全血流式细胞术定量检测组织因子阳性血小板：一项标准化的多中心实验流程

摘要

本文介绍了一种用于多中心研究中组织因子阳性血小板流式细胞术定量的标准化工作流程。该方案描述了血液采集、全血固定、染色及仪器标准化的统一操作步骤，可根据实验室条件选择在本地或中心实验室进行分析。

摘要

组织因子（TF）^pos-血小板代表血小板群体中的一个亚群。近期研究表明，该亚群可用于预测冠状动脉疾病患者的心血管死亡风险，因而被确立为一种可用于血栓风险分层的生物标志物。通过流式细胞术对TF^pos-血小板进行准确定量，需要对分析前处理、染色程序及仪器设置进行严格标准化，尤其是在多中心研究中，技术差异可能影响其测量结果。本方案描述了一种用于全血流式细胞术检测循环TF^pos-血小板的协调化工作流程，旨在确保在不同技术条件的实验室之间实现可重复的结果。该流程包括标准化的血液采集和全血固定步骤，以维持血小板的体内 表型。根据各实验室的本地能力，提供了两种不同的样本制备方法：对于无流式细胞仪设备的中心，可将固定后的样本运送至核心实验室进行集中染色、采集和分析；对于配备流式细胞仪设备及经过培训人员的中心，则可在本地完成染色与数据采集。通过使用抗TF Star Fluor 488抗体直接标记目标蛋白，以及抗CD41 PerCP-Cy5.5抗体识别血小板群体标志物，实现对TF^pos-血小板百分比的测定。流式细胞仪的标准化可通过相同型号仪器共享采集模板，或通过基于微球的校准方法在不同平台间实现。该工作流程进一步纳入了标准化的设门策略和集中化数据分析，以支持不同研究地点间TF^pos-血小板测量结果的可靠比较。代表性结果表明，该流程可在经验证的多中心采集条件下支持TF^pos-血小板的可重复定量。本方案可能促进TF^pos-血小板检测在血栓风险分层中的更广泛应用，并推动血小板流式细胞术在转化医学与临床研究中的进一步标准化。

引言

组织因子（Tissue Factor, TF）是血液凝固级联反应的主要启动因子，也是凝血酶生成的关键决定因素。除了由内皮下细胞和白细胞的经典表达外，TF 还与循环血小板相关^1,2,3,4,5。在血小板生成过程中，巨核细胞将 TF 转移至一部分血小板⁶。在生理条件下，约 20–30% 的循环血小板含有储存在开放小管系统内的 TF，并在空间上与血浆因子 VII 隔离⁷。在这种区室化状态下，TF 在功能上与循环凝血因子隔离，保持非活性状态。因此，当通过流式细胞术分析健康个体的全血时，仅有少量血小板显示出可检测的表面 TF，反映了生理性的稳态平衡^2,8。在以血小板活化和血栓性炎症失衡为特征的病理状态下，这种平衡可能被打破，导致 TF 表面暴露增加。在多种血栓性疾病中已报道 TF 阳性（TF^pos）血小板比例升高^{9,10,11,12,13,14,15}。值得注意的是，在冠状动脉疾病中，TF^pos 血小板水平超过 4% 可独立预测 5 年随访期间的心血管死亡率，确立了 TF^pos 血小板百分比作为血栓风险的临床相关生物标志物¹⁶。

因此，对TF^pos-血小板进行准确且可重复的定量，对于转化研究和临床研究应用均至关重要。既往已发表的一种用于评估TF^pos-血小板的血小板流式细胞术实验流程，在单中心环境下推动了对该蛋白的研究¹⁷，并就优化特定的分析前或分析步骤提供了建议。然而，该方法并未专门针对多中心研究中的额外后勤与分析挑战进行设计，包括样本运输流程、标准化样本处理，以及在不同流式细胞仪平台之间协调样本采集的需求。此外，还需考虑各参与中心在基础设施和技术操作水平方面的差异。

