代表性靶向分子与基因组学特征分析在毒力基因中的应用 金黄色葡萄球菌 由糖尿病足感染

摘要

本研究通过抗菌药物敏感性试验、基于PCR的毒力特征分析以及全基因组测序，对从糖尿病足感染中分离的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抗菌药物耐药机制、毒力决定因子及基因组特征进行了表征。

摘要

糖尿病足感染（DFIs）是重大的公共卫生问题，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是最具临床意义的病原体之一。本研究调查了从糖尿病足感染患者中分离出的多重耐药金黄色葡萄球菌（S. aureus）中毒力基因（cna 和 hlg）、抗菌药物耐药谱以及代表性基因组特征的流行情况。研究于2024年1月至12月期间对125例糖尿病足感染患者开展了横断面观察性研究。根据美国临床与实验室标准协会（CLSI）指南，采用 Kirby–Bauer 纸片扩散法和头孢西丁筛选法进行抗菌药物敏感性试验，并以 S. aureus ATCC 25923 作为质控菌株。万古霉素敏感性通过最低抑菌浓度（MIC）试验确认。采用聚合酶链式反应（PCR）检测毒力基因（cna 和 hlg）以及 blaOXA-I 类基因。对两个代表性分离株——包括一个多重耐药（MDR）分离株和一个广泛耐药（XDR）分离株——采用从头测序（de novo）方法进行全基因组测序（WGS），以生成草图基因组组装。在125份临床样本中，90份（72%）观察到细菌生长，其中45株（50%）被鉴定为 S. aureus。在这些分离株中，35/45（77.78%）被归类为MRSA，36/45（80%）具有多重耐药性。hlg 基因在所有分离株中均被检出，而 cna 基因仅在13/45（28.89%）的分离株中检出。未检测到 blaOXA-I 类基因。基因组分析鉴定出多个耐药相关基因，包括 blaZ、tet(38)、norA 和 vanT，同时发现CRISPR-Cas系统元件及质粒相关的耐药决定因子。这些结果凸显了多重耐药 S. aureus 在糖尿病足感染中的高流行率，并强调了持续对临床重要耐药菌株开展基因组监测的重要性。

引言

多种定植和毒力特征使革兰氏阳性菌Staphylococcus aureus（S. aureus）成为一种常见的机会性病原体，可引起多种感染，包括脓疱病、伤口感染、疖肿、皮肤脓肿、菌血症和感染性心内膜炎¹。其中部分感染可能发展为严重疾病，需要住院治疗，尤其在患有糖尿病、免疫抑制、恶性肿瘤、留置导尿管或人类免疫缺陷病毒感染的患者中更为常见¹。

耐甲氧西林S. aureus（MRSA）菌株由于能够快速获得抗菌药物耐药决定因子并在医疗环境中长期存在，常导致严重的发病率和死亡率¹。糖尿病患者因神经病变、血管功能不全和免疫反应受损，常发生糖尿病足溃疡²。糖尿病足感染（DFI）具有复杂的病理生理机制，其临床结局受到微生物因素和宿主相关因素的共同影响，包括细菌毒力³。尽管糖尿病足溃疡中可能存在由需氧菌、厌氧菌和真菌组成的多微生物群落，S. aureus仍是从这些感染中分离到的主要病原体之一⁴。该病原体具有多种毒力决定因子，可促进免疫逃逸、组织侵袭、慢性定植和持续感染。此外，通过mecA/SCCmec介导的甲氧西林耐药及其他抗菌药物耐药决定因子的获得，已显著限制了DFI相关感染的治疗选择^4,5。既往研究报道，在糖尿病足感染中多重耐药（MDR）S. aureus分离株的检出率较高，其耐药性常与β-内酰胺酶基因相关，包括bla_TEM、bla_OXA和bla_CTX-M变异型⁶。

