从组织到形态测量：成年小鼠神经元及树突棘分析的逐步高尔基-考克斯实验流程

摘要

本文介绍了一种用于成年小鼠的高尔基-考克斯染色的逐步操作方法，涵盖溶液配制、组织浸渍、冷冻保护、切片、显影和封片等步骤。该方法强调组织保存以及均匀且背景低的染色效果，可清晰显示神经元形态。该技术可标记树突分支，并支持对树突棘进行定量形态学分析。

摘要

健康与疾病状态下的神经元形态学分析对于理解脑功能以及评估实验干预效果具有重要意义。高尔基-考克斯染色（Golgi–Cox staining）作为一种经典且高度相关的技术，可用于完整神经元树突分支及树突棘的可视化观察。然而，已发表的实验方案在关键操作步骤上常存在差异，且往往缺乏必要的方法学细节，导致染色质量差异显著，实验室标准化过程耗时且困难。本文提供了一套针对成年小鼠的全面、分步式高尔基-考克斯染色方案，涵盖从样本准备到成像的完整工作流程 体内 从样本处理与组织制备到成像及形态计量学数据提取。本文详细阐述了影响浸渍效率、切片完整性以及信噪比的实际注意事项和常见问题，并提供了提高可重复性的方法学指导。总体而言，该方案可实现对完整神经元、树突片段及树突棘的可靠可视化与定量分析。预计本资源将有助于以更高的一致性、透明度和技术严谨性开展高尔基-考克斯染色，并为在不同实验室条件下优化该方法提供清晰的框架。

引言

Golgi-Cox 染色法的总体目标是实现对固定脑组织中完整神经元形态（包括树突分支和树突棘）的高分辨率可视化^1,2,3,4。该技术可对复杂神经环路中的单个神经元进行详细的结构分析，因此在突触可塑性、神经发育、神经退行性变以及经验依赖性结构重塑等研究中具有重要价值^5,6。

基于高尔基的方法之所以被开发并持续使用，其根本原因在于这些方法具有独特的能力，可实现稀疏而完整的神经元浸渍^1,2。该方法最初由Camillo Golgi于1873年提出，并于1891年由Cox进一步优化^7,8，其原理是在有限数量的神经元内沉淀铬酸银，从而在无标记重叠的情况下实现完整的形态学重建³。高尔基-考克斯改良法用氯化汞替代了原始高尔基法中的硝酸银，提高了染色剂在组织中的渗透性和染色的一致性²。与荧光蛋白表达、病毒示踪或染料填充等其他神经元标记技术相比，高尔基-考克斯染色具有多项优势：它无需基因操作、立体定位注射或特殊的显微镜设备，且可在明场显微镜下以高对比度清晰显示树突棘^1,2。尽管现代基于荧光的方法能够实现细胞类型特异性标记，但高尔基-考克斯染色在无偏倚的形态学取样^9,10以及在缺乏转基因工具的物种或实验条件下仍具有显著优势。

在更广泛的研究文献中，高尔基染色法已被广泛用于学习与记忆⁵、应激与精神疾病¹¹、衰老¹²以及阿尔茨海默病等神经退行性疾病^12,13,14研究中树突棘密度和形态的定量分析。该方法数十年来的持续使用凸显了其在结构神经解剖学中的可靠性²。当需要实现神经元的全细胞可视化时，该技术特别适用于分析脑组织中的树突结构和树突棘形态¹。它也非常适合用于不同实验组之间的形态学比较研究。然而，若研究者需要细胞类型特异性标记、活体成像或分子共定位分析，则荧光标记或基因编码标记方法可能更具优势^9,10。

方案

本研究使用了3只成年雌性野生型B6129SF2/J小鼠（n = 3）。然而，在成年阶段，两性小鼠均可获得类似的染色结果。所有实验程序均事先获得生物伦理委员会批准。（编号：#117.A，墨西哥国立自治大学神经生物学研究所（INb））

