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通过IntelliCage测试系统实现群养小鼠的自动化操作性间歇饮酒

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DOI：

10.3791/71345

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2026年6月5日

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1Section on Neurobiology of Compulsive Behaviors, National Institute on Mental Health, Intramural Research Program, National Institutes of Health

本文内容

摘要

本方案介绍了通过IntelliCage测试系统对群居小鼠的饮酒行为进行高通量、自动化评估的方法。文中提供了一种操作性间歇饮酒范式的详细方法学，以及用于分析所得数据的实验文件和代码。

摘要

尽管已知社会隔离会对啮齿类动物行为产生混杂影响，许多研究人员仍依赖单只饲养小鼠来评估酒精使用障碍（AUD）临床前模型中的酒精偏好。本方案描述了一种社会性酒精摄取任务，可在无需承受社会隔离所致应激干扰的情况下，实现对小鼠酒精摄取行为的高通量、自动化评估。IntelliCage测试系统使研究人员能够同时评估最多16只同性别小鼠的操作式饮酒行为，每只小鼠均通过皮下植入的射频识别（RFID）应答器进行唯一标识。对饮水管的访问由软件控制，并可针对每只小鼠单独调节。在此慢性间歇性饮酒范式中，小鼠在连续六周内自发进行操作式鼻触以获取含有20%酒精的饮水管。酒精瓶每隔一天开放一次，每次持续24小时，也可选择性添加奎宁以评估对惩罚不敏感的饮酒行为。每只小鼠对各个操作角落的访问次数、鼻触行为及舔舐数据均被自动记录。详细的实验方法及用于分析记录数据的开源代码将帮助研究人员以日益高效且符合生态学相关性的方式评估与酒精使用障碍（AUD）相关的饮酒行为。

引言

在临床前模型中开展的研究对于深入理解酒精使用障碍（AUD）相关行为背后的神经生物学机制至关重要。然而，目前许多用于啮齿类动物饮酒行为的传统测量方法，例如双瓶选择1,2和暗期饮酒3,4,5实验，均需对单只饲养的动物进行液体体积的人工测量，这种方法通量低且容易出错。近年来，采用电容式6,7,8,9,10或光电式11,12技术的开源舔水监测系统被广泛应用于自动记录舔水次数，显著提升了饮酒行为研究方法的通量、准确性和技术灵敏度。然而，大多数笼内舔水监测系统仍要求啮齿类动物单只饲养，从而引发隔离应激13,14。尽管已有报道的研究结果存在较大差异15,16，但总体而言，单只饲养的啮齿类动物通常对酒精具有更高的偏好17,18,19,20。然而，社会隔离对饮酒行为的影响会因动物年龄、性别、饲养环境以及既往应激暴露情况的不同而有所差异20,21,22。社会隔离可能与实验干预产生显著交互作用，从而限制所评估的AUD样行为结果的有效性。

新型全自动笼内监测系统，例如 IntelliCage 测试系统（TSE Systems23,24,25）或开源替代方案 LIQ PARTI20 和 FARESHARE26，通过将舔舐测量技术与射频识别（RFID）技术相结合，实现对群养动物中多只个体的追踪，从而解决了这一问题。这些笼内监测系统能够在不引入社会隔离所致应激干扰的情况下，更高效、更可重复地量化酒精摄取行为，因此非常适合用于高通量、确证性研究，以探究影响类似酒精使用障碍（AUD）行为易感性的实验干预措施。其中，IntelliCage 测试系统具有独特优势，其配备可编程的操作式角落，可控制饮水瓶的获取权限，从而允许研究人员在无药物可获得的情况下评估觅药行为，调节单个动物的操作比率等。

本文作者介绍了一种通过IntelliCage测试系统在群养小鼠中实施的操作性间歇饮酒范式27,28。该范式可对最多16只同性别小鼠进行长期、自动化的饮酒行为评估，每只小鼠通过皮下植入的RFID应答器进行唯一识别。如下所述，小鼠被训练以操作性鼻触固定比率（FR）-3的方式获取饮水管中的液体。经过短暂的训练期后，四个操作性角落中两个角落的饮水管被替换为20%酒精（95%乙醇[190 proof]溶于自来水，v/v）。小鼠可持续获得饮水，但每隔一天提供一次酒精，每次持续24小时（12:30 PM至次日12:30 PM）。在为期六周的实验过程中，记录小鼠的舔酒次数，并在实验中途进行为期两天的奎宁掺杂测试（0.5 mM，1.0 mM），以评估对惩罚不敏感的饮酒行为。每次访问、鼻触及舔水/酒数据均被记录于每只小鼠（图1），使用TSE公司的专有软件提取，并通过开源分析流程29进行后续分析，从而获得与酒精使用障碍（AUD）类似行为相关的深入信息。

本方案补充了其他已发表的IntelliCage测试系统的应用，用于评估类似酒精使用障碍（AUD）的行为30,31,32,33,34,35,36,37,38,39，以及其他类似物质使用障碍的行为40,41,42。与已有报道一致，间歇性获取模式可增加啮齿类动物对酒精的自愿摄入量1,43,44,45,46,47，本方案在大多数小鼠中均可实现较高水平的自愿饮酒行为。然而，正如作者在方案中多次指出，实验参数可根据具体研究问题进行灵活调整。总体而言，该方法为研究人员探究酒精使用障碍（AUD）的潜在机制提供了一种高效且灵活的解决方案。