在此背景下，本方案的附加价值在于提供了一个详细的工作流程，该流程结合了标准化的血液采集和全血固定、灵活的样本处理方案、跨平台检测数据的协调统一，以及通过数据分析实现直接染色和集中式质量控制。

因此，本研究的目的是为在全血中通过流式细胞术进行TF^pos-血小板分析的多中心标准化实施提供一个可操作的框架。该整合式设计可减少分析前、分析过程中以及不同仪器间的变异，从而为多中心环境下TF^pos-血小板的一致性评估奠定基础。

方案

所有献血者均提供了经机构伦理委员会批准的书面知情同意书（编号70/24，CE 18.06.24）。

多中心全血流式细胞术定量检测TF^pos-血小板的工作流程见图1。以下详述的方案将指导用户完成五个主要步骤。

图1：TF^pos-血小板分析的多中心工作流程。通过全血流式细胞术对循环中TF^pos-血小板进行多中心评估的分析流程示意图。在受试者入组并采集血液后，各临床单位根据其可用的技术资源对样本进行固定和处理。无流式细胞仪设备的中心将固定后的样本运送至核心实验室，由其完成染色、数据采集和分析。配备流式细胞仪的中心则可使用标准化的数据采集模板在本地完成染色与数据采集。仪器间的标准化通过以下方式实现：共享模板（相同型号仪器）、由核心实验室生成的模板（适用于可对齐的不同型号仪器），或在无法直接进行模板标准化时使用荧光微球进行校准。数据分析采用标准化的设门流程集中进行。本示意图由ChatGPT（OpenAI）生成。 请点击此处查看此图的放大版本。

1. 血液采集

注意：TF^pos-血小板检测最多需要 50 µL 全血。

1. 使用19号蝶形针从肘前静脉采集外周静脉血。仅在穿刺时使用止血带，针头置入后立即松开止血带，以尽量减少 离体 血小板活化
2. 弃去第一支EDTA管。随后将血液收集至含有0.129 M枸橼酸钠的真空采血管中，充至制造商刻度线，以维持正确的血液与抗凝剂比例。
3. 轻轻颠倒混匀5次，以充分混合血液与抗凝剂。
4. 将试管保持直立，置于室温环境中，避免振荡、冷藏或气动运输。
5. 样本采集后须在3小时内处理。

2. 样品制备

注意：所有抗体必须由核心实验室统一采购，并且必须来自同一批次。如果在研究进行过程中必须更换批次，则应通过在相同检测条件下对新旧试剂批次进行平行测试，将新批次与正在使用的批次进行桥接验证，只有在确认性能相当后方可采用。各参与中心可自行采购常用试剂（例如 PBS — 磷酸盐缓冲液 — 和 PFA — 多聚甲醛）；但产品编号必须与核心实验室所用的保持一致，并且在整个研究过程中必须保持批次的一致性。

