本方案描述了一种扩展辅助的HCR-smFISH与免疫组织化学工作流程，用于对果蝇（Drosophila）大脑中的RNA和蛋白质表达进行定量的、细胞类型特异性的分析，包括使用光片显微镜或共聚焦显微镜成像，以及对细胞核和细胞质转录本的自动定量分析。
本文内容
摘要
摘要
定量、空间分辨的基因表达分析对于评估细胞类型特异性的分子谱至关重要。在 果蝇 视觉系统，丰富的遗传工具为直接评估特定神经元群体中RNA和蛋白质水平提供了框架。本文中，我们提供了一种逐步操作方案，该方案结合了扩增辅助的HCR-smFISH（杂交链式反应单分子荧光原位杂交） 原位 杂交）与免疫组织化学相结合，以实现对细胞类型特异性分子谱的定量分析 在基因定义的视觉系统神经元类型中。该工作流程针对带有核定位或膜结合标记物的细胞进行了优化，可在同一神经元中测量转录本和蛋白质水平。组织扩增后，样本采用光片显微镜进行快速三维成像，同时提供了适用于标准倒置激光扫描共聚焦显微镜和转盘共聚焦显微镜的替代性封片与成像流程。我们进一步提供了一种自动分割算法，可区分核内与胞质转录本，从而实现对转录状态及亚细胞RNA定位的分析。本文还就影响信号质量、组织完整性和定量性能的实验参数及常见问题提供了实用指导。代表性应用包括通过定量RNA和蛋白质水平的相应变化，验证细胞类型特异性的RNA干扰效果。该方法通过实现具有细胞类型特异性的RNA和蛋白质水平整合测量，为假设驱动的分子分析提供了一种可扩展的策略，并在特定靶向情境下成为单细胞转录组检测的一种实用替代方案。本方案提供了一种在保持完整解剖结构背景下验证细胞类型特异性分子扰动的实用方法 果蝇 脑
引言
Drosophila melanogaster 视觉系统已成为研究发育神经科学中广泛问题的强大模型，包括神经元分化1,2、细胞类型特化3,4以及脑连接的分子机制5,6,7。这些进展得益于异常丰富的实验工具包，包括大量细胞类型特异性的遗传驱动品系8,9,10、近期全面的连接组重建10,11,12，以及日益精细的单细胞转录组13,14和多组学15数据集。这些资源共同以多模态方式定义了神经元类型，并实现了精确的遗传操作。因此，该领域目前能够提出越来越具有预测性的假设，以解释特定基因如何调控神经元的身份、连接性和功能16。尽管单细胞RNA测序能够深入揭示转录状态，但RNA丰度并不总能预测蛋白质表达17，而许多扰动实验最终都需要在同一神经元中对RNA和蛋白质进行直接且定量的测量。
单分子荧光 原位 杂交（单分子荧光原位杂交，smFISH）18,19 能够在保持解剖学背景的同时，以细胞和亚细胞分辨率对转录本丰度进行定量测量。将单分子荧光原位杂交（smFISH）与扩展显微镜技术相结合20,21,22 通过在可膨胀水凝胶中物理扩增组织，该技术已进一步拓展至完整脑组织的应用，从而减少分子拥挤，改善光学通路，并提高有效空间分辨率。当与基于杂交链式反应（HCR）的信号放大技术联用时23扩增辅助的smFISH技术可在厚神经组织中稳定检测出离散的转录本，并支持利用光片显微镜或共聚焦显微镜进行全脑成像。
多种 原位 RNA成像技术已被应用于 果蝇 大脑，反映出不同的实验重点。扩增辅助迭代HCR-FISH技术实现了全脑范围内空间分辨的RNA检测24与此同时，非扩增型全组织FISH技术已用于遗传标记神经元中的RNA检测，包括以即刻早期基因为核心的基于HCR的活性图谱绘制策略25 基于膜结合的遗传编码标记物的分割转录计数工作流程26商业化的探针检测方法（如RNAscope）进一步实现了全脑范围内的多重RNA检测，通常与免疫组织化学结合使用，以鉴定特定的细胞群体27这些方法共同表明，在果蝇大脑中进行空间分辨的RNA分析在技术上是可行的。然而，基于假设的扰动实验对技术流程提出了更为具体的要求，而现有的任何单一工作流程均未能完全满足这些要求。许多方法通常优先考虑多重发现式转录本定位、活性状态谱型分析或仅进行RNA定量，其中免疫染色通常仅用作细胞鉴定手段，而非与被扰动蛋白相对应的匹配检测指标，或在缺乏遗传性细胞类型鉴定的情况下被单独应用。28此外，常规应用将受益于与多种成像平台的兼容性，以及自动化、可扩展的分析流程。
本文介绍了一种整合的、逐步操作的工作流程，用于果蝇（Drosophila）视觉系统，该流程结合了扩增辅助的HCR-smFISH技术与扩增前进行的免疫组织化学染色，能够在同一生物样本的相同神经元中联合检测RNA和蛋白质水平。在我们先前开发的FlySeg分析框架29基础上，我们提供了一个自动化的定量分析流程，用于细胞核分割和转录本计数，能够区分细胞核内和细胞质中的信号点，支持总表达量测量以及对转录状态敏感的分析。本方案在光片显微镜和两种共聚焦系统上进行了验证，采用了不同的样品封片与成像流程。最后，我们通过一个典型的扰动-验证实验（即通过RNAi介导特定靶标的基因敲低），展示了RNA-蛋白质联合检测方法的应用价值，并就影响信号质量、组织完整性和定量性能的相关参数及潜在问题提供了实用指导。
本方案主要基于先前报道的24用于果蝇（Drosophila）全脑RNA检测的EASI-FISH框架，并保留了其核心原理，包括RNA锚定、水凝胶扩增以及基于杂交链式反应（HCR）的信号放大。本方案在原有基础上进行了拓展和优化：通过在扩增前整合免疫组织化学染色，实现在同一神经元中对RNA和蛋白质进行匹配检测；通过改进整个实验流程中的多个处理和操作步骤，提高实验的稳健性和可重复性；提供了适用于光片显微镜和常规倒置共聚焦显微镜的实用封片与成像策略；并引入了自动化的胞体分割及转录本定量方法，明确区分细胞核与细胞质中的RNA池。