小鼠 RFID 转换器植入示意图：识别、操作性接触、电容式舔舐记录仪。
图 1：通过唯一 RFID 识别全自动追踪小鼠的访问、鼻触和舔舐行为。（A）小鼠 RFID 转换器植入的示意图。RFID 转换器被皮下植入于颈背部区域，以在自动化家笼监测系统中实现个体追踪。（B）自动化操作性间歇饮酒范式中数据采集阶段的示意图。通过双 RFID 环形天线和温度传感器读数识别动物身份，并记录角落访问事件——两项读数均需为阳性方可记录一次访问（左）。随后，小鼠被训练以固定比率-3（FR-3） schedule 进行鼻触操作以获取饮水管（中）。成功鼻触后可获得 5 秒的饮水管访问时间，此时通过电容式舔舐记录仪记录小鼠的舔舐行为（右）。插图由 Lucy Anderson 使用经修改的 BioRender 模板制作，采用 CC BY 4.0 许可（https://BioRender.com/ko79xuy）。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

所有实验程序均经美国国立卫生研究院（NIH）实验动物管理和使用委员会（IACUC）批准，并符合公共卫生服务关于实验动物人道护理与使用的政策。

1. 准备仪器

注意：每个 IntelliCage 测试系统装置包含一个大型塑料饲养笼（39 cm x 58 cm x 21 cm），最多可容纳 16 只同性别的小鼠。此前的实验群体每笼数量为 8–16 只小鼠。该装置配备四个操作式角落，均连接至顶盖上的中央微处理器。啮齿类动物饲料可通过顶盖中央的一个大型金属料斗获取。在笼内，小鼠可在操作式角落与中央生活区域之间自由活动，生活区域配有垫料和环境丰富化材料。每个操作式角落设有一个小型圆形入口，每次仅允许一只小鼠进入。小鼠的身份通过双 RFID 环形天线和温度传感器读取并记录，只有两项读数均为阳性时，才记录一次有效访问。在每个操作式角落内，小鼠面对两个鼻触孔，每个鼻触孔控制一个电机驱动门的开启。这些可编程的电机门可通向两个吸水管瓶之一。研究人员手动设定吸水管瓶的获取条件，以及基于电容的舔触传感器的灵敏度。每次访问、鼻触和舔触数据均被单独记录，并通过中央微处理器传输至安装有 TSE 专有软件系统的计算机。尽管本实验方案中不作讨论，但每个操作室还配备一个可编程的气流喷射阀，用于厌恶性条件反射训练。

  1. 在塑料饲养笼内放置五块压缩棉纤维垫（15.24 × 25.4 cm）、两块小棉布方块（5.08 × 5.08 cm）以及四个塑料掘穴结构，用于垫料和环境丰富化。
    ​注意：推荐使用压缩棉纤维垫出于两个原因：（1）避免常用垫料材料可能产生的粉尘或碎屑干扰门的机械结构；（2）便于更清晰地识别动物之间的打斗行为。
  2. 将带有操作箱角的顶盖安装到塑料饲养笼上。
  3. 若设备未连接，使用提供的电缆将所有操作箱角连接至中央微处理器，然后使用 CAN 电缆将中央微处理器连接至已预装 TSE 软件的计算机。
    1. 若使用多个装置，需将所有饲养笼依次连接至同一台计算机。
  4. 将微处理器连接至电源，确保每个角落的 LED 指示灯亮起，并确认全部八个电动门均可正常移动。
  5. 将八个饮水瓶各装入约 250 mL 自来水（或其他液体），牢固地盖紧瓶盖以确保密封良好，然后轻轻旋转插入舔管检测口，确保与舔管检测器紧密连接。
    注意：访客检测、鼻触和舔管传感器的灵敏度可通过预实验进行可选优化。如需调节每个角落的灵敏度，请参照“控制器”程序中“帮助”文件所描述的制造商说明进行设置。所有研究均采用以下参数设置：访客检测—816 开/768 关；鼻触—21 开/26 关；舔管检测—69 开/80 关/15 秒超时。
  6. 在饲料槽中装入啮齿类动物饲料。
  7. 打开计算机，启动“控制器”应用程序，并加载所需的实验文件。

2. 动物准备

注意：应在行为学测试开始前至少一周对动物植入 RFID 转换器，以确保有充足的恢复时间。使用年龄至少约为 50 天、体重超过 15 g 的小鼠。对体型较小的小鼠进行植入会增加注射过程中损伤动物的风险。根据小鼠品系的不同，在群养条件下可能会出现攻击性行为，尤其是在雄性小鼠中。为降低此风险，建议在青春期阶段将所有小鼠共同饲养。作者在成年（约出生后 80–150 天）野生型 C57BL/6 小鼠的研究中未观察到明显的攻击性行为，但这并不能保证本方案适用于其他基因型、年龄或饲养条件时同样具有普适性。

