利用CaMPARI对 果蝇 幼虫中枢神经系统中突触前和突触后伴侣的功能性特征

Summary

该方案利用遗传编码工具评估 果蝇黑胃蝇 幼虫中枢神经系统中特定神经伴侣之间的活体功能突触活动。CsChrimson介导的前突触cIVda感觉神经元的光遗传刺激，诱导突触后盆地4中间神经元中CaMPARI的钙依赖性光转换。

Abstract

连接组研究极大地拓展了对多种物种神经系统突触连接的理解。虽然利用电子显微镜（EM）对突触伙伴的表征提供了详细的解剖信息，但神经网络的功能方面需要互补的方法。最近对 果蝇 的研究不仅揭示了幼虫的完整连接组，以及雄性和雌性成年中枢神经系统，还揭示了调节特定行为的神经元网络中的细胞组成，如幼虫的伤害感受网络。到了第三龄幼虫阶段，IV类树突状树状树状发育（cIVda）多树突感官神经元（伤害感受器）建立了大多数与Basin-4中间神经元的突触接触。为评估这些解剖连接的功能相关性，基因编码的钙指示剂CaMPARI（钙调制光激活比分积分器）被用于活体未解剖的三龄幼虫中，作为活动依赖性报告剂，以评估cIVda神经元与盆地4中间神经元之间的突触连接性。CaMPARI是一种比比荧光指示剂，其发射光谱会随着细胞内钙水平升高而变化。在基线条件下，CaMPARI会发出绿色荧光;在高钙浓度存在且暴露于光转换光（~400纳米）时，它不可逆地转为红色荧光。由于钙流入突触后神经元是突触激活的标志，CaMPARI光转换提供了功能性突触信号的读数。采用一种逐步方法，将三龄幼虫固定在显微镜载玻片上，利用红移的通道视紫红质CsChrimson，结合盆地4神经元同步进行CaMPARI光转换，激活cIVda伤害感受器。尽管盆地4神经元内部运动和焦点平面发生变化，但其钙依赖性光转换为这些细胞间突触连接提供了功能证据。这为CaMPARI结合突触前光遗传刺激在完整未解剖果 蝇 幼虫中的原理验证。

Introduction

在中枢神经系统（CNS）中识别精确的突触伙伴，有助于追踪神经系统发育过程中突触连接的形成和细化过程。因此，工作重点在于利用体积电子显微镜（EM）重建强大遗传模式生物（如秀丽隐杆线虫^1,2和果蝇^3,4,5）的完整连接组，还包括复杂哺乳动物大脑的毫米级电子显微量体积，包括小鼠的初级视觉皮^层6和人类颞叶皮层⁷.这些研究为解剖层面突触连接的组织原理提供了独特见解。然而，对突触伴侣的功能性特征为神经元连接提供了互补的洞见，并且是验证解剖学发现的必要条件。

果蝇为神经元连接研究提供了诸多优势，包括为幼虫³号以及雌性⁴号和雄性⁵号成年中枢神经系统提供完整的连接组，此外还有经过充分描述的神经回路，调节可预测行为^8,9,10。幼虫伤害感受网络是研究精确突触连接性的理想回路^之一。对该网络的电磁重建揭示了处理伤害感受刺激所需的详细突触伙伴关系，导致了被称为痛觉滚动的典型逃逸行为^12,13。

在该网络中，IV类树突状树状分化（cIVda）神经元¹⁴作为主要感觉伤害感受器，负责疼痛检测11,12,13,15,16。它们的细胞体和树突位于体壁的外围，而轴突则投射到幼虫腹侧神经索（VNC）¹⁵。在中枢神经系统内，cIVda神经元以典型模式形成轴突末梢，并与盆4中间神经元^{11、12、13、17}形成大部分突触接触。这一明确的突触关系确立了cIVda神经元和Basin-4中间神经元作为体内突触连接功能评估的理想配对。分析个体识别突触伙伴间功能联系的方法的发展，将有助于研究突触发展和精细背后的机制，尤其是在具有刻板神经回路的遗传可控系统中。