多个毒力相关基因参与了金黄色葡萄球菌（S. aureus）在慢性伤口感染中的致病性和持续存在。其中，hlg 基因编码γ-溶血素，这是一种与组织破坏、炎症反应、免疫逃逸以及社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株的持续存在相关的细胞毒性因子^7,8。而cna基因则编码一种胶原结合粘附素，可促进细菌黏附于富含胶原的组织，从而有助于慢性定植和感染的持续⁸。既往研究发现，从糖尿病足感染中分离出的MRSA菌株中hlg基因具有较高的检出率，突显了此类感染中同时存在毒力因子和抗菌药物耐药决定因子的现象⁹。不合理的抗生素暴露、长期住院、抗菌药物在组织中的渗透不良以及慢性伤口的进展，进一步促进了糖尿病足感染（DFI）患者中多重耐药（MDR）微生物的出现与传播¹⁰。根据国际定义，多重耐药（MDR）细菌指对三类或以上抗菌药物类别中的至少一类药物具有耐药性；广泛耐药（XDR）细菌仅对一或两类抗菌药物类别仍保持敏感；泛耐药（PDR）细菌则对所有测试的抗菌药物类别均耐药¹⁰。尽管金黄色葡萄球菌（S. aureus）在糖尿病足感染中的临床重要性已被公认，但目前仍缺乏将该地区临床分离株的毒力决定因子与抗菌药物耐药谱进行整合的分子与基因组学信息。

因此，本研究旨在表征耐药模式，确定所选毒力基因（hlg 和 cna）的流行情况，调查 bla_OXA-group I 基因的存在，并对从糖尿病足感染患者中分离出的代表性多重耐药 S. aureus 菌株进行全基因组测序分析。

方案

1. 研究对象

本研究于2023年12月24日获得伊拉克安巴尔省拉马迪市伊拉克高等教育与科学研究部安巴尔大学伦理审批委员会的批准（批准编号：145）。所有涉及人类参与者的程序均依照安巴尔大学的机构伦理指南进行。在参与者入组前，均已获得其签署的知情同意书。

一项横断面观察性研究于2024年1月至12月在伊拉克安巴尔省拉马迪教学医院及附属私立诊所开展。研究期间连续纳入125例符合条件的糖尿病足感染（DFI）患者。样本量根据研究期间可获得的符合条件患者数量确定，而非通过统计学计算得出。临床上，糖尿病足感染定义为1型糖尿病（T1DM）或2型糖尿病（T2DM）患者存在任何分级的足部溃疡。研究纳入了不同溃疡严重程度的男性和女性患者。

如果患者经临床诊断为糖尿病足溃疡，且就诊于参与研究的医疗机构并签署知情同意书，则符合入组条件。排除标准包括：非糖尿病引起的足溃疡（如创伤性溃疡）、由其他医疗机构转诊、因病情危重无法签署知情同意书、在采集标本前48小时内接受过抗生素治疗，以及存在多微生物感染。排除多微生物感染患者是为了确保对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分离株进行准确的表型、分子和基因组特征分析。采用结构化问卷收集患者的 demographic 和临床资料，包括年龄、性别、糖尿病并发症、糖尿病病程、抗生素使用史以及合并症情况。

临床标本在采集后2小时内，使用含有Amies培养基的无菌转运拭子，在冷藏条件（4 °C）下运送至微生物学实验室，并立即进行微生物学分析。所有涉及临床标本、细菌培养、抗菌药物敏感性试验、聚合酶链式反应（PCR）以及紫外（UV）成像的操作均在生物安全二级（BSL-2）实验室条件下进行，并遵循机构的生物安全指南。实验室人员佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括实验服、一次性手套、外科口罩，并在需要时使用眼部防护装置。在整个微生物学和分子生物学操作过程中严格执行无菌操作，以最大限度地减少污染和暴露风险。细菌培养操作和DNA扩增程序分别在专用工作区域进行，以防止交叉污染。受污染的材料，包括培养皿、拭子、移液器吸头和其他一次性物品，在丢弃前于121 °C、15 psi条件下高压灭菌15–20分钟。锐器丢弃于指定的防刺穿生物危害容器中。生物废弃物按照机构的生物医学废弃物处理规程进行管理。这些生物安全措施确保了对多重耐药菌（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素分离株）的安全操作（图1）。

