本方案描述了制备具有可调刚度的聚丙烯酰胺水凝胶的方法，用于在可控的二维培养系统中研究基质力学对干细胞样 Leydig 细胞行为的影响。
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本方案描述了制备具有可调刚度的聚丙烯酰胺水凝胶的方法，用于在可控的二维培养系统中研究基质力学对干细胞样 Leydig 细胞行为的影响。
细胞外基质（ECM）硬度对干细胞行为具有关键调控作用。此前，我们已证明衰老过程中基质硬度的病理性增加会破坏干细胞样利迪细胞（SLC）的稳态，导致睾酮水平下降。基于这一发现，本文详细介绍了一种由本实验室原创开发的实验方案，用于制备硬度可调的聚丙烯酰胺（PA）水凝胶，以模拟睾丸微环境。 体外该方法能够实现1–100 kPa硬度范围内水凝胶的可重复制备，覆盖从生理到病理条件的硬度范围。关键步骤包括丙烯酰胺/双丙烯酰胺的精确配比、凝胶溶胀平衡、使用Sulfo-SANPAH进行表面活化以及胶原蛋白包被，以支持SLC的黏附与培养。我们提供了针对目标硬度的优化配方，并针对聚合不完全和细胞贴壁不良等常见问题给出了相应的解决方案。 该系统可在定义明确的二维条件下，系统性地研究基质刚度对支持细胞增殖、分化及类固醇生成功能的调控作用。除生殖生物学领域外，该系统还可作为研究其他细胞类型中力学生物学效应的有力平台，并可用于筛选靶向刚度相关功能障碍的治疗药物。
细胞外基质（ECM）的力学特性在调控干细胞命运（包括增殖、分化和功能维持）中发挥关键作用1,2,3,4在睾丸中，与年龄相关的细胞外基质（ECM）硬化已被认为与睾酮生成能力下降有关。然而，其潜在的力学生物学机制仍不清楚，部分原因在于缺乏标准化方法 体外 能够真实再现睾丸微环境生理硬度范围的模型。 年轻小鼠睾丸组织的生理硬度约为1–15 kPa，而衰老或纤维化组织的硬度可达到20–30 kPa甚至更高。
聚丙烯酰胺（PA）凝胶因其刚度可通过调节丙烯酰胺与双丙烯酰胺的比例进行精确调控，已成为研究细胞-基质相互作用的多功能平台5,6。与其他基底（如胶原包被的玻璃或商用水凝胶）相比，PA凝胶能够独立控制刚度和生化配体密度，从而系统性地解析机械信号的作用。尽管已有多种PA凝胶制备方案7,8,9，但这....
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所有动物实验程序均经中山大学实验动物伦理与使用委员会批准（批准号：SYSU-IACUC-2026-B1278），并依照机构指南进行。
1. 小鼠原代 SLC 的分离与培养
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成功执行本方案可获得具有特定刚度（范围为 1 至 100 kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶，该凝胶牢固附着于培养板上，并能有效支持 SLC 的黏附与铺展。图 1 概括展示了从凝胶浇铸到细胞接种的完整操作流程，帮助用户直观理解本方案的关键步骤。
使用振荡流变仪（平行板几何结构，37 °C）对聚丙烯酰胺水凝胶（目标刚度：1、5、15、30、50 和 100 kPa）进行力学性能验证。测得的杨氏模量分别为 1.1 ± 0.2 kPa、5.1 ± 0.6 kPa、15.2 ± 2.1 kPa、29 ± 3 kPa、51.7 ± 3.7 kPa 和 96 ± 6 kPa，证实所描述的配方覆盖了预期的生理和病理刚度范围。在 4 °C 的 PBS 中溶胀过夜后，凝胶达到平衡尺寸，可使用定制模具切割成与标准培养板孔匹配的均匀圆片（图2）。转移至培养板后，通过细胞形态评估胶原包被质量和细胞接种效果。如图3所示，成功接种的 SLC.......
