUACCAUTT-3’（正义链）和 5’-AUGGUAUAUAGACGCUCACTT-3’（反义链）。
免疫荧光
进行免疫荧光染色时，培养的细胞用4%多聚甲醛固定（20分钟，室温），0.1% Triton X‑100透化处理（40分钟），然后用10% BSA封闭。组织切片在4%多聚甲醛中室温固定过夜，随后进行透化和封闭。标本与抗Piezo1和抗α‑SMA的一抗孵育。接着使用荧光染料标记的二抗：绿色标记的抗小鼠抗体（针对α‑SMA）和红色标记的抗兔抗体（针对Piezo1），稀释比例均为1:500。细胞核用DAPI复染，图像使用荧光显微镜采集。
激动剂和抑制剂处理
根据先前的研究33，HSF 细胞用 5 µM GsMTx4 和 5 µM Piezo1 激动剂 Yoda1 进行处理。
统计学分析
每个实验均重复三次。结果以均值 ± 标准差（SD）表示。两组之间的比较采用双尾 Student t 检验。多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验。数据的正态性通过 Shapiro-Wilk 检验进行检验，方差齐性通过 Levene 检验进行评估。统计学显著性定义为 p < 0.05。所有统计分析均使用专用的统计软件进行。
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Piezo1 在大鼠巩膜组织和 HSF 细胞中表达
首先，我们检测了大鼠巩膜组织（体内）和培养的人巩膜成纤维细胞（体外）中 Piezo1 的表达。为探究 Piezo1 的组织特异性表达，使用了 BioGPS 基因注释数据库34。BioGPS 分析显示，Piezo1 在多种眼组织中高表达，包括视网膜色素上皮、虹膜、角膜和眼杯（图 1A）。在体内实验中，免疫荧光证实了 SD 大鼠巩膜组织中存在 Piezo1 表达（图 1B）。在大鼠巩膜组织以及体外培养的 HSF 细胞中，均观察到 Piezo1 与 α-SMA 的共定位，表明 Piezo1 在巩膜成纤维细胞中表达（图 1B）。
在慢性眼高压（OHT）模型中巩膜Piezo1表达增加
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眼内压（IOP）升高会在视神经头和筛板处引起机械应变，从而导致视网膜神经节细胞退化38,39。乳斑周巩膜（PPS）是影响视神经头（ONH）生物力学的主要承重组织40。既往研究表明，机械应变可诱导巩膜成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，并引起细胞外基质（ECM）重塑，进而导致巩膜硬化41。由眼内压相关机械力诱导的细胞外基质重塑可能是青光眼治疗的一个有前景的靶点，但机械力诱导细胞外基质重塑的分子机制尚未完全阐明。眼内压在眼球壁内产生流体静压力和壁张力（拉伸）。在本研究中，我们选择使用Flexcell系统施加周期性机械拉伸，因为该方法可单独分离出眼内压诱导的机械负荷中的拉伸组分，并能精确控制应变的幅度、频率和持续时间。
我们承认，基质硬度作为一种重要的力学信号，可通过细胞与基质之间的相互张力（细胞对基质的牵拉）影响细胞行为，但在本实验中并未被独立调控。Flexcell 系统主要向黏附...
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作者声明不存在任何竞争利益。
本工作得到国家自然科学基金（项目编号：82401257）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.3% 卡波姆溶液（卡波姆 940 聚合物） | Solarbio, 上海, 中国 | — | 20 μL |
| 10% 水合氯醛 | Macklin, 上海, 中国 | — | 3 mL/kg |
| Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠二抗 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| Alexa Fluor 594 标记的山羊抗兔二抗 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | — | |
| BioFlex 六孔培养板（包被 I 型胶原） | Flexcell Int Corp, Hillsborough, NC, USA | — | |
| 盐酸金霉素 | 震华制药, 云南, 中国 | — | |
| COL1 一抗 | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| DMEM | Gibco, Grand Island, NY, USA | — | |
| FBS | Gibco Life Technologies, 澳大利亚 | — | |
| GAPDH 一抗 | Bioworld, MN, USA | — | |
| GraphPad Prism 8.4 版 | Inc., San Diego, CA, USA | — | |
| Nikon Eclipse E800 显微镜 | Nikon, Melville, NY, USA | — | |
| 硝酸纤维素膜 | Pierce, Rockford, IL, USA | — | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone, South Logan, UT, USA | — | |
| Piezo1 一抗 | Novus Biologicals, CO, USA | — | |
| 回弹式眼压计（TonoLab） | Icare, Espoo, 芬兰 | — | |
| RIPA 裂解液 | Thermo Fisher Scientific, 上海, 中国 | — | |
| Flexcell FX-5000 张力系统 | Flexcell International Corporation | — | 用于对 HSF 细胞施加机械性周期性拉伸。 |
| 托吡卡胺 | Bausch Lomb Freda, 山东, 中国 | — | |
| YAP 一抗 | Cell Signaling Technology, Danvers, USA | — | |
| α-SMA 一抗 | Abcam, Cambridge, 英国 | — |
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