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研究文章

精神分裂症中SUCNR1和GPR37L1的生物信息学与定量实时聚合酶链式反应分析

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DOI：

10.3791/71356

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2026年8月11日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Psychiatry and Neuroscience, Wuhan Rongjun Youfu Hospital, 2Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

本文内容

摘要

本研究通过整合GSE54913数据集的生物信息学分析、定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）验证以及在独立队列中与言语记忆的相关性分析，评估SUCNR1和GPR37L1作为与精神分裂症相关的候选分子标志物的潜力。

摘要

精神分裂症是一种严重的、复杂的、多因素的精神障碍，涉及多种遗传易感性因素，导致显著的残疾、发病率和死亡率。尽管在理解其病理生理学和病因方面已取得重大进展，但精神分裂症特异性的诊断生物标志物仍不明确。本研究旨在鉴定与精神分裂症相关的候选分子标志物。对公共微阵列数据集 GSE54913 进行了整合性生物信息学分析。基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析显示，最显著富集的 GO 条目与通道活性相关，包括被动跨膜转运体活性、离子通道活性、门控通道活性和底物特异性通道活性。前五项显著富集的 KEGG 通路分别为胰岛素分泌、cAMP 信号通路、核苷酸切除修复、TNF 信号通路和谷胱甘肽代谢。使用来自武汉荣军优抚医院的独立样本集，通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）对结果进行了验证。qRT-PCR 结果与微阵列分析结果基本一致（Pearson r = 0.89，95% CI：0.66–0.97）。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析鉴定出两个核心基因 SUCNR1 和 GPR37L1，它们显著关联于 GO 条目“离子通道活性”，并在 KEGG 通路“胰岛素分泌”中显著富集。此外，SUCNR1 的表达水平与言语记忆评分呈负相关（r = -0.54，P = 0.015），而 GPR37L1 的表达水平则呈正相关（r = 0.59，P = 0.0034）。这些发现提示，SUCNR1 和 GPR37L1 表达的改变可能与精神分裂症相关，并可作为进一步研究的候选分子标志物。

引言

精神分裂症是一种病因未明的慢性复杂性精神障碍，其特征为严重的大脑功能障碍、认知损害以及心理社会功能缺陷1。该疾病构成了重大的全球公共卫生负担，全球患者人数超过2100万2。尽管在过去五十年中诊断和治疗方法取得了显著进展，但其核心发病机制仍不明确，与显著残疾、疾病负担和死亡率相关的长期预后也未得到明显改善3。因此，识别潜在的关键基因和调控靶点至关重要。

尽管精神分裂症的病理生理机制尚未完全阐明，但普遍认为其与遗传多态性及基因表达变异有关4。例如，雌激素α基因的遗传变异可能通过影响基因调控和转录本加工过程，从而改变个体对精神分裂症的易感性5。类似地，NRG1基因的一个功能性启动子变异已被证实与精神分裂症相关，并与III型NRG1异构体表达水平降低相关联6。尸检研究显示，精神分裂症患者脑组织中PDE4B异构体的表达显著下调，提示其具有潜在的预测价值7。其他候选基因包括多巴胺转运体（DAT）、囊泡单胺转运体（VMAT2）和单胺氧化酶（MAO），这些分子参与突触间隙多巴胺水平的调控，可能作为生物标志物8。此外，TCP1可能通过导致肌动蛋白错误折叠，进而引发精神分裂症中的细胞骨架缺陷9。因此，阐明精神分裂症发病过程中基因表达谱的变化，有助于深入理解疾病风险预测、发病机制及治疗效果评估。

近年来，通过整合网络分析和机器学习方法，计算技术在疾病相关基因的识别方面取得了进展10,11,12。尽管已开展大量遗传学研究，但目前尚无可靠的基于血液的诊断生物标志物被成功转化为精神分裂症的临床应用。为弥补这一空白，本研究采用整合性生物信息学方法对GSE54913数据集进行重新分析，该数据集包含来自经过充分表征的精神分裂症患者和健康对照者的血液来源的转录组数据。选择该数据集的原因如下：（1）外周血样本具有最小侵入性且在临床上易于获取；（2）在公开可用的精神分裂症微阵列数据集中，该数据集样本量相对较大；（3）原始数据可供重新分析。本研究的目标包括：（1）利用GSE54913数据集鉴定精神分裂症患者与健康对照者之间差异表达的基因；（2）进行功能富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，以识别枢纽基因；（3）在独立队列中通过qRT-PCR验证候选基因的表达水平；（4）探讨枢纽基因表达与言语记忆表现之间的相关性。据作者所知，本研究首次将SUCNR1和GPR37L1识别为潜在的基于血液的精神分裂症分子标志物。

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方案

本研究经武汉荣军优抚医院伦理委员会批准（项目识别代码：YF-IRB202310215），并遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行。所有参与者均为中国社区居民，并签署了书面知情同意书。