该实验流程最适合用于目标明确的研究，旨在对基因型明确的神经元中的特定RNA和蛋白质表达水平进行定量分析，同时保留其解剖学背景信息。该方法在验证分子干预效果时尤为有用，例如检测特定基因或少量候选基因的上调或下调、比较不同基因型或发育阶段间的表达差异，或通过细胞核与细胞质中转录本的定位来评估转录状态。该流程不适用于无偏倚的转录本发现或高重整个脑部表达图谱绘制，此类研究更适合采用单细胞测序、空间转录组学或迭代多重FISH技术。
方案
伦理声明
本方案使用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）。未使用脊椎动物或人类受试者，因此无需机构动物护理和使用委员会批准。
注意： 整个操作过程中均需使用无 RNase 的技术。佩戴手套，用 RNase 去污染溶液擦拭工作台面和工具，并使用无 RNase 水配制所有溶液。
图1．样本制备方案的逐步工作流程（A）方案的示意图时间线，显示大致的逐日进程及过夜孵育步骤。（B–J）主要样本制备步骤的示意图概览，从脑组织解剖与固定，到免疫组织化学、RNA/蛋白质交联、水凝胶包埋、消化、探针杂交以及HCR信号放大。请点击此处查看此图的放大版本。
1. 大脑解剖、固定和免疫组织化学（第1天–3天）
注意：除非另有说明，所有步骤均在Terasaki式多孔板中进行。孵育和洗涤时每孔使用10 µL。通过在板的一角放置浸湿的实验室擦拭纸以保持湿度。
警告：多聚甲醛和乙二醛固定剂具有毒性/刺激性。应在通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备。
- 在冰冻的 S2 昆虫培养基中解剖脑组织。将脑组织转移至孔板中，每孔最多放置 10 个脑组织（图 1B–C）。
注：本实验所展示的代表性结果使用的是 72 小时龄的蛹脑。 - 每孔加入 10 µL 固定液，替换一次原 S2 培养基。
- 在含 5%（w/v）蔗糖的无酸 Addax 乙二醛固定液中，4 °C 过夜固定（图 1C）。
- 在室温下，用 10 µL PBST（含 0.5% Triton X-100 的 PBS）洗涤脑组织 3 次，每次 10 分钟。
注意：Triton X-100 具有刺激性，避免接触皮肤和眼睛。 - 在 4 °C 条件下，用 10 µL 一抗溶液（溶于 PBST，稀释比例见材料表）孵育脑组织 24 小时（图 1D）。
- 在 4 °C 条件下，用 10 µL PBST 洗涤脑组织 3 次，每次 10 分钟。每次洗涤过程中，在孵育中途更换一次溶液（每次洗涤共换液两次）。
- 在 4 °C 条件下，用 10 µL 二抗溶液（溶于 PBST，稀释比例见材料表）孵育脑组织 24 小时（图 1D）。
注：避免样品暴露于光照下。 - 在 4 °C 条件下，用 10 µL PBST 洗涤脑组织 3 次，每次 10 分钟。每次洗涤过程中，在孵育中途更换一次溶液（每次洗涤共换液两次）。
注：一抗和二抗的使用浓度应比标准全组织免疫组化浓度高 2–3 倍。
暂停点：可将脑组织置于 10 µL 1× PBS 中，4 °C 保存最多 96 小时。
2. RNA 和蛋白质的共价固定（第4天）（图1E）
警告：RNA 锚定烷基化试剂和 AcX 具有危险性（有毒/刺激性；部分可能为致癌物）。请在化学通风橱中配制和操作溶液，并穿戴适当的个人防护装备。所有废弃物均需作为危险化学废物收集。
- 将脑组织在 10 µL 的 20 mM MOPS 缓冲液（pH 7.7）中于 37 °C 孵育 20 分钟。
- 通过混合 49.5%（v/v）20 mM MOPS、49.5%（v/v）美法仑储备液（2.5 mg·mL-1 溶于 DMSO）和 1%（v/v）AcX 储备液（10 mg·mL-1 溶于 DMSO）制备锚定溶液。此混合液的终浓度为 1.24 mg·mL-1 美法仑和 0.10 mg·mL-1 AcX。
- 每孔用 7–8 µL 锚定溶液替换 MOPS 缓冲液，更换一次溶液，并于 37 °C 避光孵育过夜。
注意：使用 7–8 µL 以尽量减少溢出和孔间混合，同时确保样本完全覆盖。
3. 凝胶化（将脑组织包埋于水凝胶中）及蛋白酶K消化（第5天）
警告：丙烯酸类单体、过硫酸铵（APS）和四甲基乙二胺（TEMED）具有刺激性/毒性。操作时需佩戴个人防护装备；在通风橱中配制易挥发或放热的组分。
- 将一个厚度为 0.5 mm 的粘性硅胶垫圈贴附到未带电的玻璃显微镜载玻片上（图 1F，左下），用力按压以确保完全接触并密封。
- 向腔室中加入 200 µL 多聚赖氨酸（poly-L-lysine）溶液，并均匀铺展以覆盖表面，在室温下孵育 5 分钟，然后用移液器吸除溶液。
- 让多聚赖氨酸充分蒸发，直至表面明显干燥。
注意：多聚赖氨酸蒸发较慢。为获得可靠结果，应提前制备腔室，并在无尘环境中过夜干燥。或者，在使用当天将其置于 37 °C 培养箱中干燥至少 1 小时。 - 在室温下用 10 µL 1× PBS 溶液清洗脑组织 2 次，每次 10 分钟。
- 配制凝胶单体溶液，并在使用前立即加入聚合试剂，按 47:1:1:1 的比例将单体溶液与 4HT、TEMED 和 APS 混合（现配现用）。最终凝胶溶液包含 1 M 丙烯酸钠、14% 丙烯酰胺、0.1% 双丙烯酰胺、1× PBS、0.01% 4HT、0.2% TEMED 和 0.2% APS。
- 短暂涡旋混匀，将最终凝胶溶液置于冰上保存，并立即使用。
- 将脑组织置于 10 µL 冰冷的凝胶溶液中，在冰上孵育 15 分钟。
