突触前和突触后单个配对成员的功能表征 果蝇 利用CaMPARI标记幼虫中枢神经系统

摘要

本方案利用基因编码工具，在体内评估黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫中枢神经系统中特定神经元伙伴之间的功能性突触活动。通过CsChrimson介导的光遗传学刺激上游cIVda感觉神经元，可诱导下游Basin-4中间神经元中CaMPARI发生钙依赖性的光转化。

摘要

连接组学研究极大地拓展了人们对多种物种神经系统中突触连接性的理解。尽管利用电子显微镜（EM）对突触伙伴进行表征可提供详细的解剖学信息，但神经网络的功能特性仍需借助互补的研究方法。近期在Drosophila中的研究不仅揭示了幼虫以及成年雄性和雌性中枢神经系统的完整连接组，还鉴定了调控特定行为的神经网络细胞组分，例如幼虫伤害感受网络。到三龄幼虫阶段，IV类树突分支（cIVda）多树突感觉神经元（伤害性感受器）已与Basin-4中间神经元建立了大部分突触连接。为了评估这些解剖学连接的功能相关性，研究中采用了一种基因编码的钙指示剂CaMPARI（Calcium Modulated Photoactivatable Ratiometric Integrator），在活体、未解剖的三龄幼虫中作为依赖神经活动的报告工具，以检测cIVda神经元与Basin-4中间神经元之间的突触连接性。CaMPARI是一种比率型荧光指示剂，其发射光谱会随细胞内钙离子浓度升高而发生变化。在基础状态下，CaMPARI发出绿色荧光；当存在高浓度钙离子并暴露于光转化光（约400 nm）时，它会不可逆地转变为红色荧光。由于钙离子流入突触后神经元是突触激活的典型特征，因此CaMPARI的光转化可反映功能性突触信号传递。本文提供了一种逐步操作方法：将三龄幼虫固定在显微镜载玻片上，利用红移型通道视紫红质CsChrimson进行光遗传学激活cIVda伤害性感受器，同时在Basin-4神经元中实现CaMPARI的光转化。尽管存在内部运动和焦平面变化，Basin-4神经元中依赖钙离子的光转化仍为这些细胞之间的突触连接性提供了功能证据。该方法验证了在完整、未解剖的Drosophila幼虫中联合使用CaMPARI与突触前光遗传刺激的可行性。

引言

确定中枢神经系统（CNS）中精确的突触伙伴，有助于追踪神经系统发育过程中突触连接的形成与精细化过程。因此，研究工作已集中于利用体电子显微镜（EM）技术，不仅重建了诸如Caenorhabditis elegans^1,2和Drosophila melanogaster^3,4,5等强大遗传模式生物的完整连接组，还重建了包括小鼠初级视皮层⁶和人类颞叶皮层⁷在内的复杂哺乳动物大脑的毫米尺度EM体积数据。这些研究从解剖学层面提供了关于突触连接组织原则的独特见解。然而，对突触伙伴的功能表征能够提供关于神经元连接性的互补信息，并且对于验证解剖学发现至关重要。

Drosophila 在神经元连接性研究方面具有诸多优势，包括已获得幼虫³以及雌性⁴和雄性⁵成体中枢神经系统的完整连接组，此外还拥有大量特征明确、调控可预测行为的神经回路^8,9,10。幼虫伤害性感受网络便是其中非常适合用于研究精确突触连接的回路之一¹¹。对该网络的电镜重建揭示了处理伤害性刺激所必需的详细突触配对关系，这些连接最终引发特征性的逃避行为，即伤害性防御性翻滚^12,13。

在此网络中，IV类树突状分支（cIVda）神经元¹⁴ 作为主要的感觉伤害性感受器，负责疼痛感知^{11,12,13,15,16}其细胞体和树突位于体壁的外周，而轴突则伸入幼虫腹神经索（VNC）¹⁵在中枢神经系统内，cIVda神经元的轴突末梢以一种刻板的模式分支，并与Basin-4中间神经元形成大部分突触连接。^11,12,13,17这种明确的突触连接关系使得cIVda神经元与Basin-4中间神经元成为功能评估突触连通性的理想配对 体内开发用于分析个体明确的突触伙伴之间功能连接的方法，将有助于研究突触发育与精细调控机制，特别是在具有模式化神经回路且遗传操作可行的系统中。