研究对象与血液采样
纳入10名确诊为精神分裂症的成年患者和10名无三代以内精神疾病家族史的健康对照志愿者。精神分裂症患者的纳入标准：（1）由两名独立的高级精神科医师根据DSM-5标准确诊为精神分裂症；（2）年龄18–65岁；（3）在采血前至少4周内未更改抗精神病药物治疗方案；（4）愿意签署书面知情同意书。排除标准：（1）合并重大躯体疾病（如糖尿病、心血管疾病、癌症）；（2）过去6个月内存在物质滥用或依赖；（3）智力障碍；（4）妊娠或哺乳期。健康对照组的纳入标准：（1）本人及三代以内亲属无任何精神疾病史；（2）从未使用过抗精神病药物；（3）年龄和性别与精神分裂症组相匹配；（4）无重大躯体疾病。精神分裂症患者的平均病程为12.5 ± 6.8年；所有患者均接受稳定的抗精神病药物治疗（6例使用利培酮，4例使用奥氮平）；阳性和阴性症状量表（PANSS）总分平均为76.4 ± 12.3。对照组在年龄（±5岁）和性别（每组5名男性、5名女性）方面相匹配。采用霍普金斯言语学习测验修订版（HVLT-R）的总回忆得分评估言语记忆功能。所有受试者均于2025年1月1日至7月31日期间在中国武汉荣军优抚医院招募。基线人口学特征详见表1。

采用样本量计算软件，基于双尾独立t检验确定样本量，设定效应量为1.2，α = 0.05，检验效能（1-β）= 0.80，结果为每组至少需要九名受试者。

采集静脉血至含EDTA抗凝剂的试管中，并立即进行处理。随后采用密度梯度培养基通过密度梯度离心法从样本中分离外周血单个核细胞（PBMCs）。简言之，血液以1:1比例用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）稀释后，叠加于密度梯度培养基上，于20 °C以400 × g 离心30分钟（关闭刹车）。离心后，小心收集含有PBMCs的界面层并转移至新试管中。细胞用PBS洗涤两次，每次洗涤均以300 × g 在4 °C离心10分钟，最终沉淀重悬于PBS中。采用台盼蓝染料排斥法评估细胞活力，仅使用细胞存活率≥95%的样本。分离所得PBMCs分装后于−80 °C保存，最长不超过3个月，随后进行RNA提取。

芯片数据
本研究的工作流程见图1。微阵列数据集GSE54913从GEO数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载获得。选择该数据集的原因如下：（1）其包含来自外周血样本的转录组数据，这类样本具有最小侵入性，且在生物标志物发现方面具有临床实用性；（2）在公开可用的精神分裂症微阵列数据集中，其样本量相对较大（18例患者，12例对照）；（3）原始数据可供重新分析。根据GEO记录，样本来源于外周血单个核细胞（PBMCs），而非血浆。此前版本中原始描述“血浆样本”有误，现已更正。

数据预处理与差异表达基因（DEG）筛选
使用微阵列预处理软件对原始数据（.CEL 文件）进行预处理。采用鲁棒多芯片平均法（Robust Multichip Average, RMA）进行背景校正，随后进行分位数归一化和 log2 转换。过滤掉无任何基因注释的探针集。在所有样本中缺失值比例超过 >20% 的探针被剔除；其余探针的缺失值使用缺失值填补软件中实现的 k-最近邻算法（k = 10）进行填补。根据 GEO 记录，所有样本均在同一批次中处理，因此不存在批次效应。预处理后，获得 17,200 个基因的表达值用于后续分析。使用差异表达分析软件鉴定精神分裂症患者与健康对照之间的差异表达基因。筛选标准为：错误发现率（FDR）< 0.05、绝对倍数变化（FC）> 1.2，且 P 值 < 0.05 的基因被视为差异表达基因。选择相对较低的 FC 阈值（绝对 FC > 1.2）是因为精神分裂症是一种复杂的神经精神疾病，其单个基因表达差异通常较为微弱，而非显著变化。

基因本体（GO）与通路富集分析
使用功能富集分析软件对基因本体（Gene Ontology, GO）术语和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路进行了功能富集分析。背景基因集包含所有通过预处理的基因（共17,200个基因）。报告了原始P值<0.05的富集术语和通路。由于GO和KEGG富集结果采用的是原始P值，因此这些结果应被视为探索性分析结果。

PPI 网络分析与枢纽基因鉴定
采用蛋白质-蛋白质相互作用数据库构建 PPI 网络，以综合相互作用评分 > 0.9 作为阈值。使用网络可视化软件对网络进行可视化。通过枢纽基因鉴定插件结合 Degree 算法识别枢纽基因。选取度值评分最高的前 10 个节点作为枢纽基因。利用子网络提取插件在默认参数下（度值截断值 = 2，节点评分截断值 = 0.2，K-core = 2，最大深度 = 100）提取关键枢纽基因的子网络。

