制造可调聚丙烯酰胺水凝胶以研究基质刚度对干莱迪希细胞的影响

摘要

本方案描述了具有可调节刚度的聚丙烯酰胺水凝胶的制备，以研究基质力学对受控二维培养系统中干莱迪希细胞行为的影响。

摘要

细胞外基质（ECM）刚度对干细胞行为起关键调控作用。此前，我们已证明，随着年龄增长，基质僵度的病理性增加会破坏莱迪希干细胞（SLC）的稳态，导致睾酮水平下降。基于这一发现，我们在此介绍了一项详细的协议——最初由我们实验室开发——用于制造具有可调节刚性的聚丙烯酰胺（PA）水凝胶，以模拟体 外睾丸微环境。该方法能够在1–100 kPa的刚度范围内实现可重复的凝胶铸造，涵盖生理到病理的条件。关键步骤包括精准混合丙烯酰胺/双丙烯酰胺、凝胶膨胀平衡、用磺胺-SANPAH激活表面，以及支持SLC粘附和培养的胶原涂层。我们为靶向刚度提供优化配方，并针对聚合不完全和细胞附着不良等常见问题提供故障排除指导。 该系统允许系统性研究底物刚度如何调节SLC增殖、分化和类固醇生成功能，在定义的二维条件下。除了生殖生物学，它还作为其他细胞类型机械生物学研究的宝贵平台，以及筛选针对刚度相关功能障碍的治疗药物。

引言

细胞外基质（ECM）的力学特性在调控干细胞命运中起关键作用，包括增殖、分化和^{功能维持1,2,3,4}。在睾丸中，年龄相关的ECM硬化被认为与睾酮生成的下降有关。然而，其潜在的机械生物学机制仍然了解不足，部分原因是缺乏能够忠实复现睾丸生态位生理刚度范围的标准体外模型。 年轻小鼠睾丸组织的生理刚度约为1–15 kPa，而老年或纤维化组织可达到20–30 kPa或更高。

聚丙烯酰胺（PA）水凝胶已成为研究细胞-基质相互作用的多功能平台，因为其刚度可以通过调节丙烯酰胺与双丙烯酰胺^5,6的比例进行精确调节。与胶原涂层玻璃或商业水凝胶等其他底物相比，PA凝胶能够独立控制刚性和生化配体密度，从而实现对机械线索的系统性剖析。尽管存在多种PA凝胶制备方案7^、8、9，但它们通常缺乏针对特定细胞类型的详细优化，尤其是对于稀有的原发细胞如SLCs。

本文介绍了一种稳健且可重复的方案，用于制备具有明确刚度（1–100 kPa）的PA水凝胶，专为培养小鼠SLCs量身打造。该方法包括凝胶铸造、膨胀平衡、Sulfo-SANPAH表面功能化以及胶原蛋白涂层以促进细胞粘附的逐步说明。遵循该方案，研究人员可以生成可调节刚度（范围为1至100 kPa）的底物，模拟年轻（软睾丸）和衰老（刚硬）睾丸的机械环境，从而实现对刚度依赖性SLC反应的定量研究。该系统还适用于其他机敏细胞类型，并为针对刚度相关病理的药物筛查提供了平台。

方案

所有动物操作均由中山大学机构动物护理与使用委员会批准（批准号SYSU-IACUC-2026-B1278）并按照机构指南进行。

1. 原发小鼠SLC的分离与培养

1. 从C57BL/6小鼠身上剥离睾丸，并小心取出白鞘膜。
2. 把睾丸切成小块。
3. 通过在1 mg/mL胶原酶IV型中，在DMEM/F12中、37ºC培养15分钟，将间质细胞与精细管分离。
4. 添加含有10%胎儿牛血清的DMEM/F12以抑制胶原酶活性。
5. 在室温下以1500×克 离心3分钟。
6. 将沉淀重新悬浮在PBS中，并通过70微米过滤器过滤。
7. 通过荧光激活细胞分选（FACS）使用流入细胞分选机富集CD51⁺细胞。
8. 将富集细胞种入由DMEM/F12组成的SLC培养基中，补充：1 nM地塞米松、1 ng/mL LIF、5 μg/L 胰岛素-转移蛋白-硒酸钠、5% 鸡胚提取物、0.1 mM β巶哳乙醇、1% 非必需氨基酸、1% N2、2% B27、20 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子和肿瘤抑素 M。
9. 在标准条件下（37°C，5% CO₂）培养SLCs，直到达到适合播种到水凝胶上的所需密度。