  1. 在小鼠肩背部皮下植入 RFID 应答器，以实现个体唯一性识别。
    1. 打印一份数据表格，列出所有实验动物，并在每个动物编号旁留出空间，用于粘贴标注其 RFID 编码的条形码标签。
    2. 收集所有实验动物及相关所需物品：RFID 应答器、可重复装填的 RFID 应答器注射器，以及异氟烷诱导麻醉装置。
    3. 将第一只小鼠放入诱导室，通过汽化异氟烷（氧气流速：1.5 mL/min，异氟烷浓度：1.5–3.5%）进行麻醉，直至小鼠出现深而打嗝样的呼吸，且对脚趾夹捏无反应。
      1. 在等待小鼠进入麻醉状态期间，通过将预装针头旋接到注射器底座上，然后缓慢推动注射器活塞，直至观察到芯片移动，完成将 RFID 应答器装入注射器的操作。
      2. 将标注 RFID 编码的条形码标签贴在打印好的数据表中对应动物编号的旁边。
    4. 将小鼠从诱导室中取出，并在肩背部皮下区域植入预装的 RFID 应答器。
      1. 首先确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，用非优势手的拇指和食指捏住小鼠肩胛骨正上方的颈部皮肤（颈背皮褶）。
      2. 用优势手将注射器针头插入小鼠颈背皮褶的后端皮下，注意保持针头抬高并平行于脊柱方向，以避免损伤小鼠。
      3. 当注射器针尖位于小鼠皮褶内并被拇指和食指稳固夹持后，小心移动优势手，以便能够按压注射器推杆。
      4. 推出 RFID 应答器，同时保持非优势手捏紧皮褶，以便感知芯片是否已从针尖释放。
      5. 在保持皮褶捏紧的状态下，缓慢拔出注射器；只有在注射器完全取出后，方可松开皮褶，以防止应答器随针头带出。
        ​注意：可选地，可在小鼠仍处于麻醉状态下，使用单个缝合结闭合皮肤切口。
    5. 将小鼠放回其原居住笼盒，并监测其从麻醉中恢复，直至完全恢复自主活动能力。
    6. 监测小鼠是否出现任何身体功能障碍的迹象，包括部分瘫痪、跛行或转圈行为，这些可能是注射位置偏差所致。若功能障碍持续超过 24 小时，或严重影响动物福利，应实施人道安乐死。
      1. 将 RFID 应答器读取器置于小鼠肩背部区域上方，进行扫描，以确认应答器植入成功。
    7. 可选地，采集组织样本用于基因分型。
      1. 对所有实验小鼠重复上述操作。
  2. 在首次植入 RFID 应答器后的第二天，使用 RFID 读取器检查所有小鼠，确认无应答器脱落情况。若发现有小鼠丢失应答器，应使用新的应答器重复植入操作，并相应更新记录。
    ​注意：通常情况下，若小鼠将发生 RFID 应答器脱落，多会在植入后 24 小时内发生。这可能是由于应答器植入位置不当和/或小鼠对注射部位的理毛或抓挠所致。避免在先前的注射伤口处再次注射，且在经历三次 RFID 应答器植入失败后应将该小鼠排除实验。
  3. 在将小鼠重新安置到 IntelliCage 装置前，需确认所有 RFID 应答器均可被成功读取。测量并记录所有小鼠的体重。

3. 准备实验文件

注意：IntelliCage 测试系统通过 TSE 提供的图形用户界面进行控制和操作。运行 IntelliCage 实验需使用三个应用程序：“Designer”、“Controller” 和 “Analyzer”。实验的不同阶段通过不同的实验文件运行，这些文件在 “Designer” 应用程序中设计完成，随后在 “Controller” 应用程序中运行。有关如何设计和调整实验文件的详细信息此前已有描述48,49。本研究中使用的四个实验文件模板（Habituation.experiment、Water Training.experiment、Intermittent Alcohol.experiment、Open Bar.experiment）已提供，以协助复制实验方案。在这些文件中，阶段转换发生在中午 12:30。作者选择该时间点是因为动物饲养在上午 6:00 至下午 6:00 的光照周期下，从而可保证完整的黑暗期以测量饮水行为。然而，研究者可能希望根据其他酒精饮用方法学（如“黑暗中饮酒”程序50）调整此时间点。

  1. 在“Designer”应用程序中设置实验文件。
    ​注意：如果使用模板文件，请在输入当前队列之前删除四个示例动物。同时，根据实验设计重命名组名，并根据需要添加组。确保所有新组均以与模板中相同的簇开头。
    1. 在“Designer”应用程序中打开 Habituation.experiment 文件，并仔细输入每只小鼠的动物编号、RFID应答器代码以及实验分组/基因型。将文件另存为新名称，以保留原始模板文件。
      ​注意：如果RFID应答器代码输入错误，将无法记录数据。将动物正确分配至相应的实验组有助于监测其行为，并最终进行数据分析。
    2. 将动物信息导出为动物文件。
    3. 针对实验的每个阶段，打开相应的实验文件并加载动物文件。适当保存并重命名。
    4. 若在独立计算机上设计文件，请将实验文件下载至便携式U盘，以便转移至行为实验房间。
  2. 将所有实验文件下载到连接IntelliCage装置的计算机上，并在“Controller”应用程序中打开第一个文件。验证所有信息是否正确加载。
  3. 以纸质或电子形式创建一份实验日志文件，用于记录实验各阶段开始/结束的日期和时间。这将极大有助于后续分析，因为某些药物处理条件（例如，添加奎宁的酒精）不会被IntelliCage归档文件自动记录。

酒精消耗研究；间歇性获取实验的示意图和时间安排；训练阶段。
图2：操作性间歇饮酒实验范式的时间线。（A）IntelliCage装置的示意图，四个角落中有两个放置了含酒精的饮水瓶。（B）实验时间线，展示了所有实验阶段的安排，该方案来自先前的出版物23。第1队列在完成间歇饮酒后进行了添加奎宁的酒精测试，而第2和第3队列在添加奎宁测试后恢复间歇饮酒。（C）详细的实验日程表，显示了各实验阶段的软件设置变更：适应期、饮水训练期、间歇饮酒期、添加奎宁的酒精测试期以及“开放酒吧”/自由饮酒期。“酒精可获取”模块结束后，每周至少更换一次笼具。插图由Lucy Anderson基于BioRender模板修改而成，采用CC BY 4.0许可（https://BioRender.com/ko79xuy）。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 运行实验