1. 溶液的配制

警告：氯化汞具有剧毒且具腐蚀性。操作时须在化学通风橱内进行，并佩戴手套、实验服和眼部防护装备。废弃物应弃置于贴有标签的危险废物容器中。重铬酸钾和铬酸钾为有毒、致癌性氧化剂。操作时须在化学通风橱内进行，避免皮肤接触或吸入。

1. 配制储备浸渍溶液
   1. 称取15 g重铬酸钾，溶于300 mL双蒸水中，配制成5% (w/v) 溶液。
   2. 称取15 g氯化汞，溶于300 mL双蒸水中，配制成5% (w/v) 溶液。
   3. 称取15 g铬酸钾，溶于300 mL双蒸水中，配制成5% (w/v) 溶液。
   4. 将所有容器用铝箔包裹，室温避光保存。
2. 配制Golgi–Cox工作液
   1. 取50 mL重铬酸钾溶液、50 mL氯化汞溶液和40 mL铬酸钾溶液混合。
   2. 加入100 mL蒸馏水，充分混匀。
   3. 室温避光孵育48小时。
   4. 静置使沉淀沉降，仅使用上清液进行组织浸渍。
      ​注意：Golgi–Cox溶液在避光条件下可保存最多1个月。为减少试剂浪费并确保溶液新鲜，仅配制实验所需的储备溶液和最终Golgi–Cox溶液的体积。每份脑组织至少配制23 mL溶液，以保证沉淀损失后可获得20 mL可用上清液。
3. 配制冷冻保护液
   1. 将300 g蔗糖溶解于0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，该缓冲液由无水磷酸氢二钠、一水合磷酸二氢钠和氯化钠配制而成。
   2. 定容至1 L。
   3. 4 °C保存，最多可使用一周。

2. 组织采集与浸渍

1. 进行心脏灌注
   1. 使用戊巴比妥钠（252 mg/kg，腹腔注射）麻醉动物。在继续操作前，通过检查足底回缩反射是否消失来确认麻醉深度足够。
   2. 用约30 mL的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）进行心脏灌注，直至流出液澄清，以确保脑组织中的血液被完全清除。本实验流程中不使用固定剂；Golgi–Cox溶液本身在此流程中起固定作用。
   3. 小心取出脑组织，并用蒸馏水冲洗。确保脑组织已充分灌注且无残留血液（图1A）。
2. 组织浸渍
   1. 使用脑切片模具将脑组织分为半球或冠状切块（厚度约3 mm），以提高浸渍效果。较小的组织块有助于更均匀的浸渍并减少变异性，而较大的样本可能需要更长的孵育时间，且染色可能不够均一。
   2. 将脑组织置于10 mL Golgi–Cox溶液中，并避光保存。
      ​注意：10 mL Golgi–Cox溶液足以浸渍一整只成年小鼠的脑组织。当使用单侧半球或较小的冠状切块（厚度约3 mm）时，可按比例减少溶液体积，前提是组织始终完全浸没在溶液中。若使用整脑，建议在保留目标区域的前提下进行切分，以确保试剂充分渗透和均匀浸渍。
   3. 在室温下孵育24小时。
   4. 更换为10 mL新鲜的Golgi–Cox溶液，在22–25 °C避光条件下孵育10–14天。
      暂停点：组织可在Golgi–Cox溶液中保存长达15天，而不会显著影响活性。
      注意：Golgi–Cox浸渍后，脑组织呈现深金黄色且变得极为脆弱，因此需小心操作（图1B）。建议使用塑料镊子操作，以避免与金属材料发生化学反应。

3. 冷冻保护

1. 将组织转移至10 mL冷冻保护液中（含30%蔗糖（w/v）的0.1 M PBS，pH 7.4，于步骤1.3中配制）。
2. 在4 °C下孵育24小时。
3. 在同一温度（4 °C）下，更换新鲜冷冻保护液，并继续孵育至少4–7天。
   暂停点：切片前，组织可在4 °C下于冷冻保护液中保存长达3周。