- 在预平衡过程中，使用新的剃须刀片在硅胶垫圈的两侧各切出一条狭窄通道，以便填充时排出空气（图 1F，左上）。
- 使用移液器吸头将脑组织转移至已准备好的凝胶腔室中，确保每个脑组织始终浸没在凝胶溶液中。
警告：在固定和平衡后，脑组织会变得高度黏附，并容易粘附于塑料表面。为防止样本丢失，请使用宽口移液器吸头，或剪切标准吸头末端以扩大开口。 - 从硅胶垫圈粘合面去除保护衬层，轻轻将一块洁净的 1.5H 玻璃盖玻片覆盖在腔室上，避免产生气泡。
- 通过一侧通道缓慢加入 200 µL 新鲜配制的凝胶溶液，直至腔室完全充满。
- 将密封的腔室放入避光容器中，在 37 °C 下孵育 2 小时。
注意：在容器内放置湿润的实验室擦拭纸。确保载玻片不与液态水直接接触。 - 在无 RNase 的水中配制消化缓冲液，包含 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、500 mM NaCl、1 mM EDTA 和 0.5%（v/v）Triton X-100。
- 使用前立即从 20 mg·mL-1 储液中按 1:100 比例加入蛋白酶 K，使其终浓度为 0.2 mg·mL-1。
警告：蛋白酶 K 具有刺激性，操作时应佩戴手套，避免吸入和皮肤接触。 - 将载玻片在室温下冷却 5 分钟后取下盖玻片。使用手术刀对凝胶进行修整，采用单次直线切割将其切成矩形，尽量减少脑组织周围多余的凝胶体积（图 1F，右上）。
- 将每块修整后的凝胶放入含有 1000 µL 消化液的 24 孔板的独立孔中，确保凝胶完全浸没。
- 用封口膜密封 24 孔板，在室温下置于轨道摇床上以 0.11 g 振荡过夜（图 1G）。
4. DNase 消化与 HCR-smFISH 探针杂交（第6天）
- 使用移液器在孔板边缘小心吸出消化液，避免接触或破坏凝胶。
- 在室温下，将凝胶置于500 µL 1× PBS中，以0.11 g的转速在旋转摇床上洗涤3次，每次15分钟。
暂停点：可将凝胶浸没于500 µL 1× PBS中，在4 °C下保存最多7天后再继续后续操作。 - 通过将QIAGEN无RNase DNase试剂盒中的DNase I原液用RDD缓冲液按1:10稀释，为每块凝胶配制500 µL DNase工作液。最终工作液浓度约为0.27 Kunitz单位·µL-1。
- 将凝胶在500 µL DNase工作液中于37 °C孵育2小时，并轻轻振荡（图1H）。
- 在室温下，用500 µL无RNase的1× PBS将凝胶洗涤4次，每次15分钟。
- 将凝胶在500 µL预热的探针杂交缓冲液中于37 °C平衡30分钟。
- 将HCR smFISH探针原液（1 µM；Molecular Instruments）用探针杂交缓冲液按1:300稀释，终浓度约为3.3 nM。通过涡旋充分混匀。
- 将平衡缓冲液替换为每块凝胶500 µL探针混合液，在0.11g的转速下于37 °C在旋转摇床上孵育过夜（图I）。
注意：探针杂交缓冲液含有有毒的甲酰胺，请佩戴手套并避免吸入。
5. 杂交链式反应（第7天）（图1J）
- 在37 °C下，于旋转摇床（0.11 g）上用500 µL预热的探针洗涤缓冲液洗涤凝胶，每次30分钟，共洗涤3次。
注意：探针洗涤缓冲液含有甲酰胺，具有毒性。操作时需佩戴手套，避免吸入。 - 在室温下，于旋转摇床（0.11 g）上用500 µL 1× PBS洗涤凝胶，每次30分钟，共洗涤3次。
- 将凝胶置于1 mL 1× PBS中，在室温下于旋转摇床（0.11 g）上过夜孵育。
注意：延长的过夜洗涤可通过减少非特异性探针结合和背景荧光点来提高信噪比。若需当天完成处理，可直接进入HCR扩增步骤。
暂停点：杂交后洗涤完成后，可将凝胶置于1 mL 1× PBS中，在室温或4 °C保存最多96小时，再进行HCR扩增。 - 每孔加入500 µL已平衡至室温的扩增缓冲液，替换PBS，并在旋转摇床（0.11 g）上室温孵育30分钟。
- 针对每种探针组，将发夹结构h1和h2（3 µM储存液；Molecular Instruments）用扩增缓冲液按1:100稀释（终浓度为30 nM）。每孔准备350 µL稀释后的发夹混合液。
- 将稀释后的发夹溶液置于PCR管中，在热循环仪或加热块中95 °C加热90秒。每管使用100 µL总体积，以确保加热均匀和温度平衡。
注意：HCR操作指南通常建议分别快速加热发夹h1和h2，待冷却后再混合。或者，当需要简化操作时，也可在快速加热前将h1和h2混合。 - 将发夹溶液在避光条件下静置冷却至室温，持续10分钟，期间勿扰动。
- 移除扩增缓冲液，每孔加入350 µL发夹混合液。
- 在避光条件下，于旋转摇床（0.11 g）上室温孵育凝胶2小时。
- 在室温下，于旋转摇床（0.11 g）上用500 µL 5× SSCT洗涤凝胶，每次10分钟，共洗涤3次。
- 扩增完成后回收发夹溶液，避光保存，并于-20 °C储存以供重复使用。
- 将凝胶转移至500 µL 1× PBS中，在室温下洗涤3次，每次30分钟。
- 将凝胶置于500 µL 1× PBS中，4 °C避光保存。
暂停点：扩增后的凝胶可在成像前保存最多2周，信号损失极小。
6. 扩展样品的制备、固定与成像（第8天）（图2）
- 将凝胶置于含 DAPI（1:1000）的 1× PBS 中，在 4 °C 下于轨道摇床上以 0.11 g 振荡孵育过夜。
- 使用短暂的紫外光照射以观察凝胶内的脑组织。调整样本方向，并根据需要修剪多余的凝胶。