1. 固定样品。
   注意：在开始血液处理前，需在室温下用 PBS 将 4% PFA 稀释，配制 1% PFA。
   警告： PFA 具有毒性，操作时应佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具），并在通风橱中进行。避免吸入以及与皮肤或眼睛接触。 废液处理：所有含 PFA 的溶液、固定后的样品及受污染的耗材，应根据机构和当地的法规要求，收集至正确标识、密闭的危险废物容器中。
   1. 轻轻倒置真空采血管5次，以混匀血液与抗凝剂。
   2. 将50 µL血液转移至含有950 µL 1% PFA的2 mL离心管中。
   3. 轻轻混匀样品，在室温下孵育1小时30分钟。
   4. 加入 500 µL PBS。
   5. 以 1500 x g 离心 g 室温下孵育5分钟。
   6. 移除上清液，并将沉淀重悬于1 mL PBS中。
      注意：技术检查点： 离心后，在移除上清液前确认沉淀可见。小心移除上清液，避免扰动沉淀。重悬后，确认样品均匀，无可见的团块或聚集体。
   7. 将固定后的样本在固定后24小时内，使用维持在2-8 °C的温控包装运送至核心实验室。切勿冷冻。记录采集时间、固定时间及送检时间。
2. 流式细胞术分析的样本标记
   注意：抗-TF Star Fluor 488（克隆号 HTF1；抗-CD142）靶向组织因子（Tissue Factor），而抗-CD41 PerCP-Cy5.5 识别血小板整合素 αIIb。在开始染色程序之前，将抗体在 17000 × g 条件下离心 g 在 +4 °C 下离心 5 分钟以去除任何聚集体¹⁸用 PBS 稀释抗 TF Star Fluor 488 抗体（1:100）。抗 CD41 PerCP-Cy5.5 不需要中间稀释，应直接使用制造商推荐的体积。
   1. 准备四个 2 mL 聚丙烯管。
   2. 每管加入 80 µL 固定后的样品。
   3. 向每根试管中加入适量体积的 PBS 和抗 TF Star Fluor 488 抗体，具体体积见下表所示 表1 （第1天）
   4. 轻轻混匀样品。
   5. 4 °C 避光过夜孵育。
   6. 第二天（第2天），按指示向3号和4号管中加入抗CD41 PerCP-Cy5.5 表1. 
   7. 轻柔地混匀样品。
   8. 室温避光孵育15分钟。
   9. 用 300 µL PBS 稀释每根试管。
   10. 将染色样本避光保存，直至进行流式细胞术检测。
       注意：样本可在 4 °C 下保存最多三天¹⁷长期储存会导致信号逐渐衰减，应避免。

		第1天		第2天
编号	管编号	1× PBS (µL)	Anti-TF Star Fluor 488 (µL)	Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 (µL)
1	未染色	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

表1：TF^pos-血小板评估的染色方案。

3. 流式细胞仪检测的标准化

1. 核心实验室设置采集模板
   1. 流式细胞仪 A 的模板设置
      1. 打开软件 A v2.6
      2. 创建 FSC-A/SSC-A 散点图所有活动] 以对数尺度显示细胞群体图2A).
      3. 创建 CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A 散点图所有活动] 在对数尺度下以识别血小板 within a [血小板门控（gate）图2B).
      4. 创建PerCP-Cy5.5-A/Star Fluor 488-A伪彩图所有活动] 以检查溢出/补偿情况（图2C).
      5. 创建一个FSC-A/FSC-H点图血小板]门并定义一个区域以识别单细胞[单细胞]; 图 2D).
      6. 创建 CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF Star Fluor 488-A 散点图于 [单细胞] 门控以鉴定转录因子^阳性-血小板（图2E).
      7. 将SSC-H的阈值设为1000。
      8. 将流速设置为“慢”。
      9. 将B525增益设置为315，以确保阳性与阴性事件之间的最佳分辨效果；可根据所用仪器情况酌情调整。
      10. 根据每日质控设置B690增益。只有当CD41^阳性- 血小板群体与阴性背景完全分离，并保持在采集过程中模板中预设的参考门控范围内。
      11. 使用“导出实验模板”功能导出模板。
      12. 下载： TF 的采集模板^阳性- 可下载流式细胞仪A的血小板分析方案 补充文件 1 和 补充图1.
          注意：用于检测溢出/补偿的图（图2C），尽管本多参数分析中并非必需，但仍包含在内。然而，应考虑是否将使用不同于本方案中建议的荧光染料组合。
   2. 创建流式细胞仪 B 的模板。
      1. 创建一个协议文件，其中包含3.1.1节所述的整个采集设置。
      2. 使用软件B v1.6中的“导出方案”功能导出模板，生成一个方案文件。
      3. 在接收仪器上，使用软件中的“导入方案”功能导入方案文件。
   3. 流式细胞仪C模板创建
      1. 创建一个工作区文件，包含 3.1.1 节所述的完整采集设置，并导出该文件。
      2. 在接收仪器上，使用软件 C v3.1 的“复制”功能导入工作区文件。
2. 使用校准微球进行流式细胞仪的标准化
   注意：使用6峰彩虹校准微球。
   1. 目标值定义。
      注意：使用以下公式定义B525荧光通道中第一个峰的中位荧光强度（MdFI）：
      MdFI_CU = 
      其中，CU：临床单位仪器，RI：参考仪器。
   2. 样品制备
      1. 涡旋混匀珠子小瓶。
      2. 向样品管中加入5滴珠子。
      3. 加入1 mL PBS。
      4. 涡旋5-10秒。
   3. 微珠采集
      1. 创建一个对数刻度的FSC-A/SSC-A散点图，显示[所有活动]，并定义一个称为[珠粒] (图3A).
      2. 创建一个FSC-A/FSC-H点图珠粒]门控并圈定区域以识别单细胞事件单线态] (图3B).
      3. 为 Star Fluor 488 荧光通道（B525）创建直方图。
      4. 仅显示 [单线态] 在直方图上。
      5. 在第一个峰的整个宽度上绘制一个门（即区域 B） 图3C).
      6. 在统计功能区中，显示 X 中位数（X-Med）值。
      7. 移除任何现有的补偿设置。
      8. 将流速设置为“慢”。
      9. 以“运行”模式开始采集。
      10. 在“采集设置”中，调整 B525 电压/增益，以达到根据目标值计算出的 X-Med 目标值。
      11. 记录包含 10,000 个事件的数据文件于 [单线态只有在达到该接受标准后才开启门控。在未达到目标范围之前，不得采集研究样本。