4. 包埋与切片

1. 包埋组织
   1. 用热蒸馏水配制8% (w/v) 琼脂糖溶液，冷却至约40 °C。
   2. 将组织放入包埋模具中，并进行适当定向。
   3. 将琼脂糖覆盖于组织上，在室温下静置1小时或在4 °C下30分钟使其凝固（图1C）。
   4. 修整组织块周围的多余琼脂糖（图1D）。
2. 切片组织
   1. 使用粘合剂将琼脂糖组织块固定在振动切片机载物台上（图1E）。
   2. 向切片室中加入防冻保护液。
   3. 以100–200 µm厚度进行切片。对于树突棘分析，建议采用较薄切片（例如100–120 µm），以提高成像分辨率；而对于完整神经元重建，则可采用较厚切片（例如150–200 µm）。本研究中切片厚度为120 µm（图1F）。
   4. 使用软毛刷收集切片。
      注意：在材料表中记录振动切片机的设置参数。切片贴附于载玻片后，切勿在任何情况下用水冲洗载玻片。蔗糖将在显色步骤前起到保护组织的作用。

5. 封片

1. 明胶包被载玻片的制备
   1. 将0.5 g明胶溶于100 mL蒸馏水中（0.5% w/v），加热至沸腾，配制包被溶液。
   2. 搅拌至明胶完全溶解，并让溶液冷却至室温。
   3. 加入0.05 g铬钾硫酸盐（0.05% w/v），搅拌至完全溶解。必要时去除残留泡沫。
   4. 用滤纸过滤明胶溶液，以去除未溶解的颗粒和残留泡沫，确保载玻片涂层均匀。
   5. 用中性洗涤剂和水清洗玻璃载玻片，充分冲洗后，再用蒸馏水冲洗。
   6. 将载玻片浸入96%乙醇中，直至无可见液滴残留。
   7. 在50–60 °C烘箱中干燥30分钟或直至完全干燥。
   8. 将载玻片浸入明胶溶液中，然后让多余的溶液流尽。
   9. 将载玻片置于50–60 °C烘箱中干燥30分钟或直至完全干燥。
   10. 重复包被和干燥过程至少五次，以确保良好的粘附性。
   11. 最后一次干燥后，将载玻片置于无尘环境中冷却至室温（例如置于化学通风橱内），并储存于洁净密闭容器中备用。
       注意：仅配制所需数量载玻片所需的明胶溶液体积。试剂用量可按比例调整，但需保持规定的浓度（w/v）。
2. 使用软毛刷将组织切片转移至明胶包被的显微镜载玻片上
   注意：使用至少包被五层0.5%明胶的载玻片。应新鲜制备载玻片，以确保在后续染色过程中组织完整性。本实验方案未测试带电荷载玻片的效果。
3. 用冷冻保护液浸湿吸水纸，并覆盖于组织切片上。
4. 用手掌轻轻按压，以排除气泡，确保组织切片与明胶包被载玻片之间充分接触，从而在后续处理过程中促进稳定粘附。
   注意：轻柔加压可最大化切片与明胶层之间的接触，提高粘附性，降低在水性染色过程中组织脱落的风险。
5. 小心移除吸水纸，将载玻片在避光条件下于室温干燥2–3天。
   注意：在低湿度环境中干燥对实现稳定粘附至关重要。避光可最大限度减少光化学反应对高尔基-考克斯浸渍组织的损伤，因为该组织因含铬酸盐而对光敏感。此外，残留的琼脂糖不会显著干扰染色过程，在染色后的切片中可观察到其围绕组织存在（图2A）。琼脂糖的存在有助于切片贴附过程中更安全地操作组织，因为高尔基-考克斯浸渍的组织极为脆弱。如需要，可在切片贴附到载玻片后手动小心去除多余的琼脂糖。
   暂停点：请将载玻片避光保存。