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细胞外基质的力学特性在调控干细胞行为中起着根本性作用，然而用于系统研究生殖细胞中这些效应的工具仍然有限。我们之前的研究表明，衰老过程中病理性基质硬化通过Piezo1/ROS/Gli1轴破坏干细胞样Leydig细胞（SLC）的稳态，导致睾酮水平下降10。基于这一发现，我们开发了该聚丙烯酰胺水凝胶实验方案，以提供一个标准化且可重复的平台，用于研究基底刚度如何直接调控SLC功能。该方法能够制备出覆盖生理至病理刚度范围（1–100 kPa）的水凝胶，使研究人员可在体外重现年轻和衰老睾丸的力学微环境。
聚丙烯酰胺水凝胶的操作简便。此外，该实验方案需要使用一些特殊设备，例如紫外交联仪，以及用于刚度验证的流变仪或原子力显微镜，而这些设备并非所有实验室都具备。该模型在水凝胶制备（过夜）、表面活化（1小时）和胶原蛋白包被（过夜）后即可用于实验；细胞接种的具体时间可根据实验室的工作安排和实验需求进行调整。由于这些水凝胶与多种常规下游检测方法兼容，其应用领域可十分广泛，包括免疫荧光染色、Western印迹分析、基因表达研究所需的RNA提取以及激素分泌水平测.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
本项目获得中国国家重点研发计划干细胞与转化医学专项（2021YFA1100601）、国家自然科学基金（82371608）、广东省基础与应用基础研究基金（2023B1515020016）以及深圳市基础研究计划（JCYJ20240813150417024，JCYJ20240813150422030）的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | Cat#A6283 | 大鼠尾胶原的稀释液（0.02 M） |
| 丙烯酰胺 | 生工生物 | Cat#A100341-0500 | 聚丙烯酰胺凝胶制备用单体 |
| 过硫酸铵（APS） | 生工生物 | Cat#A100486-0100 | 凝胶聚合引发剂 |
| B27添加剂 | Invitrogen | Cat#A1486701 | 成分明确的补充剂，富含抗氧化剂和激素；支持神经元和干细胞存活（2% v/v） |
| 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | Invitrogen | Cat#13256029 | 促有丝分裂生长因子；促进干细胞样细胞（SLC）增殖和干性维持（20 ng/mL） |
| 双丙烯酰胺 | 上海源叶生物科技 | Cat#S14002 | 聚丙烯酰胺凝胶交联剂 |
| 鸡胚提取物 | US Biologicals | Cat#C3999 | 富含生长因子和营养物质；支持干细胞样细胞（SLC）生长和活力（5% v/v） |
| Ⅰ型胶原蛋白（来自大鼠尾） | YEASEN | Cat#40125ES50 | 包被经磺基-SANPAH活化的聚丙烯酰胺水凝胶表面，以促进干细胞样细胞（SLC）黏附和培养 |
| IV型胶原酶 | Gibco | Cat#17104-019 | 在DMEM/F12中配制成1 mg/mL用于睾丸组织消化 |
| CYP11A1抗体 | GeneTex | Cat#GTX56293 | 用于蛋白质印迹（western blotting） |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | Cat#D1756 | 糖皮质激素受体激动剂；支持干细胞样细胞（SLC）增殖和干性维持（1 nM） |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | Cat#11320033 | 用于组织消化、洗涤及干细胞样细胞（SLC）培养的基础培养基 |
| 表皮生长因子（EGF） | PeproTech | Cat#AF-100-15 | 刺激干细胞样细胞（SLC）增殖并维持未分化状态（20 ng/mL） |
| 胎牛血清（FBS） | VISTECH | Cat#SE100-011 | 使用浓度为10%，用于终止胶原酶活性 |
| Fiji | N/A | https://imagej.net/Fiji | 图像分析软件 |
| GADPH抗体 | Proteintech | Cat#60004-1-Ig | 用于蛋白质印迹（western blotting） |
| 凝胶消化酶 | 精准生物 | Cat#GXDLFA | 用于睾丸组织消化和干细胞样细胞（SLC）分离的酶混合物 |
| HEPES | Cytiva | Cat#SH30237.01 | 缓冲液，用于维持pH值在7.0–7.4 |
| HSD3β抗体 | Santa Cruz | Cat#sc-515120 | 用于蛋白质印迹（western blotting） |
| Influx细胞分选仪 | BD | https://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf | |
| 胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠（ITS） | Sigma-Aldrich | Cat#11074547001 | 促进细胞存活、葡萄糖摄取和抗氧化防御（5 μg/L） |
| KnockOut血清替代物（KSR） | Gibco | Cat#10828-028 | 干细胞样细胞（SLC）培养基中的血清替代品 |
| LIF（白血病抑制因子） | Millipore | Cat#LIF1010 | 维持干细胞多能性和自我更新的细胞因子（1 ng/mL） |
| 小鼠睾丸 | 本文 | N/A | 从小鼠C57BL/6中分离获得 |
| 小鼠睾酮ELISA试剂盒 | 菲恩生物 | Cat#40203ES80 | 用于定量培养上清液中的睾酮含量 |
| 小鼠：C57BL/6 | 深圳菲鹏生物 | N/A | 用于睾丸采集的小鼠品系 |
| 小鼠：睾丸干细胞样间质细胞（SLCs） | 本文 | N/A | 从小鼠睾丸中分离的原代细胞 |
| N2添加剂 | Invitrogen | Cat#17502001 | 成分明确的无血清添加剂，支持神经细胞和干细胞培养（1% v/v） |
| 非必需氨基酸 | HyClone | Cat#SH30050.03 | 为蛋白质合成和细胞代谢提供氮源（1% v/v） |
| 抑瘤素M（OSM） | PeproTech | Cat#300-10T | 参与干细胞样细胞（SLC）分化调控和间质细胞成熟的细胞因子（20 ng/mL） |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Gibco | Cat#10010023 | 洗涤和重悬缓冲液 |
| 血小板源性生长因子（PDGF） | PeproTech | Cat#100-14B | 支持细胞增殖、迁移和存活（20 ng/mL） |
| Prism 9.0 | GraphPad | https://www.graphpad.com/ | 用于统计分析和绘图的软件 |
| StAR抗体 | Proteintech | Cat#67130-1-Ig | 用于蛋白质印迹（western blotting） |
| Sulfo-SANPAH | MACKLIN | Cat#102568-43-4 | 用于凝胶表面活化的异双功能交联剂 |
| TEMED | Phygene | Cat#PH0341 | 聚合催化剂 |
| β-巯基乙醇 | Invitrogen | Cat#21985023 | 减轻氧化应激，支持细胞在培养中的生长（0.1 mM） |
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