补充文件1：可用于下载的流式细胞仪A上TF^pos-血小板分析的采集模板。 请点击此处下载该文件。

补充图1：在流式细胞仪A上进行TF^pos-血小板分析的采集模板截图。（A）FSC-A 与 SSC-A 点图提供了整体事件分布的可视化图示。（B）在 CD41 与 SSC-A 图中识别血小板，并设门为[血小板]。（C）包含 PerCP-Cy5.5 与 Star Fluor 488 图以评估潜在的荧光溢出。（D）在[血小板]门内使用 FSC-A 与 FSC-H 图排除双联体，定义[单细胞]群体。（E）在[单细胞]门内根据 PerCP-Cy5.5 和 Star Fluor 488 的荧光信号识别 TF^pos-血小板。（F-H）模板中所采用的采集设置，包括样本流速（慢速）、主阈值（SSC）以及检测器增益（B525 和 B690），如图所示。采集设置与工作流程的完整细节见第3.1节。请点击此处下载该文件。

图 2：识别 TF^pos-血小板的采集模板与设门策略。（A）FSC-A/SSC-A 点图（对数尺度），显示所有检测到的事件。（B）CD41-A/SSC-A 点图，用于识别血小板群体。（C）PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 伪彩色图，用于评估光谱溢出及补偿需求。（D）在[血小板]门内的 FSC-A/FSC-H 图，用于排除双联体并定义单细胞。（E）在[单细胞]门内的 PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488 点图，用于识别 TF^pos-血小板。括号中显示的统计字段在应用模板进行样本采集时，会自动填充样本特异性数值。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：基于微球的仪器校准流程。（A）FSC-A/SSC-A 图用于识别微球事件。（B）在微球事件内的 FSC-A/FSC-H 图，用于排除聚集体并定义单细胞。（C）Star Fluor 488 荧光的直方图，显示微球峰，并对第一个微球峰进行门控以确定中位荧光强度。所展示的统计结果仅作为代表性示例。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 用于TF^pos-血小板分析的流式细胞术样本采集