6. 发育

警告：二甲苯易燃，吸入有毒。应在化学通风橱中操作，避免接触明火。氨水具有腐蚀性，会产生刺激性蒸气。应在通风橱中操作。

1. 复水切片
   1. 将切片浸入蒸馏水中 5 分钟。
   2. 转移至新鲜蒸馏水中 5 分钟。
   3. 浸入 50% 乙醇中 5 分钟。
      ​注意：50% 乙醇步骤可实现从水相条件到脱水的逐步过渡，有助于试剂渗透，并在显色步骤前维持组织完整性。
2. 显色反应
   1. 将切片在显色液（由 2 体积 25% 氨水与 1 体积蒸馏水混合而成（2:1, v/v））中孵育 8 分钟
   2. 用蒸馏水洗涤 5 分钟。
   3. 再次用蒸馏水洗涤 5 分钟。
   4. 在避光条件下，于含 5% (w/v) 硫代硫酸钠的蒸馏水中孵育 10 分钟。
   5. 用蒸馏水洗涤 1 分钟。
   6. 再次用蒸馏水洗涤 1 分钟。
      ​注意：一旦开始显色过程，应连续完成，不得中断。
3. 脱水与透明
   1. 将切片浸入 70% 乙醇中 5 分钟。
   2. 将切片浸入 96% 乙醇中 5 分钟。
   3. 将切片浸入 100% 乙醇中 5 分钟。
   4. 将切片转移至二甲苯中至少 6 分钟。

7. 永久封片

1. 向每个切片上滴加 Permount® 封片介质（折射率约为 1.52）。
   注意：封片介质的折射率应与油浸物镜相匹配，以确保最佳成像质量。
2. 小心放置盖玻片，避免产生气泡。
3. 用透明指甲油密封盖玻片边缘。
4. 将载玻片置于避光环境中，室温下干燥 48 小时。

8. 成像

注意：成像模式和采集配置因显微镜品牌而异；应针对每个系统确定最佳设置。

1. 打开显微镜。
2. 启动显微镜软件。
3. 将切片放置在显微镜载物台上。
4. 使用低倍物镜（如 1X/0.04 N.A. 或 4x/0.10）捕获脑切片的二维宽视野图像（图 2A，B）。

9. 全神经元成像

1. 使用10x/0.25 N.A.或20x/0.40 N.A.物镜，对包含目标神经元的区域采集高分辨率图像序列（图2C）。
   注意：用于分析的神经元应表现出完整且均匀的高尔基-考克斯浸渍，树突分支清晰，背景染色最少。应排除具有截断突起、浸渍不完全、结构重叠或背景信号过高的细胞，以确保形态计量分析的准确性。
2. 对图像进行聚焦，并调整相机设置，包括曝光时间和白平衡。
3. 设定图像序列的上边界和下边界。
4. 在图像采集窗口中将步进距离设置为0.5 µm。
5. 使用软件的图像序列采集命令获取图像序列。
6. 重复上述步骤，以采集所有感兴趣区域的图像。
7. 保存数据文件，并将所有图像文件另存为TIFF格式，用于外部处理。

10. 树突棘成像

1. 使用63倍/1.4数值孔径（N.A.）油浸物镜，在合适的明场显微镜下对包含目标神经元的区域进行高分辨率图像堆栈采集（图2D）。
   注意：本研究中图2D所示的树突棘高分辨率图像是使用蔡司LSM 780型共聚焦显微镜的明场模式获取的。然而，其他明场显微镜也可用于获取63倍高质量的z轴图像堆栈，其成像参数应由各实验室自行标准化。
2. 在载玻片上滴加1–2滴浸油，并将物镜置于载玻片上方，确保物镜与浸油充分接触。
3. 调节图像焦距，并调整相机设置，包括曝光时间和白平衡。
4. 设定图像堆栈的上、下边界范围。
5. 在图像采集窗口中将步进距离设置为0.3 µm。
6. 使用软件中的堆栈采集命令获取图像堆栈。
7. 重复上述步骤，以采集所有感兴趣区域的图像。
8. 保存数据文件，并将所有图像文件以TIFF格式保存，以便后续外部处理。
   ​注意：第9和第10步说明：如果显微镜未配备用于Z轴堆栈采集的电动载物台，可通过手动调节微米级焦距来采集图像。但此时光学切片之间的间距可能不够精确。在此情况下，可利用图像处理软件（例如ImageJ）对所采集的图像序列进行后续Z轴堆栈重建。