CaMPARI（钙调制光激活比例积分器）¹⁸是一种基因编码的比例荧光指示剂，其发射光谱会随着细胞内钙水平升高而发生变化。在基线条件下，CaMPARI会发出绿色荧光;在高钙浓度存在且暴露于光转换光（~400纳米（nm））时，它不可逆转地转化为红色荧光¹⁸。由于钙流入突触后神经元是突触激活的标志，CaMPARI光转换提供了功能性突触信号的读数^19,20。

除了CaMPARI，神经元活动还可以通过可逆传感器可视化，如遗传编码钙指示剂（GECIs，如GCaMP或RCAMP²¹），以及基因编码电压指示器（GEVIs）²²，如Arclight²³、Ace2N-mNeon²⁴或VARNAM²⁵。虽然这些快速可逆传感器非常适合实时监测瞬态活动，但在体内成像过程中容易出现运动伪影。相比之下，CaMPARI的整合性和不可逆光转换特性使得在特定时间窗口内捕捉活动，即使在成像²⁰时焦平面移动也能检测神经元激活。此外，CaMPARI光转换还可以通过调节紫光强度来调节，从而检测突触强度减弱或亚阈值输入²⁶。这些特性使得在无头部固定或系绳的情况下自由活动动物中进行活动映射成为可能，包括对小鼠皮层²⁷、斑马鱼脑²⁸、秀丽隐杆线虫²⁹和成蝇²⁰的研究。

本书描述了一种通过CaMPARI光转换结合共聚焦显微镜进行突触前光遗传刺激，在完整未解剖的果蝇幼虫中可视化功能性突触伙伴的方案。在该方法中，CaMPARI用于检测活三龄幼虫cIVda神经元光遗传激活后，盆地4中间神经元的突触后钙流入情况。cIVda神经元表达红光激活的通道视紫红质CsChrimson^30,31，而Basin-4中间神经元表达CaMPARI。红光暴露于有选择性地激活伤害感受器，以时间控制的方式模拟伤害感受刺激^16,30。该策略能够评估突触前激活是否诱导突触后神经元的钙依赖性CaMPARI光转换，从而提供突触连接的功能证据。

多项技术优势支持将CaMPARI与CsChrimson结合使用，用于cIVda–盆地-4连通性分析。首先，cIVda树突形成完整且不重叠的幼虫体壁铺砖³²，使完整感觉神经元能够光遗传激活，同时避免剥离引起的损伤干扰¹⁶。其次，尽管幼虫在显微镜载玻片上被物理固定，但内部运动常常改变中枢神经系统的位置和焦平面;CaMPARI光转换对此类运动伪影的敏感度较低，能够提供稳定且时间整合的神经元活动读数。第三，CaMPARI的整合性和可调性特性使得即使在突触强度或接触次数减少（如早期发育阶段）时，也能检测突触活动，从而支持未来突触形成和精细的研究。

Protocol

所有涉及 果蝇 的实验程序均遵循机构指南进行。基因型w;Basin4-LexA/CyO-TwGFP;ppk-GAL4/ppk-GAL4（通过重组RRID：^{BDSC_54899 12} 和RRID：BDSC_32079¹⁶获得）被用于驱动光遗传和CaMPARI表达（使用w^-、UAS-IVS-CsChrimson.mVenus、LexAOp-CaMPARI2;Sp/Cyo 分别通过将 RRID：BDSC_81085 与第二染色体标记重组）在突触前和突触后伴侣中获得。本协议中使用的研究工具列于 材料表中。

1. 幼虫的制备

1. 建立处女雌性UAS-CsChrimson、LexAop-CaMPARI的遗传杂交;例如，含有两个二元系统的蝇系中的雄性（CyO/sp）（RRID：BDSC_81085）以及雄性，其中目标突触前神经元驱动GAL4表达，目标突触后神经元驱动LexA^33,34。
2. 在塑料瓶中进行基因杂交，内含标准玉米粉琼脂培养基35,36,37,38，辅以0.5 mM全反式视网醛（ATR）以激活CsChrimson30,33。准备无ATR的平行小瓶作为无ATR对照。
   注意： 将玉米面琼脂培养基融化，但不煮沸。让它冷却而不凝固。准备40 mM ATR高汤溶液（根据制造商说明稀释为95%乙醇的ATR粉末），然后在介质中稀释至0.5 mM，彻底混合。
3. 用铝箔完全覆盖小瓶，以防止光线照射。
   注意：由于ATR对光敏感，应在持续黑暗中保持育儿条件，并防止神经元意外激活。虽然CsChrimson对红光最为敏感（590–680纳米），但它也可以被其他可见波长^31,39激活。
4. 在25°C下孵育小瓶，将幼虫养至第三龄。

