一种标准化 的体外 程序，用于评估乳清蛋白饮料暴露后纳米混合树脂复合材料表面微硬度变化

摘要

本方案描述了一种标准化 的体外 方法，用于评估乳清蛋白饮料对树脂复合材料微硬度的影响。该方法通过循环浸入和维克斯测试实现饮食暴露的受控评估，为研究营养饮料与修复生物材料之间的相互作用提供了可重复的模型。

摘要

该体 外 研究旨在评估不同乳清蛋白饮料对三种纳米混合树脂复合材料表面微硬度的影响。共制备了90个圆盘状样品，采用三种纳米杂交树脂复合材料（每材料n=30个），并根据浸泡介质分为三组（n=10）：乳清浓缩液、乳清分离物和蒸馏水。标本每天两次浸泡10分钟，持续30天。基线及浸后使用维克斯微硬度测试仪测量表面微硬度，硬度变化以ΔVHN计算。数据采用双向重复测量、方差分析（ANOVA）和事后检验进行分析。分析显示，复合型、浸渍溶液及其相互作用对ΔVHN值有统计学显著影响（p < 0.0001）。注入复合材料暴露于乳清浓缩物中硬度损失最大（ΔVHN：10.4 ± 2.1），而在蒸馏水中储存的高浓度复合材料中硬度损失最低（ΔVHN：0.9 ± 0.4）。浸入乳清浓缩液中，所有复合材料的硬度损失显著大于蒸馏水（p < 0.05）。乳清分离物在除高度填充复合物外，所有复合材料的硬度损失显著增加，而高填充复合物中无统计学显著差异（p = 0.076）。这些发现表明，乳清蛋白饮料可能降低树脂复合材料的表面微硬度，降解程度取决于材料成分和饮料配方。

引言

树脂复合树脂修复体的长期成功取决于其对复杂口腔环境挑战的抵抗力，包括机械负载、饮食暴露和化学降解^1,2。纳米混合树脂复合材料因其优越的美观和机械性能，尤其是表面微硬度，被广泛使用，这也是耐磨损和结构劣化的重要指标^3,4。

先前的研究表明，暴露于果汁、碳酸饮料和能量饮料等酸性饮料，可能通过降低表面微硬度和改变表面完整性来对复合修复体产生不利影响，5,6,7,8。这些降解效应受多种因素影响，包括pH值、暴露时间和填充剂-基质成分。然而，大多数现有实验模型依赖于高酸性溶液，这可能无法准确反映当代饮食习惯中遇到的化学挑战。

相比之下，乳清蛋白饮料因其营养价值和健身爱好者日益增长的消费而广受欢迎，^9,10。尽管pH值接近中性，这些饮料仍含有乳糖、蛋白质及其他有机成分，可能与树脂基质相互作用，影响材料稳定性。因此，评估其效果需要制定一个不仅考虑酸度，还要考虑有机成分和反复暴露模式的方案。

该方案的总体目标是提供一种标准化且可重复的 体外 方法，用于评估乳清蛋白饮料，特别是浓缩液和分离剂配方对纳米杂交树脂复合材料表面微硬度的影响。该方法通过循环浸泡实现每日饮食暴露的受控模拟，从而提升 体外 测试条件的实验相关性。

与传统的酸性饮料暴露模型相比，该方案具有多项优势。首先，它允许在近中性pH条件下研究材料降解，从而评估超越酸驱动效应的材料反应。其次，循环沉浸式设计更能反映真实的消费模式。第三，该方法便于基于结构特性（如填充物含量和树脂基体成分）对不同复合材料配方进行比较评估。

该方案特别适合旨在评估修复材料在营养相关条件下化学稳定性的研究人员，以及研究膳食成分与牙科生物材料相互作用的研究。它还可以用于测试替代饮料配方、表面处理或新开发的复合材料。