注意：在样本定位和安装过程中会使用紫外光照射。请佩戴适当的眼部防护装备。 - 使用适合所选成像平台的配置，将样本安装于补充了 DAPI（1:1000）的 1× PBS 中（参见 表 1）。
- 在开始采集图像前，让样本至少平衡 1 小时。
- 使用具有足够工作距离的水浸物镜对膨胀后的凝胶进行成像。
- 采用光片显微镜、激光扫描共聚焦显微镜或转盘共聚焦显微镜对样本进行成像。本研究中使用的各平台特异性安装与采集参数总结于 表 1。
注：成像完成后，可通过上述描述的 DNase 消化方法去除探针和 HCR 发卡结构。随后，凝胶可进行多轮额外的探针杂交与 HCR 放大反应。
| 平台 | 样本可视化、固定与定位 | 物镜 / 检测器 | 代表性采集参数 |
| Zeiss Lightsheet 7 | 使用短暂的紫外光照射以在凝胶中观察脑组织位置。修剪多余的凝胶，并将每个脑组织朝向检测物镜方向进行定向。将5–6个凝胶置于1 × 1 cm的多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，凝胶面朝外（图2A）。使用少量紫外固化胶将盖玻片固定到LS7样品架上；在涂抹胶水前关闭紫外灯。将样品安装至LS7成像腔室，并在ZEN Black软件中通过实时成像定位脑区。 | 20×/1.0 NA水浸检测物镜；2.5×光学变焦（总放大倍数50×）。 | z步进为0.4 μm（2.5×变焦，2×扩展条件下）。启用摆动扫描。曝光时间：所有通道均为50 ms。激光器参数：405 nm（5%功率），488 nm（2%功率），561 nm（8%功率）。发射波长范围：420–470 nm，505–545 nm，570–620 nm。 |
| (图2C，左) | |||
| Nikon Ti2-E AXR NSPARC激光扫描共聚焦显微镜 | 使用短暂紫外光照射以观察凝胶内的脑组织。将单个凝胶定向，使脑组织朝下对准倒置物镜。转移至含1× PBS + DAPI的玻璃底成像培养皿中（图2B）。先用4×物镜定位脑组织，再用20×物镜识别感兴趣区域（ROI），并在NIS-Elements软件中记录X-Y坐标位置。添加浸没介质后，重新访问已记录的ROI，并将其调至焦点。 | 40×长工作距离水浸物镜（Nikon CFI APO LWD 40× WI，1.15 NA Lambda S，工作距离0.61 mm）；NSPARC检测器设置为超分辨率模式。 | 振镜扫描，2048 × 2048像素，1.6 μs/像素，8.0×变焦。激光器参数：488 nm（2%功率），640 nm（20%功率）。发射波长范围：502–546 nm 和 666–732 nm。 |
| (图2C，中) | |||
| Evident Scientific IXplore IX85 / Yokogawa CSU-W1转盘共聚焦显微镜 | 样本安装方式同倒置共聚焦成像：将凝胶定向使脑组织朝向物镜，并置于含1× PBS + DAPI的玻璃底成像培养皿中（图2B）。使用cellSens软件，参照激光扫描共聚焦显微镜的方法识别感兴趣区域。 | 60×长工作距离水浸物镜（Olympus LUMFLN60XW LWD，1.10 NA，工作距离1.5 mm）；Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII相机（2304 × 2304像素；像素尺寸6.5 × 6.5 μm）。 | 488 nm激发光，75%功率，曝光200 ms；640 nm激发光，100%功率，曝光800 ms。发射波长范围：500–550 nm 和 665–705 nm。 |
| (图2C，右) |
表1： 不同显微镜平台中具有代表性的样品安装、定位及成像参数。 光片显微镜与共聚焦显微镜平台上所采用的样品安装策略、定位方法、物镜选择及图像采集参数的汇总。
7. RNA和蛋白质表达的定量分析
注意： 根据实验目标选择分析工作流程。这些方法的比较见补充表1。
- 使用 FlySeg 进行群体规模的转录本定量。
注意：分析基于 FlySeg29 流程的更新版本。分析工作流程的示意图见图 3A–B。- 通过以下命令创建 Conda 环境来安装基于 Python 的软件包 FlySeg：
conda env create -f environment.yml - 在分析前激活环境：
conda activate flyseg - 使用以下命令启动分析：
python main.py --file <input_file>
支持的输入格式包括 CZI 或 NPY 文件。 - 根据需要使用可选参数自定义分析，包括：
通道数量（--channels）
细胞核通道（--nuclei_ch 或 --nuclei_wavelength）
细胞质通道（--cytoplasm_ch 或 --cytoplasm_wavelength）
细胞核检测参数（--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold）
细胞核膨胀因子（--nuclei_dilation）
FISH 检测阈值（--fish_threshold_range）
输出目录（--output_dir）
通过 Napari 进行可视化（--visualize） - 使用以下命令查看所有可用选项：
python main.py –help - 使用以下命令检查图像元数据：
python main.py --metadata_only.