CaMPARI（钙调光可激活比率积分器）¹⁸ 是一种可遗传编码的比率型荧光指示剂，其发射光谱会随着细胞内钙离子水平升高而发生改变。在基础状态下，CaMPARI 发出绿色荧光；当钙离子浓度升高并暴露于光转化光（约 400 纳米 (nm)）时，它会不可逆地转变为红色荧光¹⁸。由于钙离子流入突触后神经元是突触激活的典型特征，CaMPARI 的光转化可作为功能性突触信号传递的读出指标^19,20。

除了CaMPARI外，神经元活动还可以通过可逆性传感器进行可视化，例如基因编码的钙离子指示剂（GECIs），包括GCaMP或RCAMP²¹，以及基因编码的电压指示剂（GEVIs）²² 例如 Arclight²³，Ace2N-mNeon²⁴，或 VARNAM²⁵尽管这些快速、可逆的传感器非常适合实时监测瞬时活动，但在监测过程中容易受到运动伪影的影响 体内 成像。相比之下，CaMPARI 具有整合性和不可逆的光转化特性，能够在特定时间窗口内捕获神经元活动，即使在成像过程中焦平面发生偏移，也能实现神经元激活的检测。²⁰此外，通过调节紫光强度，可以优化CaMPARI的光转化效果，从而实现对突触强度减弱或阈下输入的检测。²⁶这些特性使得在无需固定头部或束缚的自由活动动物中进行神经活动成像成为可能，包括小鼠皮层的研究。²⁷斑马鱼脑²⁸, 秀丽隐杆线虫²⁹，以及成年个体 黑腹果蝇²⁰.

本文描述了一种在完整未解剖的黑腹果蝇（Drosophila）三龄幼虫中，结合共聚焦显微镜技术，利用CaMPARI光转化与突触前光遗传学刺激来可视化功能性突触伙伴的实验方案。该方法中，在活体三龄幼虫中通过光遗传学激活cIVda神经元，利用CaMPARI检测Basin-4中间神经元中的突触后钙离子内流。cIVda神经元表达红光激活的通道视紫红质CsChrimson^30,31，而Basin-4中间神经元则表达CaMPARI。红光照射可选择性激活伤害性感受器，以时间可控的方式模拟伤害性刺激^16,30。该策略可用于评估突触前激活是否在突触后神经元中诱导了钙依赖性的CaMPARI光转化，从而为突触连接提供功能性证据。

CaMPARI 与 CsChrimson 联用在分析 cIVda–Basin-4 连接性方面具有多项技术优势。首先，cIVda 树突在幼虫体壁上形成完整且无重叠的镶嵌分布³²，使得无需解剖即可进行光遗传学激活完整的感受神经元，避免了因解剖操作造成的损伤干扰¹⁶。其次，尽管幼虫在显微镜载玻片上被物理固定，但其内部运动常导致中枢神经系统位置和成像焦平面发生变化；而 CaMPARI 的光转化对这类运动伪影不敏感，能够提供稳定且时间积分的神经元活动读数。第三，CaMPARI 具有可整合和可调节的特性，即使在突触强度或接触数量减少的情况下（例如发育早期阶段），也能检测到突触活动，从而支持未来对突触形成与精细调控的研究。

方案

所有涉及黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的实验操作均依照机构指南进行。使用基因型 w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4（通过重组 RRID:BDSC_54899¹² 和 RRID:BDSC_32079¹⁶ 获得），分别在突触前和突触后细胞中驱动光遗传学元件和 CaMPARI 的表达（使用品系 w^-, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/Cyo，该品系由 RRID:BDSC_81085 与第二染色体标记品系重组获得）。本实验方案中使用的研究工具列于材料表中。

1. 幼虫的制备

1. 将 virgin 雌性 UAS-CsChrimson, LexAop-CaMPARI; CyO/sp (RRID:BDSC_81085) 与含有两种二元表达系统的果蝇品系雄蝇进行杂交，例如，由目标突触前神经元驱动 GAL4 表达，同时由目标突触后神经元驱动 LexA^33,34。
2. 在含有标准玉米粉琼脂培养基的塑料瓶中设置遗传杂交，并添加 0.5 mM 全反式视黄醛（ATR）以激活 CsChrimson^{35,36,37,3830,33}。同时准备不含 ATR 的平行培养瓶作为无 ATR 对照组。
   注意：融化玉米粉琼脂培养基时避免煮沸，待其冷却但未凝固。配制 40 mM ATR 储存液（按照生产商说明，将 ATR 粉末溶于 95% 乙醇），然后将其稀释至培养基中终浓度为 0.5 mM，并充分混匀。
3. 用铝箔完全包裹培养瓶，防止光照。
   注意：由于 ATR 对光敏感，且为避免非预期的神经元激活，培养过程应始终保持在完全黑暗条件下。尽管 CsChrimson 对红光（590–680 nm）最敏感，但也可被其他可见光波长激活^31,39。
4. 将培养瓶置于 25 °C 恒温培养，使幼虫发育至三龄阶段。