注意：操作性间歇饮酒实验范式包含五个阶段：（1）适应期，（2）饮水训练期，（3）间歇饮酒期，（4）添加奎宁的酒精测试期，以及（5）“开放供应”/自由获取饮酒期。除间歇饮酒期和添加奎宁的酒精测试期均使用 Intermittent Alcohol.experiment 文件中规定的参数外，每个实验阶段均使用不同的实验文件进行。除更换笼具外，实验人员应至少每周检查小鼠三次，以评估动物福利状况并确保软件正常运行。任何受伤或健康状况不佳的小鼠均应从实验中移除。实验时间表示例见 图2。

  1. 笼具更换
    ​注意：至少每周进行一次笼具更换。在酒精饮用期间，仅可在“仅可获取水”时段的下午12:30之后进行更换，以避免干扰酒精饮用行为。为便于操作，Intermittent Alcohol.experiment 和 Open Bar.experiment 实验文件将始终以“仅可获取水”开始。由于笼具尺寸较大，单独操作已饲养小鼠的笼具较为困难。作者建议至少由两名研究人员共同完成笼具更换。每次更换笼具后24小时应检查小鼠，以确保软件正常运行，且未因更换笼具带来的应激而发生攻击或打斗行为。
    1. 开始更换笼具前，准备一个新的洁净塑料笼具，加入新的垫料和筑巢材料。在每个笼具的八个饮水瓶中分别加入约250 mL自来水或20%酒精（95%乙醇[190 proof]与自来水按体积比v/v配制）。
      注意：研究人员可选择性地将少量旧垫料转移至新洁净笼具中。此举可减少对已建立群体等级秩序的干扰，并可能降低打斗风险。
    2. 在“Controller”应用程序中停止实验。确认无小鼠位于操作角落后，移除金属食槽。由一人将金属微处理器装置抬起至足够高度，以便另一人将塑料笼具从其下方滑出。核对小鼠数量是否正确。
    3. 逐只将小鼠从脏笼中取出，扫描RFID应答器并记录体重。肉眼检查每只小鼠是否有受伤或患病迹象。
      注意：作者建议将体重数据记录于电子表格（csv格式），以便后续分析流程直接读取。
    4. 记录完体重后，将小鼠暂时安置于洁净的暂存容器中。
    5. 使用浸有消毒液的湿布清洁顶部区域及角落。特别注意擦拭角落板的表面及底部边缘，避免液体渗入电子部件。
    6. 将金属微处理器装置抬起至足够高度，以便将新的洁净塑料笼具滑入原位。
    7. 将新的饮水瓶轻轻旋入舔管计入口，确保与舔管计紧密连接。
    8. 将小鼠转移至新的洁净装置中。
    9. 更换为新的洁净食槽，并加入新鲜啮齿类动物饲料。
    10. 在“Controller”应用程序中重新启动同一实验，或加载并启动新的实验文件。
    11. 确认程序正常运行，所有小鼠的访问、鼻触和舔管行为均被准确记录。
      注意：当某只动物在12小时内无任何舔管记录时，“Controller”程序将自动发出警告。
    12. 清洁使用过的设备。塑料笼具、饮水瓶和塑料挖掘结构通常可通过常规笼具清洗系统进行清洗。
  2. 第0天：适应期
    ​注意：适应期使用 Habituation.experiment 文件运行。此阶段所有饮水瓶均装有自来水。小鼠可自由访问所有饮水瓶，无需进行操作性鼻触。当小鼠进入操作角落时，电动门将自动开启，暴露饮水瓶喷嘴。
    1. 确认RFID应答器存在并记录小鼠体重后，将八个饮水瓶均装入约250 mL自来水，并轻轻旋入舔管计入口。
    2. 将最多16只同性别小鼠放入准备好的IntelliCage装置中。
    3. 在“Controller”应用程序中加载 Habituation.experiment 文件并开始记录。
    4. 确认当小鼠进入操作角落时，所有电动门均能正常开启，并且每只小鼠的访问、鼻触和舔管行为均被成功记录。若某只小鼠在6小时内无任何访问、鼻触或舔管记录，应检查其.animal文件是否存在错误。
  3. 第1–3天：饮水训练
    注意：饮水训练阶段使用 Water Training.experiment 文件运行。所有饮水瓶应继续仅装自来水。此阶段将训练小鼠在FR-1，随后在FR-3强化程序下进行鼻触以获取饮水瓶喷嘴。成功鼻触后，电动门将开启5秒以提供饮水机会。当单个小鼠的成功率达到60%或更高时，将在程序剩余时间内转入FR-3程序。通常，小鼠在24–72小时内转入FR-3程序。在“Controller”中监测动物表现。若某只动物在72小时内未达到FR-3程序标准，应将其排除于后续实验之外。
    1. 若在24小时适应期后所有小鼠均状态良好、无脱水或受伤迹象，则停止运行 Habituation.experiment 文件，并开始运行 Water Training.experiment 文件。
    2. 确认软件成功记录每只小鼠的访问、鼻触和舔管行为，并且所有电动门均能正常开启。
  4. 第4天起：间歇性酒精饮用