确认体素大小、通道数量及通道标识。 - 根据数据集适当调整参数后运行分析。通常需指定总通道数、细胞核通道、细胞质通道（如可用）以及细胞核膨胀因子。
注意：设置合适的 --nuclei_dilation 值以定义所需的细胞核/细胞质边界。示例见图 3C–D。 - 监控处理日志。 所有输出均保存在一个以输入文件命名的文件夹中。
- 识别用于下游分析的主要输出文件，包括：
- -Nuclei-df.csv
该文件包含每个细胞核的特征测量值以及每个 FISH 通道的相关点状信号计数，可用于统计分析的定量数据。 - -Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
该散点图用于根据细胞核大小和强度识别分割异常值；应将被标记为异常值的细胞核从后续分析中排除。
- -Nuclei-df.csv
- 如有需要，可使用其他中间输出文件（例如分割掩模、点状信号检测表和合并的 FISH 汇总文件）进行高级后处理。
- 通过以下命令创建 Conda 环境来安装基于 Python 的软件包 FlySeg：
- 使用 Imaris 对可单独识别的细胞进行转录本计数
- 使用“表面”（Surfaces）工具，基于细胞质或膜标记通道对目标神经元进行分割。
- 调整表面平滑度和强度阈值参数，确保生成的表面准确覆盖胞体，同时排除邻近结构。
- 使用“点状信号检测”（Spots detection）工具，在 FISH 通道中识别转录本点状信号。根据点状信号的大小和信号强度设置估计的点直径和强度阈值（例如，组织扩增 2 倍时为 0.25 µm）。
- 将点状信号检测限制在先前生成的表面内，以确保仅计数神经元内部的点状信号。
- 使用“统计”（Statistics）面板提取神经元表面内检测到的点状信号总数。
- 导出点状信号计数及相关测量值用于下游分析。
- 基于 ROI 的荧光定量分析使用 FIJI/ImageJ
- 在 FIJI 中打开图像堆栈，并使用 图像 > 堆栈 > Z 投影 > 最大强度投影 生成最大强度投影图。实验中所有样本应使用相同的投影设置。
- 使用解剖学标记通道（例如膜或细胞质 GFP）识别目标神经元结构。使用自由手绘或多边形选择工具，手动勾画对应结构的感兴趣区域（ROI）（例如巨纤维树突）。
- 切换到蛋白通道，使用 分析 > 测量 在定义的 ROI 内测量荧光强度。记录以下参数：平均荧光强度、积分密度、ROI 面积。
- 在邻近的、无特异性信号且位于标记神经元结构外的区域选择一个大小相似的背景 ROI，测量其荧光强度。实验中所有样本应采用相同的背景 ROI 策略，并从 ROI 测量值中减去背景值。
- 使用经背景校正的积分密度或平均强度值进行不同基因型或实验条件间的定量比较。确保所有待比较样本使用相同的成像设置。
结果
为了在具有生物学相关性的条件下验证扩增辅助的HCR-smFISH与免疫组织化学工作流程，我们聚焦于果蝇（Drosophila）视觉系统中的临近逃逸神经环路。该环路由基因明确界定的LC4视觉投射神经元30,31和一种特征明确的巨纤维（Giant Fiber, GF）下行神经元组成，前者可检测临近刺激，后者则驱动快速起飞行为32,33，从而为在完整脑组织中进行细胞类型特异性的分子检测提供了一个解剖结构高度保守的模型系统。
Drosophila 的缝隙连接蛋白 Shaking-B（ShakB）34 已被发现参与巨纤维（GF）神经环路中多个组分的电传递过程，包括轴突输出突触35 和听觉输入通路35。尽管在检测逼近物体时，GF 树突处存在电耦合的直接证据尚有限，但近期研究表明 LC4 神经元高表达 shakB36。这些发现促使我们采用 shakB 基因敲低和标记策略作为测试案例，以评估该实验方案是否能够对遗传学定义的神经元类型中特定的分子扰动在 RNA 和蛋白质水平上进行定量分析。
我们首先利用HCR-smFISH结合ShakB抗体染色，在巨纤维（GF）和LC4神经元中评估了shakB基因敲低的效率。每半脑一个的巨纤维（GF）神经元通过膜标记物进行标记（图4A）。每半脑约60个的LC4神经元群体则使用核标记物进行标记，以便进行群体水平的定量分析（图4B）。在对照组脑组织中，shakB转录本在GF和LC4神经元中均能明显检测到。表达shakB RNAi后，两种靶向神经元细胞类型中的shakB mRNA斑点显著减少（图4C–D）。与RNA干扰作用主要发生在细胞质中的特性一致，转录本的减少主要集中在细胞质区域。利用基于FlySeg的定量方法对核内和细胞质内的斑点进行区分后发现，在LC4神经元群体中，细胞质内的shakB转录本呈现选择性减少，而核内斑点受影响程度明显较小（图4D，分别减少69%与22%）。
我们发现ShakB抗体染色定位于GF树突与巨联合中间神经元（GCI）轴突重叠的区域，GCI连接两侧的巨纤维，介导对侧视觉反应37（图4E）。这些观察结果与先前研究一致35，表明GF与GCI之间存在ShakB依赖性的电耦合。在LC4轴突与GF树突接触的区域也观察到ShakB抗体染色信号，尽管该区域的定位分辨率较低。无论其确切的亚细胞定位如何，在表达RNAi后，与GF树突区域相关的ShakB抗体信号显著减少（图4F）。
然而，基于抗体的检测方法无法明确区分ShakB蛋白是定位于突触前LC4神经元末端还是突触后GF树突在接触位点的分布。此外，shakB在整个视觉系统中广泛表达34,36，这限制了利用抗ShakB免疫染色对LC4神经元中细胞类型特异性ShakB蛋白的定量分析。为了克服这些局限性并直接评估细胞类型特异性的ShakB定位，我们采用了先前构建的内源性标记shakB等位基因36,38。该方法实现了在LC4神经元中特异性可视化ShakB蛋白。SmGdP-10×V5标记的ShakB在树突（对应于上游视觉神经元的输入区域）和与GF树突形成接触的轴突末端中均有富集（图4G）。表达shakB RNAi后，树突和轴突区室中的V5信号几乎完全消失（图4H）。这些结果表明，该方案能够在神经纤维网密集的区域实现内源性蛋白在特定细胞类型及亚细胞水平上的精确定位。
作为额外的定性对照，我们在已鉴定的神经元群体中测试了未扩增的FISH与免疫组织化学相结合的方法（补充图1）。来自grd的FISH信号与LC22细胞体重叠，这与视叶单细胞RNA测序数据预测的表达模式一致（补充图1A–C）13。在表达tdTomato的Tm3神经元中，tdTomato mRNA信号与tdTomato蛋白信号重叠，而VGlut1 mRNA信号不与Tm3细胞体重叠，这与Tm3神经元的胆碱能特性相符（补充图1）13。这些实例表明，未扩增的FISH结合IHC足以用于定性判断目标分子的存在与否，而要实现可靠的单点信号定量，则需要进行扩增处理。