图1：本研究中使用的临床、微生物学、分子生物学、全基因组测序及生物信息学工作流程概览。该图总结了样本采集、微生物培养、抗菌药物敏感性试验、基于PCR的分子检测、全基因组测序以及后续的生物信息学分析流程。本图在基于人工智能的设计平台Gamma Pro（Gamma App）辅助下生成，随后由作者审阅、修改并验证其科学准确性。请点击此处查看此图的放大版本。

数据采用 SPSS 22.0 版本软件进行分析。计算了包括均值和百分比在内的描述性统计量。分类变量之间的关联性采用卡方检验进行分析。P 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

2. 样品的处理与收集

使用深部拭子技术从糖尿病足溃疡的深部区域采集标本。在用无菌手术刀清创并用无菌生理盐水清洗以尽量减少定植微生物污染后，将两根预先用无菌肉汤润湿的无菌棉签用力在伤口基底旋转。其中一根棉签用于革兰染色，另一根棉签用于微生物培养。直接制备的革兰染色涂片通过显微镜进行检查。

在无菌条件下，通过外科清创术从临床疑似骨髓炎患者获取骨组织标本。在采集标本前，使用无菌生理盐水清洗溃疡表面，以减少表面污染。采用无菌外科器械无菌采集骨组织样本，并立即转移至无菌容器中，用于微生物学处理。

在无菌条件下将标本进行匀浆或精细剪碎，并接种于血琼脂、甘露醇盐琼脂（MSA）、麦康凯琼脂和营养琼脂平板上。平板于37 °C有氧条件下培养18–24小时。血琼脂和营养琼脂支持革兰阳性菌和革兰阴性菌的生长，而MSA用于选择性分离和鉴别葡萄球菌属（Staphylococcus）菌种，包括金黄色葡萄球菌（S. aureus）。麦康凯琼脂用于分离革兰阴性细菌。培养后观察培养平板，若标本在48小时后无可见菌落生长，则报告为“无生长”。

初步细菌鉴定基于菌落形态、革兰染色及生化特性，随后通过PCR扩增nuc基因对S. aureus进行分子学确认。生化鉴定包括触酶试验、玻片和试管凝固酶试验、甘露醇发酵试验以及DNase试验。经确认的分离株进一步采用VITEK 2 Compact系统配合VITEK 2 GP鉴定卡进行鉴定。仅当置信度≥95%时，鉴定结果方可被接受。对于结果不一致或置信度较低的情况，需重复进行生化分析及VITEK系统检测。纯培养分离株保存于含20%甘油的脑心浸液（BHI）肉汤中，用于后续的分子及基因组学分析（图1）。

3. 抗微生物药物敏感性试验

根据临床与实验室标准协会（CLSI）2022年指南，采用 Kirby–Bauer 纸片扩散法进行抗菌药物敏感性试验。试验在 Mueller–Hinton 琼脂上进行，琼脂厚度标准化为 4 mm。使用比浊计将新鲜细菌培养物调整至 0.5 麦氏标准浓度，随后用无菌棉签均匀涂布接种琼脂表面。

使用的抗菌药物纸片包括：氨苄西林（10 µg）、庆大霉素（10 µg）、阿米卡星（30 µg）、头孢西丁（30 µg）、头孢呋辛（30 µg）、哌拉西林/他唑巴坦（100/10 µg）、美罗培南（10 µg）、阿莫西林-克拉维酸（30 µg）、苯唑西林（1 µg）、左氧氟沙星（5 µg）、克林霉素（2 µg）、替加环素（15 µg）、环丙沙星（5 µg）、红霉素（15 µg）、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（25 µg）、利奈唑胺（30 µg）和万古霉素（30 µg）。平板在37 °C有氧条件下孵育16–18小时。抑菌圈直径根据CLSI折点进行判读。