1. 使用流式细胞术模板进行采集。
   1. 使用采集模板导入 “导入模板” 软件A中的功能
   2. 获取在步骤2中制备的样品。
   3. 在数据记录前，确认血小板门和单细胞门与参考图的几何位置一致。如有需要，调整设门。
   4. 在稳定流动5–10秒后开始记录。在[单细胞] 门控 （参见 图 2D保存未补偿的 .fcs 文件并将其发送至核心实验室。
2. 无流式细胞术模板的数据采集。
   1. 重新创建第3.1节中所述的数据采集工作表，包括所描述的五个图谱及门控层级：所有事件 > 血小板 > 单细胞 > TF/CD41 象限
   2. 将SSC-H的阈值设为1000。
   3. 将流速设置为“慢”。
   4. 根据3.2.3节中定义的参数设置B525电压/增益。
   5. 获取步骤2中制备的样本。在稳定流动5–10秒后开始记录；在[单细胞] 门控。保存未补偿的 .fcs 文件，并将其发送至核心实验室。
      注意：只有每日质量控制仪器通过后，采集才可接受。如果目标为20,000个CD41^位置– 血小板无法达到时，至少获取 10,000 个 CD41 阳性细胞^阳性-血小板事件

5. 数据分析

注意：以下所述的分析工作流程旨在支持负责集中数据处理和质量控制的核心实验室的各项工作。

1. 新建一个分析工作表并加载 .fcs 文件。
2. 针对每个样本，创建如图2所示的分析模板。对于非相同平台，应使用具有相同门控结构和统计输出的等效平台特异性模板。
3. 根据预定义的散射特性及单细胞鉴别策略，验证门控是否正确识别血小板群体（图4A、B、D）。
4. 通过伪彩色图 [所有事件] 检查溢出/补偿情况（图4C）。
   注：Star Fluor 488 荧光染料的发射光谱峰值为 520 nm，而 PerCP-Cy5.5 的发射光谱峰值为 676 nm，因此两者无光谱重叠，无需进行补偿。
5. 在 Star Fluor 488 点图中应用以下门控顺序（图5）：
   1. 未染色样本：使用未染色对照样本定义象限，使背景 TF^pos 事件在血小板事件中的比例保持在 0.01% 或以下，从而排除血小板自发荧光（图5A）。
   2. TF 单染样本：将未染色样本中定义的象限坐标应用于单染样本，以识别 TF^pos 信号（图5B）。
   3. CD41 单染样本：使用 CD41 单染样本定义象限，以排除血小板的背景荧光（图5C）。
   4. TF/CD41 双染样本：应用相同的象限坐标，在 TF/CD41 染色样本中识别 TF^pos 信号（图5D）。
      注：最终的 TF^pos 血小板百分比由分析软件生成的统计数据得出，报告为在门控血小板群体中位于 TF^pos 象限内的 CD41^pos 事件所占的百分比。
6. 对文件名标识、试剂批次、固定至采集时间间隔、运输温度、事件计数以及异常荧光分布进行集中质量控制。若文件在本地处理、运输、固定时间或采集参数方面存在已记录的偏差，应予以标记，并进行集中审查，根据研究特定的偏差管理计划决定是否排除或重新检测。

图4： TF^pos-血小板分析的逐级设门策略。 典型分析流程展示了加载.fcs文件后血小板群体的鉴定过程。（A-B）点图显示血小板群体设门正确。（C）PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488伪彩色图用于评估光谱溢出。（D）在血小板门控范围内绘制的FSC-A/FSC-H图，用于排除双联体并定义单细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：数据分析模板。 典型的点图显示：（A）未染色对照，用于确定本底自发荧光及象限位置；（B）TF单染样本；（C）CD41单染样本，用于确定象限位置；（D）TF/CD41双染样本，用于TF^pos-血小板分析。数值表示在一个代表性样本中TF^pos-血小板的百分比。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

该工作流程专门设计用于使具有异质性技术基础设施的中心能够参与需要定量检测TF^pos-血小板的多中心研究。图1展示了为支持通过全血流式细胞术测定循环TF^pos-血小板而设计的组织工作流程图。根据参与中心可用的技术资源，采用不同的样本制备流程。具体而言：（i）当临床单位缺乏流式细胞术设备或经过培训的技术人员时，全血样本在采集后立即进行固定，随后运送至核心实验室进行集中染色、上机检测和分析；（ii）而具备流式细胞仪设备的中心则可在本地完成染色和上机检测。在此类情况下，数据采集需遵循由核心实验室定义的统一化工作流程。若所用仪器型号与核心实验室一致，则使用核心实验室提供的标准化模板进行数据采集。当使用不同型号的仪器时，可通过模板转移（当仪器可送至核心实验室进行校准对齐时）或基于微球的校准程序（在样本采集前完成）实现检测流程的统一化。随后，样本可按照标准化工作流程进行采集和分析。