2. 幼虫固定

1. 用画笔采集第三龄幼虫。用含有0.1 M PBS的三孔微点板清洗幼虫以去除食物。
   注意： 不要去除多余的PBS;它有助于保持水分。
2. 在干净的封面衬片（18 × 18 mm）的每个角落各放少量塑形粘土。将幼虫放入一滴PBS中，放在盖子上，让它朝下朝下。
   注意： 为了成像腹侧神经索（VNC），将幼虫安装在其背侧，使腹面接触盖膜。这种朝向使VNC中的盆4中间神经元能够通过覆盖滑道面向物镜。
3. 将一张干净的显微镜载玻片覆盖在含有幼虫的盖片上。
4. 通过在角落涂上额外的塑形粘土来固定封面套。施加足够的压力使幼虫无法活动，同时避免幼虫破裂或盖层。

3. 刺激、光转换与成像工作流程

1. 通过同时使用绿色（488 nm，0.8%激光功率）和红色（~561 nm，0.8%激光功率）通道，获取表达CaMPARI的突触后神经元基线z叠。使用1微米Z步，256×256像素分辨率，线平均2，双向扫描，扫描速度9，配备40×/1.2物镜的共聚焦显微镜。所有成像都应在黑暗环境中进行。在整个实验过程中保持相同的z堆栈参数。
   注意： 在幼体VNC中，细胞体呈明亮绿色，且基线时无可检测的红色荧光。
2. 使用同时光转换光（405纳米，0.5%激光功率）和光发育刺激光（594纳米，0.8%激光功率）连续刺激幼虫30秒。
3. 在红色（~561 nm）和绿色（488 nm）通道下，使用步骤 3.1 相同的参数获得一个刺激后Z堆栈。预计VNC细胞体的位置与基线相似。在ATR喂养的幼虫中，检测刺激激活神经元中的红色CaMPARI荧光，在无ATR对照组中光转换极少。
   注意：工作流程和参数总结见图1。

图1：刺激、光转换（PC）和成像的工作流。 采用三个顺序成像阶段评估盆4神经元的钙活性。基线阶段，使用488 nm和561 nm激光采集z叠片，捕捉绿色和红色CaMPARI荧光，然后再刺激。在刺激阶段，cIVda神经元通过CsChrimson（594 nm）进行光遗传激活，同时405 nm光照将活性CaMPARI从绿色荧光转换为红色荧光;这30多期间未进行影像检查。在刺激后阶段，使用基线相同的激光设置重新采集z叠，以检测Basin-4细胞体中的光转换红信号。所有z叠片均以256×256像素采集，Z步长为1微米，线均值为2，使用配备40×/1.2 Na物镜的共聚焦显微镜，在暗条件下实现双向扫描。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 影像分析

1. 在斐济（RRID：SCR_002285）启用生物格式后打开z堆栈图像。将堆栈视图设置为超栈，颜色模式设置为复合，并启用自动缩放。浏览Z平面，选择对焦最优的平面。复制所选平面（图片→复制;频道：1–2;选定的Z平面）。
2. 分红和绿频道（图片→彩色→分频道）。
   注意： 使用图像调节亮度和对比度→调整→亮度/对比度→自动。
3. 使用滚动球半径50像素，从两个通道中减去背景（处理→减去背景）。
4. 配置测量值（分析→集测量），包括面积、平均灰度值、积分密度（IntDen）、标准差以及最小值和最大值灰度值。
5. 使用Freehand工具在绿色通道的每个单元格周围绘制兴趣区域（ROI）。将投资回报率添加到ROI管理器中并进行测量。对红色通道应用相同的投资回报率并进行测量。
6. 将所有测量数据记录在电子表格中，包括幼虫和细胞识别码。
   注意： 对刺激前后图像进行测量。
7. 利用积分密度值计算红绿荧光比，获得每个细胞_的（ R/G）后和（R/G）_前 。每只幼虫的平均细胞水平。
   注意： 积分密度（面积×均值）允许跨不同尺寸单元进行比较。
8. 利用幼虫平均计算 Δ（R/G）为 （R/G）_后 − （R/G）_预。 将正的Δ（R/G）值解释为光转换过程中突触后钙活性增加。
   注意： 负的 Δ（R/G） 值可能源于噪声或背景不对称。将负值设为0。在该数据集中，一只幼虫的值为负值（−0.008），并将其设为0。