2. 幼虫固定

1. 使用画笔收集三龄幼虫。将幼虫置于含有 0.1 M PBS 的三孔微型培养板中清洗，以去除食物残留。
   注意：不要去除多余的 PBS；它有助于保持幼虫的水分。
2. 在干净的盖玻片（18 × 18 mm）的每个角落放置少量塑形粘土。将幼虫置于盖玻片上的 PBS 液滴中，并使其腹面朝下定位。
   注意：若需成像腹神经索（VNC），应将幼虫背侧朝下放置，使腹面接触盖玻片。此方向可使腹神经索中的 Basin-4 中间神经元朝向物镜，透过盖玻片进行观察。
3. 将一块干净的载玻片覆盖在含有幼虫的盖玻片上。
4. 通过在盖玻片四角添加更多塑形粘土来固定盖玻片。施加适当压力以固定幼虫，同时避免压破幼虫或盖玻片。

3. 刺激、光转化与成像工作流程

1. 使用共聚焦显微镜，对表达CaMPARI的突触后神经元进行基线z轴堆栈成像，同时采集绿色（488 nm，0.8%激光功率）和红色（~561 nm，0.8%激光功率）通道信号。显微镜配置40×/1.2物镜，z轴步进为1 µm，图像分辨率为256 × 256像素，线性平均为2，双向扫描，扫描速度为9。所有成像均在黑暗环境中进行。整个实验过程中保持z轴堆栈参数一致。
   注意：预期在幼虫腹神经索（VNC）中特定位置观察到明亮的绿色细胞体，基线状态下无明显红色荧光。
2. 对幼虫持续刺激30秒，同时使用光转化光（405 nm，0.5%激光功率）和光遗传学刺激光（594 nm，0.8%激光功率）。
3. 刺激后，使用与步骤3.1相同的参数，在红色（~561 nm）和绿色（488 nm）通道下采集刺激后的z轴堆栈图像。预期在与基线图像相似的位置观察到VNC中的细胞体。在喂食ATR的幼虫中，可检测到在刺激期间被激活的神经元中出现红色CaMPARI荧光，而在未喂食ATR的对照组中光转化信号极低。
   ​注意：实验流程及参数总结见图1。

图1：刺激、光转化（PC）和成像的工作流程。通过三个连续的成像阶段评估Basin-4神经元中的钙活动。在基线阶段，使用488 nm和561 nm激光采集z层图像（z-stacks），以获取刺激前的绿色和红色CaMPARI荧光信号。在刺激阶段，通过CsChrimson（594 nm）对cIVda神经元进行光遗传学激活，同时施加405 nm光照，使活跃状态下的CaMPARI由绿色荧光转化为红色荧光；此30秒期间不进行成像。在刺激后阶段，使用与基线阶段相同的激光设置重新采集z层图像，以检测Basin-4细胞体中发生光转化后的红色荧光信号。所有z层图像均在暗条件下，使用配备40×/1.2 NA物镜的共聚焦显微镜采集，图像分辨率为256 × 256像素，Z轴步长为1 µm，线平均次数为2，并采用双向扫描模式。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 成像分析

1. 在 Fiji（RRID:SCR_002285）中使用启用 Bio-Formats 的方式打开 z-stack 图像。将 Stack 显示模式设置为 Hyperstack，颜色模式设置为 Composite，并启用 Autoscale。滚动浏览 Z 平面，选择聚焦效果最佳的平面。复制所选平面（Image → Duplicate；Channels：1–2；selected Z-plane）。
2. 将红色和绿色通道分离（Image → Color → Split Channels）。
   注意：使用 Image → Adjust → Brightness/Contrast → Auto 调整两个通道的亮度和对比度。
3. 使用 50 像素的滚动球半径对两个通道进行背景扣除（Process → Subtract Background）。
4. 配置测量参数（Analyze → Set Measurements），包含面积（Area）、平均灰度值（Mean gray value）、积分密度（IntDen）、标准差（Standard deviation）以及最小和最大灰度值（Min & Max gray values）。
5. 在绿色通道中使用自由手绘工具（Freehand tool）围绕每个细胞绘制感兴趣区域（ROIs）。将 ROIs 添加至 ROI Manager 并进行测量。将相同的 ROIs 应用于红色通道并进行测量。
6. 将所有测量结果记录在电子表格中，包括幼虫和细胞标识符。
   注意：需对刺激前和刺激后的图像均进行测量。
7. 使用积分密度值计算红绿荧光比值，获得每个细胞的 (R/G)_post 和 (R/G)_pre。按每条幼虫取细胞水平数值的平均值。
   注意：积分密度（面积 × 平均值）可实现不同大小细胞间的比较。
8. 使用幼虫水平的平均值计算 Δ(R/G)，即 (R/G)_post − (R/G)_pre。将正的 Δ(R/G) 值解释为光转化期间突触后钙活性增加。
   注意：负的 Δ(R/G) 值可能源于噪声或背景不对称性，应将负值设为 0。在本数据集中，一条幼虫出现负值（−0.008），已将其设为 0。

