本方案利用基因编码工具，在体内评估黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫中枢神经系统中特定神经元伙伴之间的功能性突触活动。通过CsChrimson介导的光遗传学刺激上游cIVda感觉神经元，可诱导下游Basin-4中间神经元中CaMPARI发生钙依赖性的光转化。
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本文内容
摘要
摘要
连接组学研究极大地拓展了人们对多种物种神经系统中突触连接性的理解。尽管利用电子显微镜（EM）对突触伙伴进行表征可提供详细的解剖学信息，但神经网络的功能特性仍需借助互补的研究方法。近期在Drosophila中的研究不仅揭示了幼虫以及成年雄性和雌性中枢神经系统的完整连接组，还鉴定了调控特定行为的神经网络细胞组分，例如幼虫伤害感受网络。到三龄幼虫阶段，IV类树突分支（cIVda）多树突感觉神经元（伤害性感受器）已与Basin-4中间神经元建立了大部分突触连接。为了评估这些解剖学连接的功能相关性，研究中采用了一种基因编码的钙指示剂CaMPARI（Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator），在活体、未解剖的三龄幼虫中作为依赖神经活动的报告工具，以检测cIVda神经元与Basin-4中间神经元之间的突触连接性。CaMPARI是一种比率型荧光指示剂，其发射光谱会随细胞内钙离子浓度升高而发生变化。在基础状态下，CaMPARI发出绿色荧光；当存在高浓度钙离子并暴露于光转化光（约400 nm）时，它会不可逆地转变为红色荧光。由于钙离子流入突触后神经元是突触激活的典型特征，因此CaMPARI的光转化可反映功能性突触信号传递。本文提供了一种逐步操作方法：将三龄幼虫固定在显微镜载玻片上，利用红移型通道视紫红质CsChrimson进行光遗传学激活cIVda伤害性感受器，同时在Basin-4神经元中实现CaMPARI的光转化。尽管存在内部运动和焦平面变化，Basin-4神经元中依赖钙离子的光转化仍为这些细胞之间的突触连接性提供了功能证据。该方法验证了在完整、未解剖的Drosophila幼虫中联合使用CaMPARI与突触前光遗传刺激的可行性。
引言
确定中枢神经系统（CNS）中精确的突触伙伴，有助于追踪神经系统发育过程中突触连接的形成与精细化过程。因此，研究工作已集中于利用体电子显微镜（EM）技术，不仅重建了诸如Caenorhabditis elegans1,2和Drosophila melanogaster3,4,5等强大遗传模式生物的完整连接组，还重建了包括小鼠初级视皮层6和人类颞叶皮层7在内的复杂哺乳动物大脑的毫米尺度EM体积数据。这些研究从解剖学层面提供了关于突触连接组织原则的独特见解。然而，对突触伙伴的功能表征能够提供关于神经元连接性的互补信息，并且对于验证解剖学发现至关重要。
Drosophila 在神经元连接性研究方面具有诸多优势，包括已获得幼虫3以及雌性4和雄性5成体中枢神经系统的完整连接组，此外还拥有大量特征明确、....
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方案
所有涉及黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的实验操作均依照机构指南进行。使用基因型 w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4（通过重组 RRID:BDSC_5489912 和 RRID:BDSC_3207916 获得），分别在突触前和突触后细胞中驱动光遗传学元件和 CaMPARI 的表达（使用品系 w-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo，该品系由 RRID:BDSC_81085 与第二染色体标记品系重组获得）。本实验方案中使用的研究工具列于材料表中。
1. 幼虫的制备
- 将 virgin 雌性 UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) 与含有两种二元表达系统的果蝇品系雄蝇进行杂交，例如，由目标突触前神经元驱动 GAL4 表达，同时由目标突触后神经元驱动 LexA33,34。
- 在含有标准玉米粉琼脂培养基的塑料瓶中....