成功实施本方案的标志包括清晰的细胞类型特异性标记、背景信号低且界限分明的单分子FISH（smFISH）点状信号、对单个细胞核或手动定义的细胞体积进行可靠分割，以及在干预后目标RNA或蛋白信号的一致性降低。阴性或低信号结果也应可解释：例如，shakB RNAi导致shakB mRNA和ShakB蛋白信号减少，而在非膨胀FISH实验中，尽管可清晰检测到tdTomato mRNA，Tm3细胞体中却未检测到VGlut1信号。次优结果包括抗体或smFISH信号弱、背景点状信号高、分割不完整、点状信号错配或成像过程中样本漂移，这些均可能影响后续定量分析。
图2使用光片显微镜和共聚焦显微镜平台对扩增样品进行装载与成像。（A） 所有成像平台通用的膨胀水凝胶的可视化与修剪（1–2），随后进行光片显微镜成像的样品装载（3–4；Zeiss Lightsheet 7）。 （B） 倒置激光扫描共聚焦显微镜（Nikon Ti2-E AXR）上装载的扩展样品照片。 (C) 代表性单个光学切片（单个Z平面）的扩展图像 果蝇 视觉系统样本（用荧光核标记物标记的LC4神经元）检测 shakB mRNA（参见 图4），在三个成像平台上获取。比例尺，10 µm（扩增后组织）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3使用FlySeg对smFISH信号点进行定量分析。（A） FlySeg分析工作流程的示意图，用于在已识别细胞内进行自动分割和 puncta 定量。 （B） 三维 Voronoi 分割图展示了 FlySeg 的核心分割逻辑。成像体积被划分为多个空间区域（每个区域以不同颜色显示），每个分区最多包含一个细胞核，从而确保单细胞的唯一分配。在每个 Voronoi 区域内，通过一种基于细胞核及周围细胞质强度值的函数优化方法，对细胞核进行分割，以确定最优的细胞核表面。 (C) 展示 --nuclei_dilation 选项以区分核内与细胞质转录本 单个光学切片显示一个由smFISH点状信号环绕的GFP标记细胞核，经DNase处理后，弥散的DAPI信号勾勒出细胞质区域。线条分别指示0和0.5的膨胀因子，对应于细胞核和细胞质体积。 (D) (C) 的最大强度投影，显示斑点定位于细胞核和细胞质区室中。比例尺，10 µm（扩增后组织）。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4．利用RNAi介导的分子扰动验证定量工作流程（A） 巨大纤维（GF）胞体的光片显微投影图像（厚度为10 µm，未覆盖完整细胞体积），使用膜标记物标记，并在对照组（上）和shakB RNAi（下）条件下检测shakB mRNA。绿色虚线轮廓表示胞体边界，以突出细胞质mRNA池减少而细胞核内mRNA未减少的现象。n，脑组织样本（每只动物取一侧）。（B） 与（A）相同，但针对使用核标记物标记的LC4神经元。（C） 在对照组和shakB RNAi条件下，GF神经元中shakB FISH斑点的定量分析（合并核内与细胞质中的mRNA信号）。每个点代表一个单独的神经元（每只脑组织样本一个神经元，每只动物取一侧）。（D） 与（C）相同，但针对LC4神经元。每个点代表一个脑组织样本（每只动物取一侧；每个细胞的斑点计数在脑组织水平上取平均值）。（E） 使用膜标记物标记的GF树突在对照组（上）和shakB RNAi（下）条件下的共聚焦显微投影图像，并对ShakB进行免疫染色。（F） 在对照组和GF>shakB RNAi条件下，通过测量GF树突中ShakB蛋白的平均荧光强度来定量其蛋白水平。n，脑组织样本（每只动物取一侧）。（G） 使用膜标记物标记的LC4神经元，在对照组（上）和shakB RNAi条件（下）下表达smGdP-10xV5标签的ShakB蛋白。绿色虚线轮廓表示用于评估ShakB-V5密度的LC4树突及轴突末端区域。（H） 在对照组和LC4 > shakB RNAi条件下，通过测量LC4树突和轴突末端的平均荧光强度来定量ShakB-smGdP-V5蛋白水平。n，脑组织样本（每只动物取一侧）。误差线表示均值±标准误（SEM）。所有统计学比较均采用双尾Welch t检验。比例尺：所有图像中为10 µm（扩增后组织）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本方案结合扩增辅助的HCR-smFISH、扩增前免疫组织化学以及基于分割的转录本定量，实现在同一遗传定义的神经元中匹配的RNA与蛋白质测量。通过将这些组分整合到单一工作流程中，该方法将有助于在完整的黑腹果蝇（Drosophila）脑组织中进行定量的、细胞类型特异性的分子分析。
此处引入的若干实用改进措施是将免疫组织化学与扩增辅助的 HCR-smFISH 相结合的关键步骤 果蝇 脑24首先，免疫组织化学应在组织扩增和smFISH之前进行。由于本方案包含蛋白酶K消化步骤，在扩增后进行免疫组织化学可能降低表位的完整性。重要的是，若采用RNase清洁技术并结合共价RNA锚定，扩增前的抗体孵育（24小时一抗 + 24小时二抗）不会明显降低RNA信号强度。其次，应提高一抗和二抗的浓度，通常为2–3倍× 相较于标准的整体免疫组织化学染色，需增加一抗和二抗的孵育浓度，以补偿因蛋白酶K消化和组织扩张导致的信号损失。第三，固定条件对于同时保留蛋白质和RNA信号至关重要。无酸乙二醛固定可增强突触蛋白点状定位的保存，维持神经元突起的结构完整性，且不影响mRNA点状信号的定量检测。我们还发现，RNA与蛋白质的同时锚定可兼容后续的HCR-smFISH与免疫荧光检测。上述优化措施共同提升了免疫组织化学与扩增辅助转录本检测之间的兼容性。
扩增技术仅增加一个过夜步骤，技术上并不复杂，但其使用取决于实验目的。如文中所示 补充材料 图1，对于评估某个基因是否在特定细胞类型中表达，采用非扩增的荧光原位杂交结合免疫组织化学方法已足够；而当需要可靠地分辨单个smFISH信号点、将其分配至单个细胞胞体并进行定量分析时，则必须进行组织扩增，因为扩增可显著提高有效空间分辨率。同理，Terasaki型多孔板并非严格必需，但其可减少试剂用量，支持多种条件并行处理，并有助于在小批量样本中维持样品身份识别；当试剂体积限制较小时，也可使用标准微量离心管。尽管光片显微镜能够实现扩增组织的快速三维成像，但我们证明，标准的倒置激光扫描共聚焦显微镜和转盘共聚焦显微系统同样足以完成对扩增后特定神经元群体的全面成像 果蝇 脑。共聚焦显微镜的一个常见限制是工作距离较短。然而，由于果蝇脑体积较小，且样品经膨胀处理后大约扩大了2× 在 PBS 中，长工作距离水浸物镜可提供足够的穿透深度。进行定量比较时，应保持各样本间的成像参数一致，避免像素饱和，并确保体素尺寸足以分辨单个 smFISH 点状信号。这使得无专用光片成像仪器的实验室也能便捷地应用该方案。