根据CLSI建议，使用头孢西丁（30 µg）筛选法鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。质控试验采用金黄色葡萄球菌 ATCC 25923进行。所有实验均重复两次，以确保可重复性。根据抗菌药物耐药谱，按照国际标准定义对多重耐药（MDR）、广泛耐药（XDR）和泛耐药（PDR）分离株进行分类（图1）。

4. 耐甲氧西林的检测 S. aureus 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)

采用头孢西丁（30 µg）纸片扩散法作为检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的表型方法。抑菌圈直径≥22 mm的分离株被归类为甲氧西林敏感株。 S. aureus （MSSA），而根据CLSI标准，抑菌圈直径≤21 mm的菌株被归类为MRSA（图1).

5 通过最小抑菌浓度（MIC）检测确定万古霉素耐药性

根据CLSI指南，采用肉汤微量稀释法测定万古霉素的最低抑菌浓度（MIC）¹¹。在穆勒-欣顿肉汤中制备万古霉素的连续两倍稀释液（4–512 µg/mL）。将细菌悬液调整至0.5麦氏标准，并稀释至约1 × 10⁵ CFU/mL。

在37 °C孵育24小时后，MIC定义为未观察到可见细菌生长的最低浓度。万古霉素敏感性根据CLSI标准解释如下：敏感（≤2 µg/mL）、中介（4–8 µg/mL）和耐药（≥16 µg/mL）^11,12（图1）。

6. 分子检测

6.1 DNA 提取

Staphylococcus aureus 分离株在脑心浸液（BHI）肉汤中于 37 °C 培养 24 小时。使用商用试剂盒和自动化核酸提取系统提取细菌基因组 DNA。提取的 DNA 储存于 −20 °C，待用。采用荧光计测定 DNA 浓度，以评估其是否适用于 PCR 扩增。DNA 平均浓度为 85 ± 8.2 ng/µL。

针对 cna、hlg 和 D 类 β-内酰胺酶（bla_OXA-group I）基因的引物购自商业来源，并用于 PCR 扩增，具体如表1^13,14,15,16 所示。

表1：本研究中用于目标基因PCR扩增的引物序列。 该表格总结了目标基因、引物序列、预期扩增片段大小、退火温度以及参考文献，这些信息用于对从糖尿病足感染分离的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中nuc、mecA、hlg、cna和bla_OXA-group I基因进行PCR扩增。请点击此处下载该表格。

6.2 通过PCR进行毒力基因和D类β-内酰胺酶（bla_OXA-group I）基因的分子检测

本研究中使用的引物序列列于表1中。mecA、nuc、毒力相关基因以及D类β-内酰胺酶（bla_OXA-group I）基因的PCR扩增在25 µL反应体系中进行，反应体系包含12.5 µL GoTaq Green Master Mix（2×）、0.5 µL MgCl₂、3 µL基因组DNA模板、各1 µL的正向和反向引物（10 pmol/µL）以及7 µL无核酸酶水。

热循环条件包括：95 °C 预变性 5 分钟；随后进行 30–35 个扩增循环，每个循环包括 95 °C 变性 30 秒至 1 分钟，根据引物组合在 50–62 °C 退火 30 秒至 1 分钟，以及 72 °C 延伸 30 秒至 1 分钟；最后在 72 °C 进行 7–19 分钟的最终延伸。

采用含Safe Red染料的1.5%–2%琼脂糖凝胶对扩增的PCR产物进行分离，并使用凝胶成像系统在紫外光下观察。每次PCR扩增均设置阴性对照，以确认扩增结果的有效性。

7. 全基因组测序（WGS）

对两株从糖尿病足感染患者骨组织标本中分离得到的代表性临床Staphylococcus aureus菌株进行了全基因组测序（WGS）。所选菌株包括一株耐多药（MDR）菌株和一株广泛耐药（XDR）菌株，其耐药表型通过表型抗菌药物敏感性试验及最低抑菌浓度（MIC）确认的耐药谱确定。该策略实现了对临床相关耐药菌株的代表性基因组特征分析（图1）。