以下代表性结果旨在说明工作流程的可行性及关键的标准化步骤，而非提供正式的多中心检测验证。为确保可靠地检测组织因子（TF），首先评估了染色策略的光谱兼容性和信号稳定性。使用抗CD41 PerCP-Cy5.5抗体鉴定血小板，而TF的检测则依赖于与Star Fluor 488偶联的抗TF单克隆抗体。采用单染对照样本以确认检测通道之间无荧光溢出。如图6A所示，CD41 PerCP-Cy5.5单染样本在Star Fluor 488通道中未产生可检测信号。一致地，在双染样本中测得的TF^pos-血小板百分比与TF单染样本中获得的结果相当（图6B）。

图6：染色特异性的验证。（A）单染抗CD41 PerCP-Cy5.5样本在PerCP-Cy5.5/Star Fluor 488点图中分析，以验证信号特异性。（B）TF^pos-血小板百分比在单独TF染色与TF/CD41双染色样本中的测量结果以成对个体测量值（点）及均值±标准差（n = 18名独立受试者）表示。数据采用Wilcoxon配对符号秩检验进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。本研究所提出检测方法的分析灵敏度在来自n=200名健康受试者的样本中进行了评估。使用生物学空白样本计算得出，空白限（LoB）为0.39%，检出限（LoD）为0.77%，定量限（LoQ）为1.12%，其中定量限定义为与≤20%变异系数（CV）相关联的最低水平。通过6名操作人员使用预定义分析模板对40个独立样本进行分析，评估了设门策略的操作间重复性，所得组内相关系数（ICC）为0.985（95% CI：0.978–0.990）。

全血固定后，通过纵向染色固定样本评估了TF检测的稳定性。与固定当天（D0）染色的基线样本相比，固定后3至4天（D3-D4）TF^pos-血小板水平保持稳定，仅在D3-D4时出现约22%的非显著性下降（TF^pos-血小板相对百分比为77.8 ± 7.2%），与D0水平相比无显著差异。当染色在固定后第5至6天（D5-D6）进行时，TF^pos-血小板的检测值显著下降至53.8% ± 20.7%（TF^pos-血小板相对百分比；p< 0.0001；图7）。这些结果表明，固定样本在固定后4天内可进行可靠分析，且信号仅出现轻微损失。

图7：样本固定后的时程分析。 在固定后不同时间点测得的TF^pos-血小板定量结果如横轴所示：D0 = 采血当天；D1 = 第1天；D2 = 第2天；D3-4 = 第3或第4天；D5-6 = 第5或第6天。数据以相对于D0的均值±标准差（SD）相对百分比表示（n = 7–10名健康受试者，在指定的固定后时间点进行评估）。采用单因素方差分析（Anova），随后进行Dunnett多重比较检验对数据进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。

在不同流式细胞术平台上对标准化采集工作流程的性能进行了后续评估。首先使用FACSLyric和MACSQuant仪器作为参考细胞仪，评估基于模板的标准化效果。位于外部机构的同型号其他仪器则作为测试平台。采用标准化采集模板，在参考仪器和测试仪器上对含有静息血小板的全血样本进行检测。如图8A、B所示，在参考细胞仪与测试细胞仪之间获得了相似的TF^pos-血小板百分比，证实了共享模板方法的可重复性。

图8：使用共享采集模板的跨仪器重复性。在n=6名健康受试者的全血样本中，通过在参考仪器和测试仪器上应用相同的采集模板，分别在FACSLyric（A）或MACSQuant（B）仪器上测定TF^pos-血小板的百分比。数据以单次测定值（圆点）及均值±标准差表示。采用配对t检验对数据进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。