2. 组装凝胶铸造玻璃容器

1. 仔细检查和清洁用于铸造聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶的专用玻璃板和垫片，确保其无灰尘、无损和残留物。
2. 按照制造商说明正确组装玻璃板、垫片和夹具，确保组件密封良好，防止凝胶铸造时泄漏。
3. 将组装好的玻璃容器稳妥放置在实验室支架上，准备铸造。
   注：铸造装置使用标准的Western印迹（十二基硫酸钠[SDS]-PAGE）玻璃板，固定垫片厚度为1.0毫米，确保凝胶厚度可重复且细胞培养时表面平整。

3. 制备PAGE凝胶混合物溶液

1. 根据实验设计（见 表1）精确测量以下试剂，放入15 mL或50 mL无菌离心管中：40%腈纶原料溶液，2% 双丙烯酰胺原料溶液，1M HEPES缓冲液（pH 8.5），无菌 ddH₂O。
   注意：丙烯酰胺和双丙烯酰胺是神经毒素。称重干粉时务必戴手套和防尘口罩，以避免皮肤接触和吸入空气中颗粒。手术应在排气柜内进行。

4. 添加启动剂和催化剂，并铸造凝胶

1. 依次向混合溶液中添加以下成分：10%过硫酸铵（APS）：作为聚合反应的启动剂。N，N，N'，N'-四甲基二胺（TEMED）：作为催化剂加速聚合反应。 对于总凝胶体积为6 mL，添加60微升10% APS和6微升TEMED（详见 表1 的缩量）。
   注意：加入TEMED后，聚合反应立即开始;因此，后续步骤必须迅速执行。

5. 倒入混合溶液

1. 立即用移液器或液体均匀倒入玻璃容器的一侧，以避免产生气泡。

6. 让凝胶聚合

1. 让铸造凝胶容器在室温下静置不动。
   注意：聚合通常在室温（20–25°C）下需15–30分钟。
2. 当未聚合凝胶混合物与聚合凝胶之间出现清晰界面且凝胶完全固态（容器倾斜时凝胶不流动）后，进入下一步。
3. 铸造后立即在凝胶混合物上覆盖一层薄薄的绝对乙醇（或含水乙醇），以排除大气中的氧气，从而抑制自由基聚合。乙醇还帮助形成平坦的表面。
4. 聚合后，在拆解板材前去除乙醇。

7. 拆解容器并采集凝胶

1. 小心拆开夹具，用塑料楔或刮刀轻轻撬开玻璃板，使聚合的PAGE凝胶保持完整。
2. 准备一个含有大量无菌PBS的培养皿。
3. 用刮刀或戴手套的手小心地将凝胶从玻璃板上剥离，让它顺滑地滑入PBS中。
4. 将含有凝胶的天体密封于PBS中，并在4°C下培养一夜。
   注意：这一步至关重要。新制备的凝胶脱水，必须完全吸收水分并膨胀至最终尺寸。如果跳过这一步骤直接切割凝胶，它会在后续培养基中继续膨胀，可能超过培养基的面积，导致其无法使用。肿胀后的凝胶厚度为1毫米。这很关键，因为当凝胶厚度低于100微米时，细胞可能会感知到下方刚性培养板的刚性，这会干扰预定的机械生物学测量。

8. 切割并将凝胶转移到培养板上

1. 第二天，从4°C取出凝胶。 使用无菌活检冲头或刀片切割器（直径与培养板大小相匹配，例如6孔板），在无菌条件下切割凝胶。
2. 在生物安全柜内，使用无菌镊子轻轻取切开的凝胶盘，放置在空的无菌培养井中央。

9. 初始洗涤与紫外线照射

1. 向含有凝胶的井中添加足够的无菌PBS，确保其完全浸没。
2. 轻轻摇晃培养板，洗净凝胶表面。
3. 用移液器抽吸PBS。
4. 重复这个洗涤过程，总共洗两次，每次3分钟。
5. 洗净后，加入足够的无菌PBS覆盖凝胶。将整个培养板盖微微敞开，置于紫外线灯下（置于生物安全柜或专用紫外线交联剂内），进行基础灭菌1小时照射。

10. 活化磺-SANPAH交联剂

1. 在生物安全柜内，小心地从井中抽取PBS。
2. 在抽取前，用移液器尖端轻轻将凝胶与井壁和底部分离，以避免因液体表面张力而损坏凝胶。
3. 用无菌产钳将凝胶转移到同一培养板的另一个干净孔中。
   注意：转移凝体时，先向干净的井中加入少量PBS，有助于排出井底与凝胶之间被困的气泡，同时也作为额外的洗涤。
4. 制备交联剂工作液：用无菌水或推荐的缓冲液（如PBS）稀释库存溶液（见 表1），新鲜制备0.2 mg/mL的磺酸-SANPAH工作液。
   注意：保护溶液免受光照。
5. 添加足够的Sulfo-SANPAH工作液覆盖凝胶（例如，12孔板250微升，6孔板500微升），确保胶体完全覆盖。
6. 将板放在365 nm波长/120 mJ/^cm的2 UV光下照射1小时。
   注意：这一步激活了磺-SANPAH，使其能够与凝胶表面的官能团结合。