在测序前，对基因组DNA的质量、浓度和完整性进行评估，以确保其适用于文库构建及后续的生物信息学分析。使用荧光计对DNA进行定量，并通过150 V电压下运行40分钟的1%琼脂糖凝胶电泳验证其完整性。采用磁珠纯化法选择片段大小约为200–400 bp的DNA片段，随后进行末端修复、3′端腺苷化以及接头连接。

通过使用连接接头片段的拼接寡核苷酸进行扩增、纯化和环化，生成单链环状DNA分子。随后通过滚环扩增生成DNA纳米球（DNBs）。测序在DNBSEQ平台上采用组合探针锚定合成（cPAS）化学法进行。

原始测序读段经过质量控制流程，以去除低质量读段、接头污染、模糊读段及重复序列。高质量读段用于后续分析。通过基因组组装评估基因组大小、GC含量及测序覆盖深度。最终的基因组草图以FASTA、GenBank和NCBI提交格式生成。

基因组注释鉴定了编码序列（CDS）、转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）和小RNA（sRNA）基因。利用多个数据库对预测的基因进行功能注释，这些数据库包括Swiss-Prot、COG、KEGG、CAZy、VFDB、ARDB和CARD，用于鉴定与毒力和抗菌素抗性相关的基因。

8. 生物信息学分析

基因组组装与注释采用细菌与病毒生物信息学资源中心（BV-BRC）完成。系统发育分析使用PATRIC工具进行。生成环形基因组可视化图谱，以展示编码序列、GC含量、GC偏移、抗菌药物耐药决定因子、毒力相关基因以及可移动遗传元件。

系统发育关系通过Mash/MinHash分析从最近的参考基因组中鉴定出的PATRIC全球蛋白质家族（PGFams）来确定。使用MUSCLE生成蛋白质序列比对，并将相应的核苷酸比对结果映射到蛋白质家族上。采用RAxML构建系统发育树，并进行快速自举分析（图1）。

使用 Pathogenwatch 对基因组重叠群进行进一步分析，以确认物种并检测抗菌素耐药基因。毒力相关基因通过 ABRicate 进行分析。PATRIC 基因组注释服务采用基于 k-mer 的方法识别抗菌素耐药基因，并进行功能注释、抗菌药物分类及耐药机制分配。代表性多重耐药和耐甲氧西林S. aureus 分离株的环形基因组可视化图谱按先前所述方法生成¹⁷。补充表 1 汇总了基因组分析中使用的所有生物信息学工具、软件版本、数据库及分析参数。

结果

标本处理与培养阳性率

本研究共收集并分析了125份临床标本。在125份样本中，有90份（72%）观察到细菌生长。这些培养阳性的标本随后用于细菌鉴定及抗菌药物敏感性试验。采用描述性统计方法（包括频数和百分比）对所有临床标本及培养阳性样本中细菌分离株的分布情况进行汇总。本阶段未进行推论性统计分析。

细菌属的分布

在90份培养阳性的样本中，45/90（50%）被鉴定为Staphylococcus aureus，其次是Escherichia coli（23/90，25.55%）、凝固酶阴性葡萄球菌（10/90，11.11%）、Pseudomonas spp.（7/90，7.78%）和Acinetobacter baumannii（5/90，5.56%）。

患者层面的分离 ...