更新后的 FlySeg 实现基于先前发表的 FlySeg 框架，并为本实验方案引入了两项主要改进。首先，新增可配置的核膨胀参数，可根据 smFISH 点状信号与分割出的细胞核之间的空间关系，将其分类为核内或细胞质信号。此步骤依赖于 DNase 处理后的细胞质 DAPI 染色，该染色提供弥散性信号以勾勒细胞体轮廓，有助于实现可靠的细胞核分割，从而支持核内与细胞质转录本的区分。其次，系统引入自动异常值检测功能，可识别分割质量较差的细胞核，并在后续定量分析中将其排除。除了用于评估细胞类型特异性基因敲低的分子效应外，区分核内与细胞质转录本在转录本定位反映活跃转录状态的情况下也具有重要信息价值。在哺乳动物大脑中，神经活动诱导的即刻早期基因转录本首先出现在细胞核内，随后在 mRNA 加工和输出过程中逐渐在细胞质中积累。39，一种在catFISH中使用的原则40 神经元激活时间的分析。在神经元中是否发生类似的转录动态变化。 果蝇 目前尚不清楚脑内的具体情况，但原则上可利用本实验流程进行探索。在其他任何脉冲-追踪实验中，区分细胞核与细胞质中的点状信号可提供超越总转录本计数的时间信息。同时，该流程不仅限于细胞核分割，也可调整用于全胞体（即由膜界定）的细胞分割。当前的定量流程针对神经元胞体进行了优化；尽管可以对神经 Neuropil 区域成像，但将 mRNA 点状信号定量分配至单个轴突或树突则需要额外的区室特异性分割策略。FlySeg 在需要群体水平统计的密集神经元群体中，最适用于自动化、高通量的定量分析。对于可单独识别的神经元或手动定义的区室，其他工具如 Imaris 或 FIJI/ImageJ 可能更为合适。下文总结了这些定量策略，包括其主要应用、优势与局限性。 补充表 1.
常见问题及解决方案包括抗体信号弱、smFISH背景高、凝胶损伤或样品丢失、成像过程中样品漂移以及分割效果差。抗体信号弱通常可通过进一步提高抗体浓度，或将一抗和/或二抗孵育时间从24小时延长至48小时来改善。smFISH背景高通常可通过延长杂交后洗涤步骤，并避免使用饱和的成像参数设置来降低。使用宽口吸头、以直线切割方式修整凝胶，以及切开排气通道以防止灌注腔室时产生气泡，可最大限度减少凝胶损伤和样品丢失。为减少成像过程中的样品漂移，建议将固定好的凝胶在成像前至少平衡1小时；若漂移仍存在，可将平衡时间延长至2小时或更久。分割效果差可能源于细胞质DAPI染色较弱或样品平衡不充分，这可能导致细胞边界信号减弱或在成像过程中出现X-Y-Z方向的位移；在调整FlySeg参数前应先检查上述因素。本方案中，凝胶始终保存在1× PBS，得到约2× 各向同性膨胀。如果需要更高的空间分辨率，可在稀释的PBS或去离子水中实现更大的膨胀。相反，当目标仅是评估特定细胞类型中基因表达的有无时，结合免疫组织化学的非膨胀FISH可能已足够，如所示 补充图1该方案仍可与迭代FISH工作流程兼容。通过DNase处理可去除探针和HCR发夹结构，从而在同一标本中进行多轮杂交与扩增。未来的技术拓展可能包括更高重的迭代HCR-smFISH、跨成像轮次的自动图像配准、更优的全细胞或神经突分割方法，以及用于跨实验比较RNA与蛋白信号的更标准化分析流程。进一步发展细胞区室特异性的分割策略，可将定量分析范围从神经元胞体扩展至轴突和树突。综上，该工作流程具备RNA与蛋白联合检测、区室分辨的转录本定量能力，并兼容常规成像平台，适用于在完整果蝇大脑中对遗传定义的神经元开展靶向性分子验证实验 果蝇 脑
致谢
我们感谢布卢明顿果蝇资源中心（美国国立卫生研究院 P40OD018537）提供果蝇品系。我们感谢Georg Ammer慷慨分享ShakB抗体。我们感谢Mark Eddison分享初始EASI-FISH实验方案的详细信息 果蝇 脑。本工作由NEI K99EY036123（资助对象：M.D.）、NEI K99EY036889（资助对象：G.F.）和NIH S10OD011102（资助对象：J.O.）资助。插图 使用 BioRender 制作。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10N 氢氧化钠溶液 | Fisher Scientific | 货号 SS255-1 | |
| 1N 氢氧化钠溶液 | Fisher Scientific | 货号 SS266-1 | |
| 20X 盐水-柠檬酸钠缓冲液 | Invitrogen | 货号 AM9763 | |
| 4-羟基-TEMPO | Sigma-Aldrich | 货号 176141 | |
| 5M 氯化钠溶液 | Sigma-Aldrich | 货号 S5150 | |
| 丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | 货号 A9099 | |
| 丙烯酸 | Sigma-Aldrich | 货号 147230 | |
| Acryloyl-X, SE | Invitrogen | 货号 A20770 | |
| Adobe Illustrator | Adobe | N/A | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗鸡（1:200） | 杰克逊免疫研究实验室 | 货号：103-545-155，RRID:AB_2337390 | |
| Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG1（1:200） | Invitrogen | 货号 A-21124，RRID:AB_2535766 | |
| Alexa Fluor 568 山羊抗兔 IgG1（1:200） | Invitrogen | 货号 A-11011，RRID:AB_143157 | |
| 过硫酸铵 | Sigma-Aldrich | 货号 A3678 | |
| 无水DMSO | Sigma-Aldrich | 货号 900645-4X2ML | |
| Bondic 紫外固化胶 | 邦迪克 | Bondic 起始套装 | |
| cellSens 成像软件 v4.4.1 | Evident Scientific | N/A | |