11. 交联剂激活与最终洗涤

1. 照射后，从生物安全柜内的井中抽取磺-SANPAH溶液。
2. 向井中加入足够的无菌PBS，轻轻摇滚以清洗凝胶表面，然后吸入PBS。
3. 重复此洗涤过程，共洗两次，每次3分钟，彻底去除未反应的磺-SANPAH。

12. 制备鼠尾I型胶原蛋白工作溶液

1. 使用0.02 M醋酸溶液作为溶剂稀释大鼠尾巴I型胶原蛋白液。
2. 将最终工作溶液浓度调整为60–100 μg/mL。例如，如果胶原蛋白库存浓度为4 mg/mL，则将15–25微升高汤加入985–975微升的0.02 M醋酸中，得到1毫升工作溶液。

13. 胶原蛋白涂层与培养

1. 根据板型，向每个含有活化凝胶的孔加入适当体积的胶原蛋白工作液：6孔板加2毫升，12孔板加1毫升。
2. 轻轻旋转培养板，确保胶原溶液均匀覆盖凝胶和孔底。
3. 盖好平板，在37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育一夜，使胶原蛋白通过Sulfo-SANPAH交联固定在凝胶表面。

14. 二次紫外线照射与固定

1. 第二天，取下板材，再次在约120 mJ/cm的² 倍紫外线照射1小时。

15. 去除未结合的胶原蛋白和种子细胞

1. 在生物安全柜内，小心地从井中抽取鼠尾部I型胶原蛋白工作液。
2. 向孔中添加无菌PBS，轻轻摇滚以清洗凝胶表面，并吸入PBS。
3. 重复洗涤一次，总共洗两次，每次3分钟。
4. 洗涤后，凝胶基质就准备好了。将准备好的莱迪希干细胞重新悬浮到完整的SLC培养基中（步骤1中详细的组成）。
5. 将细胞悬浮液直接撒在凝胶表面。推荐的播种密度为每^平方厘米2×10个⁴细胞（例如标准6孔板每孔约2×10个⁵细胞）。
6. 将培养板在37°C的加湿5%二氧化碳培养箱中孵育。
7. 为保持最佳细胞存活率和类固醇生成功能，需每48小时更换培养基。

结果

该方案成功执行后，可获得具有明确刚度（范围为1至100 kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶，牢固附着于培养板，支持强健的SLC粘附和扩散。 图1 提供了整个工作流程的示意性概述，从凝胶铸造到细胞播种，使用户能够直观地了解协议的关键阶段。

对聚丙烯酰胺水凝胶（目标刚度：1、5、15、30、50和100 kPa）的机械验证采用振荡流变法（平行板几何，37°C）进行。测量到的杨氏模量为1.1 ± 0.2 kPa，5.1 ± 0.6 kPa，15.2 ± 2.1 kPa，29 ± 3 kPa，51.7 ± 3.7 kPa，以及96 ± 6 kPa，证实所述的公式涵盖了预期的生理和病理刚度范围。在PBS中4°C的夜间膨胀后，凝胶达到平衡尺寸，并可使用定制模具切割成均匀的盘片，模具设计与标准培养板孔匹配（见图2）。转移到培养板后，胶原蛋白涂层和细胞播种的质量通过形态学进行评估。如

讨论

细胞外基质的机械性质在调控干细胞行为中起着基础作用，但系统性研究这些效应的工具仍然有限。我们之前的研究表明，病理基质在衰老过程中硬化会破坏莱迪希细胞（SLC）通过压电1/ROS/Gli1轴的稳态，导致睾酮下降¹⁰。基于这一发现，我们开发了聚丙烯酰胺水凝胶协议，提供了一个标准化且可重复的平台，用于研究基底刚度如何直接调节SLC功能。能够在生理到病理刚度范围内（1–100 kPa）制备水凝胶，使研究人员能够在体外重现年轻和老年睾丸的机械微环境。