讨论

由多重耐药（MDR）微生物引起的糖尿病足感染（DFIs）在全球范围内呈上升趋势，血糖控制不佳和足部卫生不良是导致发病率和死亡率升高的重要因素^18,19,20,21尽管深部真菌感染常为多微生物性， 金黄色葡萄球菌 仍然是这些感染中分离出的主要病原体之一，其中耐甲氧西林的检出率较高 S. aureus 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在医疗相关和社区相关环境中的感染率均呈上升趋势^22,23,24,25在本研究中， S. aureus 从36%的患者中分离出该菌株，其中77.78...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Abricate 软件	GitHub（T. Seemann）	开源	毒力基因检测
琼脂糖	Invitrogen，美国	16500-500	凝胶电泳
Agencourt AMPure XP 试剂盒	贝克曼库尔特	A63881	DNA纯化与片段大小筛选
阿米卡星（30 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT0107B	AST
抗生素纸片（氨苄青霉素 20 µg)	Oxoid，英国	CT0003B	抗菌药物敏感性试验
血琼脂基础	Oxoid，英国	CM0055	革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的分离
脑心浸液（BHI）肉汤	Oxoid，英国	CM1135	分离株的培养与保存
头孢西丁（30 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT0119B	耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测
头孢呋辛（30 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT0026B	AST
环丙沙星（5 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT0425B	AST
克林霉素（2 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT0064B	AST
DNBSEQ 平台	中国华大基因	各种	全基因组测序
红霉素（15 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT0020B	AST
FastQC	<强>Simon Andrews，Babraham 研究所 （Babraham 生物信息学）	NA	排队系统
凝胶成像系统	Bio-Rad，美国	凝胶成像系统™ XR+	电泳凝胶成像
庆大霉素（10 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT0024B	AST
甘油（分子级）	Sigma-Aldrich	G5516	长期分离物保存时使用20%
GoTaq Green Master Mix (2×)	美国普洛麦格公司	M7122	PCR 扩增混合液
左氧氟沙星（5 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT1587B	AST
利奈唑胺（30 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT1716B	AST
麦康凯琼脂	Oxoid，英国	CM0007	革兰氏阴性菌选择性培养基
甘露醇盐琼脂（MSA）	Oxoid，英国	CM0085	金黄色葡萄球菌属选择性/鉴别培养基
美罗培南（10 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT0774B	AST
MgCl₂2 溶液	美国普洛麦格公司	各种	PCR反应组分
穆勒-欣顿琼脂	Oxoid，英国	CM0337	用于 Kirby–Bauer纸片扩散试验
MUSCLE 比对工具	开源	各种	蛋白质序列比对
无核酸酶水	美国普洛麦格公司	P1193	PCR反应组分
营养琼脂	Oxoid，英国	CM0003	通用培养基
苯唑西林（1 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT0159B	AST
病原体监测	威康桑格研究所	在线工具	物种鉴定 &和 AMR 基因检测
PATRIC / BV-BRC	细菌生物信息学资源中心	在线平台	基因组组装 &和注释
哌拉西林/他唑巴坦（100/10） µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT1628B	AST
Proksee基因组可视化工具	多伦多大学	在线工具	基因组图谱可视化
Quantus 荧光仪	美国普洛麦格公司	E6150	DNA 定量
Qubit 荧光仪	赛默飞世尔科技	Q33238	全基因组测序的DNA定量
RAxML 软件	开源	各种	系统发育分析
S. aureus ATCC 25923	ATCC，美国	25923	药敏试验质控菌株
安全型红色染料	iNtRON Biotechnology	各种	DNA凝胶染色剂
SaMag 细菌DNA提取试剂盒	Sacace Biotechnologies，意大利	各种	基因组DNA提取
SaMag-12 自动化提取系统	意大利 Sacace Biotechnologies	SMG-12	自动化核酸提取仪
无菌棉签	不同制造商	各种	用于深部拭子采样技术的样本采集
无菌生理盐水	不同制造商	各种	用于采样前清洗溃疡表面
无菌手术刀片	不同制造商	各种	用于取样前的溃疡清创
替加环素（15 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT1849B	AST
甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（25 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT0052B	AST
紫外透射仪	不同制造商	各种	PCR产物的可视化
万古霉素（30 µg) 圆盘	Oxoid，英国	CT0588B	AST
VITEK 2 Compact	BioMé里厄，法国	各种	自动化鉴定系统
VITEK 2 GN 鉴定卡	BioMé里厄，法国	各种	革兰氏阴性菌的鉴定