最后，采用基于微球的标准化方法对不同配置的仪器进行校准。以细胞仪A作为参考仪器，FACSymphony作为待测仪器。通过调整FACSymphony的488 nm检测器电压，使6峰Rainbow校准微球的荧光强度落入预设的目标范围内，从而完成校准。图中显示了校准前后微球峰分布的直方图轮廓。 图9A全血样本在校准前后均在测试仪器上采集。在标准化之前，组织因子（TF）^阳性- 血小板百分比在两个平台之间存在差异。经过基于微球的校准后，数值与参考流式细胞仪获得的结果高度一致图9B)，证明了跨平台的一致性以及可重复的转录因子定量。

图9：基于微球的仪器标准化。（A）在仪器校准前（红色峰）和校准后（绿色峰）获取的6峰彩虹校准微球的代表性荧光直方图。（B）在n=6名健康受试者制备的静息样本中，通过测试仪器在标准化前（Pre）和标准化后（Post）检测到的TF^pos-血小板百分比。同时展示了参考仪器的检测结果以供比较。数据采用配对t检验进行分析。请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本方案提供了一套用于全血流式细胞术定量检测组织因子阳性（TF^pos）血小板的逐步操作流程，专为多中心研究实施而设计。与基于血小板流式细胞术分析的传统流程相比，其主要方法学优势在于对整个分析过程进行了标准化，涵盖从血液采集、全血固定、样本标记、上机前仪器校准，到集中化数据分析与数据质量控制的各个环节。该流程使得不具备样本处理能力的研究中心，只要能够提供血液样本，也可参与多中心研究。当前流程重点解决了不同研究中心之间最具影响的实践性变异来源，考虑到在生理条件下仅有少量比例的血小板表面可检测到与膜结合的组织因子^7,8。这些变异来源包括样本本地处理方式的差异、流式细胞仪设备的可及性、仪器配置不同以及操作人员依赖性的数据分析差异。

为克服这些问题，采集全血后需尽快进行固定，以稳定细胞状态 体内 血小板表型分析，并避免了立即标记和样本采集的需要。代表性结果表明，这种固定样本的方法可在经验证的固定后时间间隔内实现延迟的集中处理。这使得不具备现场流式细胞术设施的中心也能参与研究，同时保持一致的分析前操作流程。该方案的第二个优势在于采用简化的直接染色策略，仅使用简单的双色检测组合，从而降低了操作的复杂性。

在本实验中，我们采用了经过充分验证的抗组织因子（TF）单克隆抗体克隆HTF1，该抗体可识别TF的催化位点，并与因子VII的结合发生竞争，因此是目前可用于TF检测（包括血小板中的TF检测）最可靠的试剂之一^14,16,17。该抗体偶联了Star Fluor 488染料，这是一种亮度高、光稳定性好的荧光染料，光谱特性与FITC相似，但信号稳定性更优。重要的是，488 nm的激发波长可与几乎所有常规流式细胞仪（包括入门级仪器）配备的蓝色激光配置兼容，从而实现样本检测。这种表位特异性与简便的荧光检测方式相结合，提高了分析的灵敏度以及在多个实验场所间的可扩展性。在本检测中，阳性阈值的设定采用了未染色对照和荧光减一对照（FMO），相较于同型对照，该方法在低频率细胞群的阈值设定中更为可靠¹⁸。

不同流式细胞仪的使用可能是多中心流式细胞术研究中变异性的来源^19,20,21我们此前已就分析前处理、染色设置及本地仪器优化提供了建议¹⁷但这些措施无法确保不同平台间荧光信号的一致性。本工作流程通过结合集中化分析与前瞻性采集标准化，解决了这一问题。当使用相同的流式细胞仪时，可采用共享的采集模板；而在必须使用不同平台时，则可应用基于微球的校准方法。相较于仅依赖异质性本地采集后进行集中分析的多中心分析模型，这种双重策略能够降低数据分析的变异性，具有实际优势。 从头算 并在不同实验场所之间支持更可重复的设门应用。