    注意：间歇性酒精饮用阶段使用 Intermittent Alcohol.experiment 文件运行。此阶段，四个操作角落中的两个饮水瓶将替换为20%酒精。水与酒精角落通过实验文件中的“Clusters”功能预先设定。在模板中，水供应位于第一和第三角落（标记为“中性”），酒精位于第二和第四角落（标记为“错误”）。小鼠可连续获取水，但每隔一天有24小时（下午12:30至次日下午12:30）间歇性获取酒精的机会。所有角落均采用FR-3程序提供5秒饮水/饮酒机会。在此实验阶段，笼具更换应在“仅可获取水”时段进行，以避免干扰酒精饮用。研究人员应在分配酒精角落前，确保实验组在饮水训练期间对四个角落的偏好大致相等。在各队列中，实验组在饮水训练期间对四个角落的访问和舔管次数均大致相等。因此，作者在各队列中保持了固定的角落分配。研究人员可通过“Controller”程序轻松查看各角落舔管和访问的比例。实验过程中应定期监测访问和舔管数据，以确保未出现异常（如设备故障或个别小鼠“独占”特定角落）。
    1. 当所有小鼠均成功达到FR-3程序以获取饮水瓶后，准备20%酒精（95%乙醇[190 proof]与自来水按体积比v/v配制；约250 mL/瓶）。
    2. 停止运行 Water Training.experiment 文件。
    3. 移除第二和第四操作角落（或实验文件中指定的其他角落）的饮水瓶，并替换为约250 mL的20%酒精。
    4. 将装有酒精的新饮水瓶轻轻旋入舔管计入口，确保与舔管计紧密连接。
    5. 加载 Intermittent Alcohol.experiment 文件并开始记录。
    6. 确认软件成功记录每只小鼠的访问、鼻触和舔管行为，并且所有电动门均能正常开启。
    7. 在次日下午12:30后，确认程序已成功从“仅可获取水”切换至“酒精可获取”模块，并且在含酒精的操作角落中已记录到舔管行为。
  5. 第16天起：添加奎宁的酒精测试
    ​注意：添加奎宁的酒精测试阶段使用 Intermittent Alcohol.experiment file 运行。此阶段，先前装有20%酒精的两个操作角落的饮水瓶将替换为0.5 mM，随后为1 mM奎宁掺杂的20%酒精，以评估对惩罚不敏感的饮酒行为。这些奎宁浓度分别相当于0.016%和0.032%（w/v），此前已被本课题组27,28及其他研究者31证实具有厌恶效应。小鼠可连续获取水，但每隔一天有24小时间歇性获取掺奎宁酒精的机会（即一天饮用0.5 mM奎宁酒精，一天仅可获取水，一天饮用1.0 mM奎宁酒精）。所有角落均采用FR-3程序提供获取机会。在本研究中，小鼠在连续16或24天未掺杂的间歇性酒精饮用后进入此阶段。在掺杂测试之间的“仅水日”不进行笼具更换，以避免应激的混杂影响。此阶段结束后，小鼠可进入“开放获取”/自由饮酒阶段，或返回间歇性饮酒以评估掺杂后的反弹饮酒行为。
    1. 准备0.5 mM和1 mM奎宁掺杂的20%酒精（95%乙醇[190 proof]与自来水按体积比v/v配制；约250 mL/瓶）。
    2. 进行笼具更换，移除所有饮水瓶。
    3. 将酒精角落的每个饮水瓶装入约250 mL的0.5 mM奎宁掺杂20%酒精溶液。
    4. 将装有酒精的新饮水瓶轻轻旋入舔管计入口，确保与舔管计紧密连接。
    5. 加载 Intermittent Alcohol.experiment 文件并开始记录。
    6. 确认软件成功记录每只小鼠的访问、鼻触和舔管行为，并且所有电动门均能正常开启。
    7. 在下午12:30后，确认程序已成功从“仅可获取水”切换至“酒精可获取”模块，并且在含酒精的操作角落中已记录到舔管行为。
    8. 在下一个饮酒日的下午12:30前，将酒精角落的每个饮水瓶替换为约250 mL的1 mM奎宁掺杂20%酒精溶液。无需停止实验即可完成换瓶操作。
    9. 在下一个饮酒日的下午12:30前，移除含掺杂酒精的饮水瓶，并替换为约250 mL未掺杂的20%酒精。
  6. 第20天起：“开放获取”/自由饮酒
    ​注意：可选择性运行一天“开放获取”/自由饮酒作为非操作性对照。此阶段使用 Open Bar.experiment 文件运行。此阶段，四个操作角落中的两个饮水瓶装有20%酒精，小鼠可在24小时（下午12:30至次日下午12:30）内自由获取。进入角落即可开启门，无需鼻触。在本研究中，小鼠在间歇性酒精饮用或奎宁掺杂酒精测试阶段后进入此阶段。
    1. 如有必要，准备20%酒精（95%乙醇[190 proof]与自来水按体积比v/v配制；约250 mL/瓶）。
    2. 在下一个饮酒日的下午12:30前，停止运行当前实验文件。
    3. 如有必要，移除酒精角落的饮水瓶，并替换为约250 mL的20%酒精。
    4. 将装有酒精的新饮水瓶轻轻旋入舔管计入口，确保与舔管计紧密连接。
    5. 加载 Open Bar.experiment 文件并开始记录。
    6. 确认软件成功记录每只小鼠的访问、鼻触和舔管行为，并且所有电动门均可自由开启。
    7. 在下午12:30后，确认程序已成功从“仅可获取水”切换至“酒精可获取”模块，并且在含酒精的操作角落中已记录到舔管行为。