方案

试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 样品制备

1. 从三种纳米混合树脂复合材料中制备共90个圆盘状样品（每材料n=30个）。
2. 使用圆柱形透明硅胶模具（直径6毫米×厚度2毫米）制造样品，以确保尺寸标准化。
3. 将复合材料以单次增量（2毫米厚度）放入模具中，并用透明显微镜载玻片覆盖表面，以获得平整的表面。
4. 使用蓝色LED光固化单元（≈440–480纳米发射光谱），位于距表面约1毫米处，输出强度为1000 mW/^cm² ，持续20秒聚合样品。
5. 在每次聚合循环前，使用辐射计验证固化光强，以确保光照曝光的一致性。
6. 将准备好的样品存放在37°C的蒸馏水中24小时，以便进行聚合后并模拟初始口服条件。
   注意：标本可在37°C的蒸馏水中保存长达24小时，之后再进行进一步处理。

2. 表面处理与抛光工艺

1. 使用浸渍铝的抛光盘对所有试样的上表面进行表面处理和抛光。所有抛光工艺应由单一操作员完成，以确保表面标准化。
2. 依次使用中细、超细的研磨盘，在水冷下各10秒，转速约10,000转/分钟，轻压并单向旋转。
3. 每五个试样更换一次抛光盘，以保持稳定的磨料效率并确保表面标准化。
4. 每次抛光后，用蒸馏水冲洗样品10秒以去除污垢，并轻轻风干5秒后再进行下一个抛光盘。
5. 在每个标本未抛光的表面上标记唯一的识别代码，以确保后续检测时方向一致。
6. 在进行基线微硬度测试前，将样品在37°C的蒸馏水中保存24小时。
   注意：标本可在37°C的蒸馏水中保存，最长24小时后再进行基线检测。

3. 基线微硬度测量

1. 按照先前发布的方案，使用维克斯微硬度测试^仪11执行基线维克斯微硬度测试（VHN）。
2. 施加200克载荷，停留15秒。
3. 每个标本留下三个凹槽，间距至少1毫米。在每个试样的中央表面积上进行凹陷，以避免边缘效应。
4. 计算平均基线VHN。
5. 由单一校准操作员进行测量，以最大限度减少变异性。
   注意： 标本可在37°C的蒸馏水中保存，最长可达24小时后再浸入。

4. 浸入介质的制备

1. 使用市售粉末准备两种乳清蛋白配方：乳清蛋白浓缩液（WC）和乳清蛋白分离液（WI）。
2. 将25克乳清蛋白粉溶解在200毫升蒸馏水（0.125克/毫升）中，制备浸渍溶液。
3. 用实验室摇床混合溶液60秒，直到完全溶解。
4. 让溶液在室温下平衡5分钟，以减少泡沫形成并确保均匀。
5. 在浸入前，使用校准的数字pH计测量并记录每个溶液的pH值。
6. 每次浸泡前准备新鲜乳清溶液，以确保化学成分一致，避免蛋白质降解。
7. 每个样品使用10毫升浸水溶液，以确保每个周期完全浸没。

5. 浸入程序

1. 将每个复合组分为三个子组（n = 10）。
2. 将标本浸泡在指定溶液中，每天两次，每次10分钟。根据已建立的 体外 饮料暴露模型选择浸泡时长和频率，这些模型旨在模拟重复的每日饮^用模式7。
3. 每次浸泡后，用蒸馏水冲洗标本，并放入人工唾液中10分钟，模拟短期唾液暴露。
4. 在浸泡周期之间，将标本存放在37°C的蒸馏水中，直到下一次暴露周期。
5. 此程序仅应用于乳清暴露的基团。在整个实验期间，将对照组持续置于37°C的蒸馏水中。
   注意：浸入协议可在周期间暂停，次日恢复，不影响实验一致性。
6. 继续沉浸30天。

6. 浸后微硬度测量

1. 用蒸馏水冲洗标本后轻轻擦干。
2. 使用相同参数（200克，15秒）进行维克斯微硬度测试。
3. 记录三个缩进，计算浸水后平均VHN。
4. 为每个标本计算ΔVHN。

7. 统计分析

1. 使用重复测量方差分析模型分析维克斯微硬度值，时间点（基线和浸后）为受试者内因子，复合类型和浸没溶液为受试者间因子。
2. 在适当情况下，计算ΔVHN值作为描述性结果指标，以表达每个试样微硬度变化的幅度。
3. 使用Tukey的诚实显著差异（HSD）检验进行事后两两比较。
4. 计算所有组均值的95%置信区间。
5. 使用部分ETA平方（η^2p）报告方差分析结果的效应量。
6. 利用韦尔奇 t检验比较乳清蛋白溶液的pH值。
7. 将统计显著性水平设为 p < 0.05。
8. 除了绝对ΔVHN值外，还可使用以下公式计算微硬度变化百分比：[（基线VHN −浸后VHN）/基线VHN] ×100。

结果

描述性统计

复合解组合的平均ΔVHN（±SD）值见 表1。

...