不应过分强调该工作流程的普适性。本方案已通过特定的全血固定条件、抗TF-Star Fluor 488与抗CD41 PerCP-Cy5.5试剂组合、标准化流程以及有限的流式细胞仪配置进行了验证。若使用其他抗TF克隆、荧光染料组合、固定时间或固定剂浓度，或使用光学系统显著不同的流式细胞仪，则应重新评估该工作流程的分析性能。总体而言，任何方案偏差均应按照建议的预定义偏差处理规则进行管理。根据偏差的严重程度，数据可能被标记、重复检测或排除，具体依据研究特定的偏差处理计划而定。在上述范围内，本方案应被视为多中心开展TF^pos-血小板分析的操作框架。包括更广泛的实验室间性能评估、样本运输验证和检测重复性在内的正式分析验证，目前正在由国际血栓与止血学会（International Society of Thrombosis and Hemostasis）主导的一项专门的国际标准化研究中进行。准确量化TF^pos-血小板的临床意义已得到证据支持，研究表明在冠状动脉疾病中，TF^pos-血小板水平 超过4%可独立预测5年随访期间的长期心血管死亡率¹⁶。因此，可靠的多中心检测对于验证TF^pos-血小板作为生物标志物的价值，并将其应用扩展至前瞻性临床试验和真实世界注册研究至关重要。未来引入自动归一化算法和自动设门策略，可能进一步减少操作者偏差，在保持跨中心数据可比性的同时支持去中心化分析^22,23。

总之，这一标准化的工作流程为在多中心环境中通过全血流式细胞术定量检测TF^pos-血小板提供了一种实用且可重复的方法。通过结合标准化的分析前处理步骤、简化的样本处理流程以及仪器标准化策略，该方案实现了不同研究地点间TF^pos-血小板测量结果的可靠比较。该方法不仅有助于评估TF^pos-血小板作为血栓风险生物标志物的价值，其描述的原则还可能推动血小板流式细胞术在转化医学和临床研究应用中的更广泛标准化工作。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含钙和镁的1X PBS	Gibco	10010-015	用于抗体和样本稀释
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 （克隆号 HIP8）	BD	333148	抗人CD41a单克隆抗体，用作血小板群体标记物；应由核心实验室提供
Anti-TF Star Fluor 488 （克隆号 HTF1）	Cyanagen	CR304	抗人组织因子（CD142）单克隆抗体；应由核心实验室提供
BD FACSLyric 流式细胞仪	BD	non catalog item	文中称为流式细胞仪 B
BD FACSuite 软件 v1.6	BD	non catalog item	文中称为软件 B
蝶形针头 G19	PIKDARE	02044019030010	用于采血
CytExpert 软件	Beckman Coulter	non catalog item	文中称为软件 A
CytoFLEX S 流式细胞仪	Beckman Coulter	non catalog item	文中称为流式细胞仪 A
MACSQuant 流式细胞仪	Miltenyi Biotec	non catalog item	文中称为流式细胞仪 C
MACSQuantify 软件 v3.1	Miltenyi Biotec	non catalog item	文中称为软件 C
2 mL Eppendorf 管	Eppendorf	120094	用于全血固定
多聚甲醛	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	用于样本固定
10 µL 移液器吸头	Gilson	F161630	用于转移血液样本
1000 µL 移液器吸头	Gilson	F161670	用于转移血液样本
200 µL 移液器吸头	Gilson	F161930	用于转移血液样本
5 mL 聚苯乙烯圆底管	Corning	352052	流式细胞仪检测所需
Rainbow 校准微球（6 峰）	Spherotech (BD)	556286	用于流式细胞仪标准化
EDTA 真空采血管	BD	368857	用于采集前 3 mL 血液
真空采血管多管采样鲁尔接头	BD	367300	用于采血
一次性真空采血管持针器	BD	364815	用于采血
含 0.129 M 枸橼酸钠的真空采血管	BD	363079	用于血液采集