11. 形态计量分析

注意：可采用多种方法和专用软件程序实现此目的。用于树突棘分析的一些免费工具包括 ImageJ 或本研究中使用的 PyReconstruct¹⁵。有关 PyReconstruct 及其在神经元重建和形态测量分析中的功能的更详细描述，请参见参考文献。

1. 树突棘形态计量分析步骤
   1. 在 ImageJ 中打开文件后，通过选择将格式更改为 RGB 图像 > 类型 > RGB 颜色.
   2. 在 ImageJ 中将 Z-stacks 转换为图像序列：点击 文件 > 另存为 > 图像序列将每个图像序列保存在单独的文件夹中，以便后续分析。在 PyReconstruct 中，通过点击加载图像序列 文件 > 新 > 从图像中.
   3. 将弹出一个对话框，提示为文件命名（例如，WTVR1N1——野生型溶剂处理小鼠1号神经元1）。
   4. 随后将依次出现三个对话框。在第一个对话框中，输入校准值（µm/px）。该信息可在Z层扫描图像的元数据中找到，并可通过ImageJ访问。
   5. 在第二个窗口中，输入每个连续光学切片的厚度（µm）。最后，图像序列将自动开始加载。补充图 1A).
   6. 在根据研究者定义的纳入标准确定目标节段后，继续进行描记以获取定量数据。
   7. 为每种轨迹指定一个独特的名称和区域。在下方面板中找到这些区域，它们由不同颜色的几何形状表示（补充图1B).
   8. 使用铅笔工具绘制一条对应于所需样本长度的线。然后，使用Z工具沿树突段在Z轴堆栈中生成第二条轨迹。
   9. 使用初始轨迹确定合适的片段长度，并在下方验证 列表 > Z-轨迹列表 (补充图1B).
   10. 在Z轴层叠图像中进行浏览，找出聚焦最佳的树突棘头部。使用铅笔工具勾勒每个棘头最宽的远端区域，然后使用Z工具在整个Z轴层叠图像中追踪棘颈补充图 1C、D). 重复此步骤，直至追踪完所选树突节段内的所有树突棘头部和颈部。
2. 导出树突棘头部测量数据
   1. 打开包含树突棘头部宽度和长度测量值的列表。可通过以下路径访问： 列表 > 追踪列表 （用于宽度）和 列表 > Z-轨迹列表 （用于长度）
   2. 将数据导出至计算机上的指定位置。将生成两个独立的 Excel 文件，每个文件包含相应的测量数据。
3. 分类脊柱形态并计算密度
   1. 从先前生成的 Excel 文件中提取树突棘头部和颈部的宽度与长度测量值。
   2. 数据应整理到标有相应名称的列中 宽度 和 长度 根据以下标准进行形态学分类¹⁶：伪足（filopodia）>2 µm），薄（< 2 µm），短粗型（长度与头宽比 ≤1），以及蘑菇型（头宽） >0.6 µm）。补充图1E在分析的树突节段中，极少观察到丝状伪足，因此未将其纳入分析。
   3. 在此阶段确定所分析树突节段上的总 spine 数量、spine 密度（每线性 µm 的 spines 数），以及每种 spine 亚型的类型和数量。Excel 模板¹⁶ 用于本分析的数据可在参考文献中获取。采用该方法，对12月龄雌性小鼠海马CA1区的基底树突棘密度进行了定量分析。
   4. 使用专为数据分析、绘图和统计设计的科学软件应用程序导出量化数据并生成图表。此处的图表在 图3 使用 GraphPad Prism 软件构建。

结果

组织浸渍与切片
本文所述的高尔基-考克斯（Golgi–Cox）染色法可在成年小鼠脑组织中实现可靠且均一的神经元染色。经高尔基-考克斯溶液浸渍后，脑组织呈现特征性的深金黄色，表明染色液已成功扩散至整个组织。使用振动切片机进行切片，可有效保持神经元胞体及树突突起的结构完整性。

神经元可视化
明场成像显示出轮廓清晰的神经元胞体和树突分支，背景染色极少。可完整观察单个神经元，包括二级和三级树突分支。在更高放大倍数下，树突节段上的树突棘清晰可辨，便于进行形态计量分析。

树突棘的定量分析
为验证本方案在定量结构分析中的适用性，对12月龄雌性小鼠海马CA1区锥体神经元的基底树突棘密度进行了测量。树突棘形态测量所用组织来自三只动物。每只动物分析六个神经元，每个神经元评估三个树突片段（每个片段长10 µm）。每个神经元的树突棘密度值先对各片段取平均，再对各神经元取平均，从而获得每只动物的单一数值。形态学分析使用开源软件（...