聚丙烯酰胺水凝胶的处理非常简单。此外，该方案还需要使用专用设备，如紫外交联剂，以及刚度验证所需的流变显微镜或原子力显微镜，这些设备可能并非所有实验室都具备。该模型允许在凝胶制备（过夜）、表面活化（1小时）和胶原蛋白涂层（过夜）后进行实验性使用;细胞播种的具体时间可根据用户的实验室时间安排和实验需求进行调整。由于这些水凝胶与传统下游检测的兼容性，包括免疫荧光染色、西部印迹分析、基因表达研究中的RNA提取以及激素分泌测量（如睾酮ELI...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
醋酸	西格玛-奥尔德里奇	猫#A6283	鼠尾胶原稀释剂（0.02 M）
丙胺	桑贡生物技术	猫#A100341-0500	聚丙烯酰胺凝胶制备的单体
过硫酸铵（APS）	桑贡生物技术	猫#A100486-0100	凝胶聚合的启动剂
B27补充剂	Invitrogen	猫#A1486701	定义了富含抗氧化剂和激素的补充剂;支持神经元和干细胞存活率（2% V/V）
基础成纤维细胞生长因子（bFGF）	Invitrogen	猫#13256029	有丝分裂生长因子;促进SLC增殖和干性（20 ng/mL）
双丙烯酰胺	上海元业生物技术	猫#S14002	聚丙烯酰胺凝胶用的交联剂
鸡胚提取物	美国生物制剂	猫#C3999	丰富的生长因子和养分来源;支持盐湖城市的增长和生存能力（5% v/v）
来自鼠尾的胶原蛋白，I型	YEASEN	猫#40125ES50	涂覆磺唑-SANPAH激活的聚丙烯酰胺水凝胶表面，促进SLC粘附和培养。
胶原酶IV型	吉布科	编号#17104-019	DMEM/F12中1 mg/mL用于睾丸组织消化
CYP11A1抗体	基因泰克斯	猫#GTX56293	用于西部印迹
地塞米松	西格玛-奥尔德里奇	编号#D1756	糖皮质激素受体激动剂;支持SLC增殖和干性维持（1 nM）
DMEM/F12 中等	吉布科	猫#11320033	消化、洗涤和SLC培养基质
表皮生长因子（EGF）	PeproTech	猫#AF-100-15	刺激SLC增殖并维持未分化状态（20 ng/mL）
胎牛血清（FBS）	维斯泰克	猫#SE100-011	用10%来抑制胶原酶活性
斐济	无	https://imagej.net/Fiji	图像分析软件
GADPH抗体	蛋白质技术	猫#60004-1-Ig	用于西部印迹
凝胶消化酶	精准生物技术	猫#GXDLFA	用于睾丸组织消化和SLC分离的酶混合物
HEPES	西提瓦	猫#SH30237.01	缓冲液以维持pH 7.0–7.4
HSD3&β;抗体	圣克鲁斯	猫#sc-515120	用于西部印迹
流入细胞分选机	BD	https://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf
胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠（ITS）	西格玛-奥尔德里奇	猫#11074547001	促进细胞存活、葡萄糖摄取和抗氧化防御（5 & mu;g/L）
敲除血清替代疗法（KSR）	吉布科	猫#10828-028	SLC培养基的血清替代品
LIF（白血病抑制因子）	米利波尔	猫#LIF1010	维持干细胞多能性和自我更新的细胞因子（1 ng/mL）
老鼠睾丸	这篇论文	无	从C57BL/6小鼠中分离出来
小鼠睾酮ELISA套件	芬恩生物科技	猫#40203ES80	用于培养上清液中睾酮的定量
鼠标：C57BL/6	深圳TopBiotech	无	用于睾丸采集的鼠株
小鼠：睾丸干莱迪希细胞（SLCs）及nbsp;	这篇论文	无	从小鼠睾丸中分离出的原发细胞
N2补充剂	Invitrogen	猫#17502001	定义的无血清补充剂支持神经和干细胞培养（1% v/v）
非必需氨基酸	海克隆	猫#SH30050.03	为蛋白质合成和细胞代谢提供氮源（1% v/v）
产酸素M（OSM）	PeproTech	猫#300-10T	参与SLC分化调控和莱迪希细胞成熟的细胞因子（20 ng/mL）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）	吉布科	猫#10010023	洗涤与悬浮缓冲器
血小板衍生生长因子（PDGF）	PeproTech	猫#100-14B	支持细胞增殖、迁移和存活（20 ng/mL）
棱镜9.0	GraphPad	https://www.graphpad.com/	用于统计分析和绘图的软件
StAR抗体	蛋白质技术	猫#67130-1-Ig	用于西部印迹
磺-SANPAH及nbsp;	麦克林	猫号#102568-43-4	用于凝胶表面活化的杂核功能交联剂
TEMED	菲金	猫#PH0341	聚合催化剂
&β;-巰基乙醇	Invitrogen	猫#21985023	减少氧化应激，支持细胞在培养中生长（0.1 mM）