结果

根据本方案，利用CaMPARI在活体未解剖的黑腹果蝇（D. melanogaster）三龄幼虫中评估了cIVda神经元与Basin-4中间神经元之间的功能连接性（图2）。在进行任何光转化（PC）光刺激或光遗传学激活之前，由于细胞质中表达CaMPARI，Basin-4中间神经元呈现绿色荧光（图2A）。在基础状态下未检测到红色荧光（图2B），证实刺激前未发生光转化。

同时暴露于PC光和光遗传学刺激导致CaMPARI由绿色荧光转化为红色荧光（图2C，D）。为验证该光转化确实由CsChrimson介导的神经元活动所驱动，我们使用相同遗传背景（来自相同的亲本杂交）但未添加全反式视黄醛（ATR）的幼虫作为阴性对照。由于ATR是CsChrimson功能所必需的辅因子，缺乏ATR时即使暴露于594 nm刺激光，...

讨论

本文所述方案可对完整 D. melanogaster 幼虫中特定突触伙伴之间的突触连接进行定性和定量评估。该方法结合了对 cIVda 感觉神经元的光遗传学刺激与基于 CaMPARI 的突触后 Basin-4 中间神经元激活可视化，从而在未解剖幼虫的中枢神经系统（CNS）中监测突触活动。以往在 D. melanogaster 中应用 CaMPARI 主要集中于成虫阶段²⁰，或需依赖物理性的突触前刺激（例如伤害性热刺激）¹⁷。本方法将 CaMPARI 的应用扩展至更早的发育阶段，并提出一种通过光遗传学突触前刺激与基于 CaMPARI 的突触后检测相结合的策略，实现对突触活动的功能性评估。光遗传学激活可对突触前输入实现精确的时间控制，从而实现对刺激的可控施加，并继而监测突触后 CaMPARI 的响应。

尽管具有这些优势，该方法的实施仍需仔细考虑实验设计、适当的对照以及技术局限性。必须设置阴性对照，包括未添加全反式视黄醛（ATR）培养的幼虫（可阻止CsChri...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	用于溶液中水合和封片幼虫的化学试剂
全反式视黄醛（ATR）	Sigma Aldrich	R2500-500mg	添加至食物中以激活光遗传工具的化学物质
共聚焦显微镜	ZEISS	LSM900 共聚焦	共聚焦显微镜，物镜（40×/1.2 NA），光源/激光器（405、488、561 nm）
盖玻片（18×18 mm）	VWR	48366-205	用于固定动物样本以进行成像
乙醇（95%）	Sigma Aldrich	E7023	用作粉末状ATR的溶剂
Fiji（ImageJ）	开源软件	RRID:SCR_002285	用于图像分析
Prism 版本 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	用于统计分析
显微镜载玻片	VWR	48300-041	用于固定动物样本以进行成像
建模黏土	Flinn Scientific	FB0600	用于将盖玻片固定在载玻片上，幼虫置于其间
画笔	Genesee Scientific	59-204	用于在不同位置之间转移幼虫
标准玉米粉琼脂培养基	Genesee Scientific	66-123	食物也可使用类似的标准配方和原料制备
标准果蝇塑料管（25 mm × 95 mm 果蝇窄管）	Genesee Scientific	32-109	也可使用较大的试管或瓶子
三孔微型斑点板	Electron Microscopy Sciences	71561-01	用于分离和清洗单个幼虫的培养板
果蝇品系（基因型：w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4）	Bloomington 果蝇品系中心	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	通过重组 RRID:BDSC_54899 和 RRID:BDSC_32079 获得
果蝇品系（基因型：w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO）	Bloomington 果蝇品系中心	RRID:BDSC_81085	通过将 RRID:BDSC_81085 与第二染色体标记重组获得