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结果
根据本方案，利用CaMPARI在活体未解剖的黑腹果蝇（D. melanogaster）三龄幼虫中评估了cIVda神经元与Basin-4中间神经元之间的功能连接性（图2）。在进行任何光转化（PC）光刺激或光遗传学激活之前，由于细胞质中表达CaMPARI，Basin-4中间神经元呈现绿色荧光（图2A）。在基础状态下未检测到红色荧光（图2B），证实刺激前未发生光转化。
同时暴露于PC光和光遗传学刺激导致CaMPARI由绿色荧光转化为红色荧光（图2C，D）。为验证该光转化确实由CsChrimson介导的神经元活动所驱动，我们使用相同遗传背景（来自相同的亲本杂交）但未添加全反式视黄醛（ATR）的幼虫作为阴性对照。由于ATR是CsChrimson功能所必需的辅因子，缺乏ATR时即使暴露于594 nm刺激光，.......
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讨论
本文所述方案可对完整 D. melanogaster 幼虫中特定突触伙伴之间的突触连接进行定性和定量评估。该方法结合了对 cIVda 感觉神经元的光遗传学刺激与基于 CaMPARI 的突触后 Basin-4 中间神经元激活可视化，从而在未解剖幼虫的中枢神经系统（CNS）中监测突触活动。以往在 D. melanogaster 中应用 CaMPARI 主要集中于成虫阶段20，或需依赖物理性的突触前刺激（例如伤害性热刺激）17。本方法将 CaMPARI 的应用扩展至更早的发育阶段，并提出一种通过光遗传学突触前刺激与基于 CaMPARI 的突触后检测相结合的策略，实现对突触活动的功能性评估。光遗传学激活可对突触前输入实现精确的时间控制，从而实现对刺激的可控施加，并继而监测突触后 CaMPARI 的响应。
尽管具有这些优势，该方法的实施仍需仔细考虑实验设计、适当的对照以及技术局限性。必须设置阴性对照，包括未添加全反式视黄醛（ATR）培养的幼虫（可阻止CsChri.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
特此感谢海洋生物学实验室（美国马萨诸塞州伍兹霍尔）为开展本技术与方案的故障排查工作所提供的 Hosting 与支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | 用于溶液中水合和封片幼虫的化学试剂 |
| 全反式视黄醛（ATR） | Sigma Aldrich | R2500-500mg | 添加至食物中以激活光遗传工具的化学物质 |
| 共聚焦显微镜 | ZEISS | LSM900 共聚焦 | 共聚焦显微镜，物镜（40×/1.2 NA），光源/激光器（405、488、561 nm） |
| 盖玻片（18×18 mm） | VWR | 48366-205 | 用于固定动物样本以进行成像 |
| 乙醇（95%） | Sigma Aldrich | E7023 | 用作粉末状ATR的溶剂 |
| Fiji（ImageJ） | 开源软件 | RRID:SCR_002285 | 用于图像分析 |
| Prism 版本 10.4.1 | GraphPad Software Inc. | RRID:SCR_002798 | 用于统计分析 |
| 显微镜载玻片 | VWR | 48300-041 | 用于固定动物样本以进行成像 |
| 建模黏土 | Flinn Scientific | FB0600 | 用于将盖玻片固定在载玻片上，幼虫置于其间 |
| 画笔 | Genesee Scientific | 59-204 | 用于在不同位置之间转移幼虫 |
| 标准玉米粉琼脂培养基 | Genesee Scientific | 66-123 | 食物也可使用类似的标准配方和原料制备 |
| 标准果蝇塑料管（25 mm × 95 mm 果蝇窄管） | Genesee Scientific | 32-109 | 也可使用较大的试管或瓶子 |
| 三孔微型斑点板 | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | 用于分离和清洗单个幼虫的培养板 |
| 果蝇品系（基因型：w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4） | Bloomington 果蝇品系中心 | RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079 | 通过重组 RRID:BDSC_54899 和 RRID:BDSC_32079 获得 |
| 果蝇品系（基因型：w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO） | Bloomington 果蝇品系中心 | RRID:BDSC_81085 | 通过将 RRID:BDSC_81085 与第二染色体标记重组获得 |
重印与许可