总RNA提取与qRT-PCR
β-Actin用作内参（持家）基因。通过比较精神分裂症组与对照组之间的Ct值，确认β-actin在各样本中的表达稳定性（P > 0.05，差异无统计学意义）。相对定量采用2−ΔΔCt法进行计算。所有反应均设置三个重复，取平均Ct值用于计算（引物序列见表2）。选取差异表达最显著的前十个基因（按倍数变化排序，上调最显著的五个基因和下调最显著的五个基因）进行初步qRT-PCR验证，以确认微阵列数据的整体可靠性。随后，根据以下三个标准选择SUCNR1和GPR37L1进行重点验证：（1）在PPI网络分析中被鉴定为枢纽基因（degree ≥ 7）；（2）显著富集于最显著的GO条目“离子通道活性”以及KEGG通路“胰岛素分泌”；（3）两者均编码G蛋白偶联受体（GPCRs），而GPCRs是已知的精神分裂症药物靶点。

统计分析
使用Shapiro–Wilk检验评估正态性。符合近似正态分布的变量（P > 0.05）采用参数检验方法进行分析，两组间比较使用Student’s t-检验，多于两组的比较则采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。当数据不符合正态性假设时，根据情况使用Mann–Whitney U 检验或Kruskal–Wallis检验。所有统计检验均为双侧检验。对于多重比较（例如ANOVA事后检验），采用Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）方法进行校正，FDR阈值设为0.05。在相关性分析中，由于仅进行了两次相关性检验，未进行多重比较校正；报告原始P值，并谨慎解读结果。

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结果

差异表达基因的鉴定与层次聚类
对 GSE54913 数据集的分析共鉴定出 473 个差异表达基因（DEGs），其中包括 357 个上调基因和 116 个下调基因，这些基因在精神分裂症患者与对照组之间存在显著差异（图 2A、B）。这些差异表达基因的层次聚类能够将精神分裂症样本与对照组样本区分开来（图 2C）。

差异表达基因的功能富集分析
GO 富集分析鉴定出与通道活性相关的术语，包括被动跨膜转运体活性、离子通道活性、门控通道活性和底物特异性通道活性（原始 P 值 < 0.05；表3）。KEGG 通路分析鉴定出胰岛素分泌、cAMP 信号通路、核苷酸切除修复、TNF 信号通路和谷胱甘肽代谢为最显著富集的通路（原始 P 值 < 0.05；图3C 和 <...

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讨论

精神分裂症是一种严重的多因素疾病，涉及多种遗传易感因素13,14。尽管在理解其病理生理机制方面已取得进展，但仍缺乏可靠的诊断生物标志物。本研究采用整合性生物信息学方法，在精神分裂症患者血液样本中鉴定出473个差异表达基因（DEGs）。基因本体（GO）和KEGG通路分析显示，这些基因在通道活性相关术语和通路中显著富集，包括胰岛素分泌、cAMP信号通路、核苷酸切除修复、TNF信号通路以及谷胱甘肽代谢。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析进一步识别出SUCNR1和GPR37L1为枢纽基因，且其表达水平与言语记忆表现相关，提示它们可能作为精神分裂症相关的分子标志物具有潜在意义。

富集的 "通道活性" GO 术语与先前的精神分裂症研究一致。电压门控钙通道（如 CACNA1C、CACNB2）和钾通道（如 Kv3、Kv2.1）已被证实与精神分裂症易感性及神经元兴奋性相关15,16。同样，本研究发现的最显著 KEGG 通路也与...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由非传染性慢性疾病-中国国家科技重大专项（2025ZD0549004）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
affyBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/affy/微阵列预处理软件
描述： 用于微阵列预处理的 R 软件包
clusterProfilerBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/功能富集分析软件
描述： 用于功能富集分析的 R 软件包
CytoHubba中国生物信息学研究所https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba枢纽基因识别插件
描述： 用于枢纽基因识别的 Cytoscape 插件
CytoscapeCytoscape Consortiumhttps://cytoscape.org/网络可视化软件
描述： 用于网络可视化与分析的软件
G*Power海因里希·海涅大学 Dü杜塞尔多夫https://www.psychologie.hhu.de/arbeitsgruppen/allgemeine-psychologie-und-arbeitspsychologie/gpower 样本量计算软件
描述： 样本量计算软件
GraphPad PrismGraphPad Softwarehttps://www.graphpad.com/统计分析与绘图软件
描述： 统计分析与绘图软件
Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771密度梯度介质
描述： 用于PBMC分离的密度梯度介质
填补Bioconductorhttps://bioconductor.org/packages/impute/缺失值填补软件
描述： 用于缺失值填补的 R 包
LimmaBioconductorhttps://bioconductor.org/packages/limma/差异表达分析软件
描述： 差异表达分析的R语言软件包
MCODECytoscape 应用程序https://apps.cytoscape.org/apps/mcode子网络提取插件
描述： 用于子网络提取的 Cytoscape 插件
R/BioconductorR 基金会https://www.r-project.org/统计计算环境
描述： 统计计算环境
STRINGEMBLhttps://string-db.org/蛋白质-蛋白质相互作用数据库
描述： 蛋白质-蛋白质相互作用数据库
SYBR GreenTakaraRR820A qRT-PCR用荧光染料
描述： qRT-PCR荧光染料
TRIzolTakara9109RNA提取试剂
描述： RNA提取试剂

参考文献

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