讨论

高尔基-考克斯染色法仍是用于在固定脑组织中可视化神经元形态和树突棘的最广泛应用的技术之一^3,4。该方法通过浸渍少量随机分布的神经元，能够在背景染色极低的情况下实现完整树突树的可视化。在本实验方案中，该技术可清晰显示海马区锥体神经元及其树突棘，从而能够利用明场显微镜和Z轴层扫成像进行可靠的形态计量分析。本方案所获得的染色质量和神经元形态的代表性结果如图1和3所示，其中神经元结构的范围从整个组织切片到单个树突棘均有呈现。

一些实用的改进方法和故障排除策略可提高染色的一致性。所有高尔基-考克斯溶液均应避光保存，以维持试剂的稳定性。尽管组织切片在高尔基-考克斯溶液中的典型孵育时间为10–14天，但延长孵育时间至最多15天仍可获得有效的染色结果，尽管可能会观察到血管染色增多的现象。类似地，在切片前长期保存于冷冻保护液中的组织仍可保持足够的染色质量。也可采用其他方法，例如通过漂浮法而非...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Life Technologies	15510-027	CAS 9012-56-6
25% 氨水溶液	Merck	208380	CAS 1336-21-6。危险品。
无水磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S3264	CAS 7558-79-4
明场显微镜	Nikon	Eclipse Ci
硫酸铬钾	Sigma-Aldrich	243361
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 780
电子天平	Accuris Instruments	W3200-1200
包埋模具	Merck	E6032	尺寸：22×22 mm
乙醇	Meyer	394
实验动物	The Jackson Laboratory	2124-01	B6129SF2/J 小鼠品系
明胶粉	Sigma-Aldrich	G2500
GraphPad Prism 软件	GraphPad Software Inc.		版本 8.0.2
ImageJ Fiji 软件	美国国立卫生研究院		版本 1.54p，https://imagej.net/software/fiji/downloads
氯化汞	J.T. Baker	2594-01	CAS 7487-94-7。危险品。
显微镜相机	Nikon	DS-Vi1
显微镜物镜（10×）	Nikon	93183	Plan 10x/0.25 N.A.
显微镜物镜（1×）	Nikon	93180	Plan UW 1x/0.04 N.A.
显微镜物镜（20×）	Nikon	93184	Plan 20x/0.40 N.A.
显微镜物镜（4×）	Nikon	93182	Plan 4x/0.10 N.A.
显微镜物镜（63×）	Zeiss	420782-9900-799	Plan APO 63x/1.4 N.A. 油镜 DIC
显微镜载玻片	Sigma-Aldrich	S8902
一水合磷酸二氢钠	J.T. Baker	3818-05	CAS 10049-21-5
指甲油	SINFUL COLORS	BOLD COLOR	透明
Permount 封片介质	Fisher Scientific	SP15-500
铬酸钾	Productos Químicos Monterrey	2784	CAS 7789-00-6。危险品。
重铬酸钾	Sigma-Aldrich	207802	CAS 7778-50-9。危险品。
PyReconstruct 软件	德克萨斯大学奥斯汀分校		版本 1.19.0，https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
氯化钠	Fermont	24912	CAS 7647-14-5
硫代硫酸钠	Productos Químicos Monterrey	7291	CAS 7772-98-7。危险品。
蔗糖	J.T. Baker (Avantor)	4072-05	66.55° 比旋光度，ACS 级试剂
振动切片机	Leica Biosystems	VT1200S	速度 20 mm/s，振幅 – 0.60 mm
二甲苯	CTR Scientific	CTR05128	CAS 1330-20-7。危险品。