5. 数据分析

注意：每次实验的数据会在程序运行期间内部存储，当程序停止时，系统会创建一个压缩的数据存档文件，并保存至本地硬盘的 C:\Documents\NewBehavior\IntelliCage Plus\Archives 路径下。文件名由程序启动的日期和时间组成，后缀为 .zip。该数据存档文件包含实验的所有相关信息，包括角落访问（开始时间、结束时间、持续时间、访问顺序）、鼻触（开始时间、结束时间、持续时间）、舔水行为（开始时间、结束时间、持续时间）、明暗周期时间以及温度数据。此数据存档可通过“Analyzer”程序进行读取和分析。尽管已有其他开源软件包可用于分析 IntelliCage 的数据输出（Ruffini 等，2021；Gastaldi 等，2025），作者仍使用 tidyverse 中公开可用的 R 软件包构建了一套用于分析间歇性饮酒范式数据的数据分析流程。该流程包含多个质量控制步骤，如每只小鼠的角落占用分析、昼夜节律中平均访问次数、鼻触次数和舔水频率分析、每只小鼠的 FR-3 舔水习得率以及每只小鼠每日舔水次数统计。此外，作者还提供了针对饮酒行为指标的基础分析脚本。该分析基于使用 Quarto 标记语言编写的 R 笔记本模板文件，可处理原始数据文件，并可根据不同动物群组的特点进行调整。分析工作使用 RStudio 的免费版本完成。R 项目的模板文件可在 GitHub 仓库29中获取。

  1. 整理所有数据，包括“Controller”应用程序输出的压缩文件，以及包含小鼠体重数据的 CSV 文件。
    ​注意：需要体重数据以根据体重对摄入量进行归一化处理。在此工作流程中，将体重数据保存在单独的文件中比将其添加到每个实验文件中更为合理。第一列需与归档文件中的动物编号（Animal ID）一致。
  2. 从 GitHub 仓库下载 R 项目模板。
    1. 将项目重命名为与当前实验一致的名称。
    2. 模板中包含位于 data/C1 子文件夹中的示例数据文件，用于说明分析流程的工作方式。请用个性化的数据归档文件替换这些示例归档文件。
  3. 启动 RStudio 并打开该项目。
    1. 在 RStudio 窗口右下角的文件区域中，导航至 qmd 文件夹，并打开 IC_template.qmd 文件。
    2. 复制该模板文件，并将其重命名为与实验一致的名称。
    3. 修改复制后的文件中 YAML 头部部分以及初始代码块中的元数据。
    4. 根据实验分组情况，修改 R 目录下 IC_Commons.R 文件中的组名。（模板中默认使用两组：Control 和 LBN。）
  4. 运行笔记本文件。
    注意：GitHub 仓库中的 README.md 文件提供了更详细的说明。

角落占据热图；水与酒精训练；动物行为研究结果；天数与小时数。
图 3：在训练阶段和间歇性酒精摄入阶段，所有小鼠对操作箱角落的可及性具有可比性。 在第一组小鼠23中，热图显示了每只小鼠在每天每个角落所花费的总时间，分别为（A）适应期和饮水训练期与（B）前四天的间歇性酒精摄入期（n = 15 只雌性，16 只雄性）。颜色越深的红色表示每天在角落中停留的时间越长。请点击此处查看该图的放大版本。

图表中的动物行为分析；关于访问、鼻触、舔舐、训练、酒精效应的数据。
图 4：小鼠表现出符合昼夜节律的访问、鼻触和舔舐行为，并能在 FR-3 程序下成功获得操作式饮水管取水机会。在第一组小鼠中23，测试前八天期间，操作区角（A）访问次数、（B）鼻触次数和（C）舔舐次数随会话时间的平均密度。（D）各只小鼠在饮水训练期间首次成功按 FR-3 比例完成舔舐所需的时间。（E）小鼠在适应期和饮水训练期间（左）与间歇性饮酒前四天期间（右）的访问成功率（= 导致舔舐行为的访问次数占总访问次数的百分比）。圆形符号代表雌性小鼠（n = 15）；方形符号代表雄性小鼠（n = 16）。请点击此处查看该图的放大版本。

柱状图；实验期间雄性和雌性受试小鼠对酒精与水的偏好；饮品分析。
图 5：小鼠在训练阶段和间歇性饮酒阶段的每日舔舐次数相似。在（A）雌性（n = 15）和（B）雄性（n = 16）第一组小鼠23中，习惯化和饮水训练阶段（第 -4–0 天）与间歇性饮酒阶段（第 1–4 天）每日对水（蓝色）和酒精（红色）的总舔舐次数。C 表示对照组饲养；L 表示 LBN 饲养。请点击此处查看此图的放大版本。

按体重标准化的酒精消耗量、线形图与密度图、实验分组、对照组与LBN分析
图6：在操作性间歇饮酒范式中，经历早期生活逆境的小鼠比对照组小鼠摄入更多酒精。（A）在为期8天的间歇性酒精摄入期间，对照组（灰色；左）和LBN饲养组（粉色；右）小鼠每日平均酒精舔舐次数按体重（g；每周测量）标准化后的结果。（B）在添加奎宁（0.5 mM，1 mM）之前、期间和之后，每日平均酒精舔舐次数按体重标准化的结果。（C）单次FR-0“畅饮”酒精获取日的密度图，显示按体重标准化后的每日平均酒精舔舐次数。圆形符号代表雌性小鼠（n = 15）；方形符号代表雄性小鼠（n = 16）。请点击此处查看该图的高清版本。