| 鸡多克隆抗GFP抗体（1:400） | Abcam | 货号 ab13970，RRID:AB_300798 | |
| Conda（环境管理器） | Anaconda, Inc | N/A | |
| 康宁™ 磨砂显微镜载玻片 | 康宁 | 货号 2948-75X25 | |
| 定制设计的LS7样品架 | 珍利亚技术 | ID 2021-021 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | 货号 D9542 | |
| 一次性无菌不锈钢手术刀 | MedPride | MPR-47101 | |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma-Aldrich | 货号 EDS-100G | |
| Fiji（ImageJ）图像分析软件 v2.14.0 | ImageJ 联盟 | N/A | |
| FlySeg（自定义流程） | https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH | N/A | |
| GAF固定液 | Addax Biosciences | 货号 VI25 | |
| GenClone® 24孔细胞培养板，未处理 | Genesee Scientific | 货号 25-102 | |
| GMR-86D05-Gal4（LC4） | 布卢明顿果蝇资源中心 | #41315 | |
| 山羊血清供体群 | Sigma-Aldrich | 货号 G6767 | |
| HCR™ RNA-FISH（v3.0）扩增缓冲液 | 分子工具 | N/A | |
| HCR™ RNA-FISH（v3.0）扩增子：AF546，JF669 | 分子仪器 | N/A | |
| HCR™ RNA-FISH（v3.0）探针杂交缓冲液 | 分子仪器 | N/A | |
| HCR™ RNA-FISH（v3.0）探针洗涤缓冲液 | 分子仪器 | N/A | |
| HCR™ RNA-FISH（v3.0）ShakB 探针 | 分子仪器 | N/A | |
| Imaris 10.1 | Oxford Instruments | N/A | |
| IXPlore IX85 SpinSR 转盘共聚焦显微镜 | Evident Scientific | N/A | |
| LS7 光片显微镜 | 卡尔·蔡司 | N/A | |
| 美法仑 | Cayman Chemical | 货号 16665 | |
| MOPS 缓冲液 | Fisher Scientific | 货号 BP308-100 | |
| 小鼠单克隆抗V5（SV5-Pk1）（1:100） | Abcam | 货号 ab27671，RRID:AB_471093 | |
| N,N,N’，N’四甲基乙二胺 | Sigma-Aldrich | 货号 T7024 | |
| N,N’- 甲叉双丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | 货号 M7279 | |
| Napari | 开源社区 | N/A | |
| NIS-Elements Advanced Research 成像软件 | 尼康公司 | N/A | |
| 无核酸酶水 | Qiagen | 货号 129114 | |
| Nunc™ 带有 Nunclon 的 MiniTrays™ Delta 表面 | Invitrogen | 货号 163118 | |
| PBS（10倍浓度），pH 7.4 | Gibco | 货号# 70011044 | |
| Photo-Flo 洗涤剂 | 电子显微镜科学公司 | 货号 74257 | |
| 聚-L-赖氨酸溶液 | Ted Pella | 货号 18026 | |
| 精密盖玻片，#1.5H 厚度 | Thorlabs | 货号 CG15CH2 | |
| 按压密封™ 带粘合剂硅胶隔离器，单孔，直径20 mm，深度0.5 mm | Invitrogen | 货号 P24740 | |
| 蛋白酶K | 新英格兰 Biolabs | 货号 P8107S | |
| 兔抗ShakB抗体（1:400） | Geord Ammer 惠赠 | N/A | |
| RNase AWAY™ 表面去污剂 | Invitrogen | 货号 7002 | |
| RNase-Free DNase 试剂盒 | Qiagen | 货号 79256 | |
| 施耐德’果蝇培养基 | Gibco | 货号 21720001 | |
| shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;; | Frighetto 等，2025 | PMID: 41278920 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | 货号 S8032 | |
| Stemi 508 体视显微镜 | 卡尔·蔡司 | N/A | |
| SYTO™ 41 蓝色荧光核酸染料 | Invitrogen | 货号 S11352 | |
| Ti2E AXR NSPARC激光扫描共聚焦显微镜 | 尼康公司 | N/A | |
| Tris碱 | Fisher Scientific | 货号 BP152-500 | |
| Triton™ X-100 | Sigma-Aldrich | 货号 T8787 | |
| UAS-GFP-2A-KDR | Sanfilippo 等，2024 | PMID: 38262414 | |
| UAS-his2A-GFP； | Dombrovski 等，2025 | PMID: 40468081 | |
| UAS-mCherry RNAi | 布卢明顿果蝇资源中心 | #35785 | |
| UAS-myr::GFP | 布卢明顿果蝇资源中心 | #32198 | |
| UAS-shakB RNAi | Ammer 等，2022 | PMID: 35385694 | |
| UltraPure™ 1 M Tris-HCl，pH 8.0 | Invitrogen | 货号 15568025 | |
| VT042336-Gal4（巨纤维） | Dombrovski 等，2025 | PMID: 40468081 | |
| Zen Black 3.1 | 卡尔·蔡司 | N/A |