树脂复合材料	解决方案	ΔVHN（平均± SD）	95%信赖区间	n
EA	蒸馏水	0.9 ± 0.4a	0.61–1.19	10

讨论

本方案提供了一种标准化的方法，用于评估乳清蛋白饮料对树脂复合材料微硬度的化学影响。关键步骤包括均匀的试样制造、受控的光固化条件以及标准化的维克斯测试参数。保持样品尺寸和固化强度的一致性至关重要，因为变化会影响转化程度和机械稳定性。此外，严格控制浸水时间和温度，确保了可重复性，并减少了与吸水和聚合物弛豫过程相关的变异性（^12,13）。

根据研究目标，可能会进行若干修改。例如，浸入频率和持续时间可以调整以模拟不同的^{暴露条件7}。故障排除需要考虑的因素包括避免微硬度测试时脱水，并确保凹槽间距充足，以防止测量干扰。硬度读数不一致可能源于表面不规则，强调标准化表面准备的重要性，包括在复合材料放置及后续抛光过程中使用玻璃滑台。

尽管该协议具有可重复性，但存在固有局...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氧化铝抛光盘	RubyPlaton, Inci Dental Tibbi Malz. San. ve Tic. Ltd. Sti., 伊斯坦布尔, 土耳其	5714	中等、精细、超精细，用于修整和抛光
分析天平			用于称量材料
人工唾液溶液	DIN 53160-1, Testonic Laboratory, 伊斯坦布尔, 土耳其		用于浸泡周期间的储存
数字pH计	Hanna Instruments, 伍恩索克特, RI, 美国	HI2211	测量饮料pH
蒸馏水	未指定	不适用	用作控制溶液和样品储存
玻璃显微镜载玻片	宁波真莱进出口有限公司, 浙江, 中国	7102	用于复合材料铺设时获得平坦的样品表面
量筒	未指定	不适用	用于测量液体体积
高填充纳米混合树脂复合材料（EA）	Estelite Asteria（东京铂牙科, 东京, 日本）	10942	用作修复材料；填料含量和树脂基体成分不同
孵化器	Memmert Universal, Memmert GmbH + Co. KG, 施瓦巴赫, 德国	UN55	用于在37°C下储存
可注射纳米混合树脂复合材料（GUI）	G-ænial Universal Injectable（GC Corporation, 东京, 日本）	12365	用作修复材料；填料含量和树脂基体成分不同
实验室烧杯	未指定	不适用	用于制备乳清蛋白溶液
实验室摇床	未指定	不适用	用于混合和溶液的均质化
LED光固化装置和辐射计	啄木鸟LED固化装置（桂林啄木鸟医疗器械有限公司, 广西, 中国）	FD-300	聚合和光强度验证
微动手柄	FX205, NSK Ltd., 鹿沼, 日本	C1056002	用于抛光程序
中等填充纳米混合树脂复合材料（FU）	Filtek Universal（3M ESPE, 圣保罗, MN, 美国）	6570A2	用作修复材料；填料含量和树脂基体成分不同
硅胶模具	未指定	不适用	圆盘形，直径6毫米×厚度2毫米，用于制造样品
维氏微硬度计	HMV, 京都仪器有限公司, 京都, 日本	HMV-G31	维氏硬度数（VHN）测试
乳清蛋白浓缩粉	草莓味乳清蛋白, Proteinocean Gida AS., 安卡拉, 土耳其		乳糖含量：~1–2%，蛋白质含量：~85–90%
乳清蛋白分离粉	巧克力味乳清蛋白分离粉, Proteinocean Gida AS., 安卡拉, 土耳其		乳糖含量：~4–6%，蛋白质含量：~70–80%