结果

研究人员通过IntelliCage系统进行自动化笼内测试，以评估早期生活逆境（ELA）如何改变类似酒精使用障碍（AUD）行为的易感性27。为诱导逆境，他们采用了限制垫料与筑巢材料（LBN）范式，这是一种资源匮乏模型，可导致母体照料的不可预测性和碎片化51,52,53,54,55,56。该研究的新颖之处在于，在群养小鼠中评估ELA对饮酒行为的影响，避免了社会隔离所引起的压力带来的混杂效应。这一点尤为重要，因为已知成年期的社会隔离对经历ELA的小鼠会产生差异性影响22,57。为了实现最大通量，作者同时在四个IntelliCage装置中测量饮酒行为，每种性别使用两个装置。

作者们 首先对原始数据进行全面的质量控制，以启动分析流程。本文所包含的图表展示了已发表研究中第一个队列（n = 15 名女性，16 名男性）的代表性数据。23所有分析和绘图的脚本均包含在 GitHub 代码仓库中29实验第0天因更换笼子而干扰了数据采集，故已被排除。在数据探索与质量控制的考虑因素中，作者确保了所有小鼠在训练期间对各个操作箱角落的接触机会基本均等图 3A）和间歇性饮酒阶段（图3B）。这排除了小鼠占据操作箱角落而阻碍其他小鼠接触吸管瓶的显著影响。作者随后验证了小鼠在实验期间的访问、鼻触和舔舐行为均呈现出预期的昼夜节律图4A–C并且所有小鼠在模块开始后的六小时内均成功完成了FR-3比率下的第一次舔舐反应（图4D）。在饮水训练阶段结束时，所有小鼠均达到了相对较高的舔舐成功率为（= 产生舔舐的访问次数 / 总访问次数的百分比），进一步证实饮水训练结束时训练已成功图4E).

在适应期、饮水训练以及间歇性酒精摄入开始阶段，小鼠每日舔舐次数总体保持相近（图5A–B）。尽管部分小鼠在实验第-3天开始操作式饮水训练时总日舔舐次数有所下降（例如P241260-1），但大多数小鼠能够迅速掌握固定比率1（FR-1）和固定比率3（FR-3）的鼻触任务，从而维持基线水平的舔舐频率。因此，在饮水训练期间，小鼠出现严重脱水的可能性较低。所有小鼠均以合理的速度学会了FR-3的任务要求。 从实验第1天开始间歇性酒精摄入后，几乎所有小鼠均选择摄入酒精，尽管摄入速率存在个体差异。总体而言，小鼠在摄入酒精时并未显著增加每日总舔舐次数。相反，小鼠减少了饮水舔舐次数，以适应酒精摄入的增加。

在间歇性饮酒的所有天数中，第一组小鼠每日按体重标准化的饮酒舔舐次数存在显著差异（图6A）。研究者发现，经历LBN范式的小鼠体重显著低于交叉抚育的对照组23。因此，在分析饮酒行为的组间差异时，研究者选择将每日饮酒舔舐次数按体重进行标准化处理，体重数据在每次更换笼具时每周测定一次。与对照组相比，LBN抚育的小鼠在间歇性饮酒（图6A）和添加奎宁的饮酒阶段（图6B）中，每克体重的酒精摄入量普遍更高。该趋势在非操作性自由饮酒的单日测试中仍然存在（图6C）。第一组的结果与已发表的研究一致，即暴露于早期生活应激（ELA）的小鼠在间歇性饮酒期间每克体重的酒精摄入量持续高于交叉抚育的对照组，这一效应在雄性小鼠中尤为显著23。

得益于自动化笼内监测系统的高效性，已发表的研究在包含两种性别的较大样本量（n = 54 对照组，43 LBN）中证实，群养条件下经历早期生活逆境（ELA）的啮齿类动物饮酒量显著增加23。这些结果在模拟具有不良童年经历史的酒精使用障碍（AUD）患者所表现出的类似AUD行为方面迈出了重要一步58,59,60,61,62，并为未来探索ELA后AUD易感性增加背后的神经生物学机制研究开辟了道路。

讨论

正如作者利用IntelliCages对暴露于早期生活应激（ELA）的小鼠中类似酒精使用障碍（AUD）的行为进行稳健评估27，以及既往在转基因品系中的研究工作所示28，自动化笼内监测系统为研究AUD的临床前模型提供了一种高效且灵活的解决方案。该系统可同时评估最多16只同笼饲养的小鼠，显著提高了酒精摄入实验方法的通量，同时避免了社会隔离所诱发应激带来的混杂影响。操作性间歇性饮酒范式使研究者能够在约5至6周的单一实验周期内，探究多种类似AUD的行为特征，包括暴饮、随时间推移的饮酒量上升以及对惩罚不敏感的饮酒行为。尽管该范式仅为评估类似AUD行为的一种方法，但其设计可轻松调整，用于更长期地测量间歇性饮酒行为、测试对气流刺激惩罚不敏感的饮酒反应，或引入可变操作比率等其他多种可能性。总体而言，自动化笼内监测系统显著提升了研究者评估类似AUD行为的通量与特异性，推动了对潜在神经环路机制及治疗策略的发现。