Results

按照该方案，利用CaMPARI评估了活体未解剖的 D. melanogaster 第三龄幼虫中cIVda神经元与Basin-4中间神经元的功能连接性（见图2）。在任何光转化（PC）光或光遗传激活刺激之前，Basin-4中间神经元因细胞质CaMPARI表达表现出绿色荧光（见图2A）。基线条件下未检测到红色荧光（见图2B），确认刺激前无光转换。

同时暴露于PC光和光遗传刺激下，CaMPARI的光转化为绿色荧光为红色荧光（图2C，D）。为验证光转换是否由CsChrimson介导的神经元活动特异驱动，采用了具有相同遗传背景（同一亲代杂交）且未使用全反式视黄醛（ATR）培养的幼虫进行负对照。由于ATR是CsChrimson功能的重要辅因子，其缺失使得即使暴露于594纳米刺激光，视蛋白仍无法发挥功能。该对照...

Discussion

本文所述的方案能够对完整 黑胃肠幼 虫中定义突触伙伴间突触连接性进行定性和定量评估。该方法结合光遗传刺激cIVda感觉神经元与基于CaMPARI的激活突触后盆地4中间神经元可视化，监测未解剖幼虫中枢神经系统（CNS）的突触活动。此前CaMPARI在 黑腹腹泻 中的应用主要集中在成虫阶段²⁰ 或需要物理突触前刺激（如伤害感受热刺激）¹⁷。本方法将CaMPARI的使用扩展到早期发育阶段，并引入了通过将光遗传突触前刺激与基于CaMPARI的突触后检测结合，评估突触活动的功能性策略。光遗传激活提供了对突触前输入的精确时间控制，使得对突触后CaMPARI反应进行受控刺激和后续监测成为可能。

尽管有这些优势，但实施该方法仍需仔细考虑实验设计、适当控制和技术限制。需要阴性对照，包括未使用全反式视网醛（ATR）培养的幼虫（防止CsChrimson激活^30,33

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M 磷酸盐缓冲盐水（PBS）	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	用于溶液中水合和安装幼虫的化学品
全反式视黄醇（ATR）	Sigma Aldrich	R2500-500mg	添加到食物中以激活光遗传学工具的化学品
共聚焦显微镜	ZEISS	LSM900 共聚焦	共聚焦显微镜，物镜（40×/1.2 NA），光源/激光源（405, 488, 561 nm）
盖玻片（18x18mm）	VWR	48366-205	用于安装动物以进行成像
乙醇（95%）	Sigma Aldrich	E7023	用作粉末ATR的溶剂
Fiji（ImageJ）	开源	RRID:SCR_002285	用于成像分析
Prism 版本 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	用于统计分析
显微镜载玻片	VWR	48300-041	用于安装动物以进行成像
橡皮泥	Flinn scientific	FB0600	用于将玻璃片固定在载玻片上，其间放有幼虫
画笔	Genesee scientific	59-204	用于在不同位置之间转移幼虫
标准玉米琼脂培养基	Genesee scientific	66-123	食物也可以使用类似的标准配方和成分来准备
标准果蝇塑料瓶（25mm x 95mm 果蝇窄瓶）	Genesee scientific	32-109	也可以使用大瓶或大瓶子
三孔微点板	电子显微镜科学	71561-01	用于分离和清洁单个幼虫的板
果蝇库存（基因型：w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4）	Bloomington 果蝇库存中心	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	通过重组 RRID:BDSC_54899 和 RRID:BDSC_32079 获得
果蝇库存（基因型：w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO）	Bloomington 果蝇库存中心	RRID:BDSC_81085	通过重组 RRID:BDSC_81085 和第二条染色体标记获得