与所有技术一样，作者偶尔会遇到机械和故障问题。尽管可能倾向于让系统无人监管运行，但研究人员必须持续定期监控设备，以确保其正常运作。磁力门偶尔会发生机械故障，导致小鼠无法接触到吸管瓶。只要进行适当的清洁和维护，这种情况很少发生，通常对数据采集的影响极小。为了快速发现错误，应监测各吸管瓶中的液体是否出现相近程度的减少，并定期检查“Controller”应用程序，确认所有动物在各个角落的舔舐行为均被正常记录。如需更详细的指导，Masuda 及其同事对如何安装和维护 IntelliCages 系统提供了极为详尽的说明48。

定期观察动物行为也至关重要，以监测是否存在打斗或其他干扰性行为。尽管作者在使用C57/BL6小鼠进行该实验范式时未遇到严重的打斗问题，但将更具攻击性的基因型雄性小鼠同笼饲养已导致显著问题。应定期检查是否存在干涸的血迹、跛行个体或其他打斗迹象，尤其是在更换笼具后。若发现上述迹象，应立即移除肇事动物，并将其排除在后续实验之外。使用所提供代码中的“Individual mouse performance”部分来评估攻击行为对个体小鼠饮水行为的影响程度及持续时间。所有受影响的天数均应从分析中剔除。如前所述，作者无法保证该方案在不同基因型或饲养条件下的普适性。

类似地，作者偶尔会遇到小鼠“霸占”操作箱角落的问题，即小鼠长时间在同一个角落睡觉或停留。这种行为会阻碍其他小鼠接触该角落的饮水管。如果在数据分析中未妥善处理此类情况，可能会对饮水结果造成干扰。请使用所提供的代码中的“角落占用（访问持续时间）”和“单个小鼠表现”部分，判断“霸占”行为是否对小鼠行为产生了显著影响，从而决定是否应排除某些实验日期的数据。总体而言，该自动化监测系统在实验过程中无法记录或量化社会行为，是其主要局限性之一。

最后，与越来越多的先进神经科学研究方法一样，自动化笼内监测系统会产生大量数据。通过使用本文提供的开源代码29以及他人开发的代码63,64，实验人员可利用多种工具来组织和分析输出的数据。然而，若对本文所述方案进行修改，则需要对代码进行相应调整。此外，还可针对本文未展示的大量输出数据开展更多其他分析。

例如，研究者可能希望量化酒精摄入量（每日每公斤小鼠体重所摄入的酒精克数）。作者对此进行了简要讨论，并在 GitHub 仓库中提供了用于执行该分析的初步代码29。在该仓库中，作者采用了 1.94 µL/舔的舔液量换算系数，这一数值与 Kasia Radwanska 及其同事的计算结果一致30,37。尽管该舔液量换算系数已被领域内其他研究者用于估算酒精摄入量30,37,38,39，但其是基于水的摄入量测量得出的。因此，由于水与酒精在表面张力上的差异，该系数可能无法准确反映20%酒精溶液的摄入量。领域内其他研究者曾采用 3 µL/舔的换算系数31,34,36,38，这凸显了明确该测量参数的必要性。此外，不能排除小鼠每次舔舐的液体量存在差异的可能性，这进一步增加了计算的复杂性。如果研究者希望获得准确的酒精摄入量（g/kg/天）数据，作者建议根据具体的实验设计确定与之匹配的舔液量换算系数。

总之，自动化笼内监测系统的进步及其可及性的提高，为酒精使用障碍（AUD）研究人员提供了新的、更完善的工具，用于在临床前水平评估饮酒行为。此类操作性间歇饮酒实验范式使研究者能够比传统方法以更高的通量和更强的生态学相关性，同时评估多种类似AUD的行为特征。通过IntelliCage测试系统及开源替代方案20,26，研究人员可以更高效、更灵活地探究与AUD一致的饮酒行为，从而加快有效干预措施的发现进程。

披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）院内研究计划对 V.A.A. 的资助（项目编号：ZIA AA000421；ZIA MH002987）。我们感谢 Miriam Bocarsly、Anoo Maskeri 和 Erin Murray 在本实验方案开发过程中提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙醇，190 证明Decon Laboratories2801G
IntelliCage 测试系统TSE Systemshttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/包含 1 个 2000P 静态笼具（Tecniplast，2000P001）、 4 个小鼠住所（Tecniplast，ACRE011）以及 8 个饮水瓶（Techniplast，ACBT0252）和瓶盖（Techniplast，ACCP3521）
IntelliCage 软件（"Designer"、"Controller"、"Analyzer"）TSE Systemshttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/版本 3.6.9.0
隔离垫，6" × 10"Braintree Scientific, Inc.ISO 6105压缩棉纤维垫（15.24 × 25.4 cm）
异氟烷Baxter10019-360-40
Isoflurane VXP™ Well-fill 蒸发器MedVet91305535
实验啮齿动物饲料LabDiet5001
中型 Sure-Seal 小鼠/大鼠诱导室 World Precision InstrumentsEZ-178
NestletsAncareNES 3600小棉垫（5.08 × 5.08 cm）
OHAUS Compass™ CX 天平 — 2,200 克 × 1 克UlineH-8110用于小鼠体重测量
PC + 显示器Supermicrohttps://www.tse-systems.com/products/intellicage/作为 IntelliCage 测试系统的一部分出售
RFID 转换器（1.25 × 7 mm）TSE Systems290000-IC-60400
RFID 转换器注射器AVIDAVID2028
RFID 转换器读取器TSE Systems290000-IC-50800
RStudioPosithttps://posit.co/download/rstudio-desktop版本 2026.01.1+403；包含 Tidyverse（2.0.0）和 Quarto（1.9.37）
Tri Pour 一次性烧杯Consolidated Plastics45317用于小鼠体重测量

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