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方法文章

整合机器学习方法探究糖基化相关基因在特发性肺纤维化中的作用

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DOI：

10.3791/71408

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2026年7月31日

 ,  ,  , 
1Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Jinan University, 2Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University

通讯作者： Zhijun Li <lizhijun@gou.edu.pl>

本文内容

摘要

本研究采用整合转录组分析、机器学习（LASSO、SVM-RFE 和 XGBoost）、免疫浸润分析、分子对接以及 RT-qPCR 验证，筛选出与特发性肺纤维化相关的糖基化相关基因。共鉴定出十个候选诊断基因，并在肺组织数据集中构建和验证了一个性能优异的诊断模型。

摘要

特发性肺纤维化（IPF）是一种病因未明的进行性慢性肺部疾病，糖基化相关基因（GRGs）在其发病机制中的作用尚不明确。本研究聚焦于阐明GRGs在IPF中的潜在作用机制，鉴定关键生物标志物，并利用生物信息学与机器学习构建诊断模型。通过整合来自GEO数据库的转录组数据与GRGs，探讨其在IPF中的功能作用。鉴定差异表达基因（DEGs）后，进行功能富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析。采用结合LASSO回归、支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）和XGBoost的机器学习流程，在GSE150910训练数据集中筛选关键基因并构建诊断模型。随后在四个独立的验证数据集中评估模型性能。进一步开展基因集富集分析（GSEA）、免疫浸润分析、药物-基因相互作用分析、分子对接分析，以及利用IPF患者与健康对照者的外周血样本进行RT-qPCR验证，以探究所鉴定基因的生物学意义。共鉴定出126个与糖基化相关的差异表达基因，筛选出10个关键基因。该诊断模型在肺组织数据集上的曲线下面积（AUC）分别为0.963和0.814，在血液数据集上的AUC分别为0.681和0.706。免疫浸润分析显示不同患者亚组间B细胞丰度存在差异，RT-qPCR验证证实了所选基因在临床样本中的差异表达。这些发现揭示了GRGs可能参与IPF的病理过程，支持其作为候选诊断基因的潜在价值。

引言

特发性肺纤维化（IPF）是一种进行性、纤维化的间质性肺疾病，其病理发生具有异质性，涉及遗传易感性、环境诱因以及免疫功能障碍1,2。该疾病在临床上面临重大挑战，主要由于早期诊断困难、治疗效果有限以及总体预后较差。IPF 的患病率约为每 10 万人中 20 至 80 例，若不进行治疗，确诊后的中位生存期通常为 3–5 年3,4。识别出疾病快速进展高风险患者对于制定有效的治疗策略至关重要，有助于对最可能经历病情恶化的患者实施靶向治疗。

糖基化是一种蛋白质的共翻译和翻译后修饰过程，在调控蛋白质活性和细胞生物学功能中起着关键作用5,6。蛋白质糖基化的失调可能参与特发性肺纤维化（IPF）的进展7,8。在许多风湿性疾病中，可观察到蛋白质糖基化的改变，这些改变与炎症过程及疾病进展密切相关9。例如，Lyu 等人发现 CRLF1 和 GLG1 是骨关节炎病理过程中的关键分子10。此外，糖基化还被发现参与肺组织中免疫细胞的活化，进一步将其与肺部疾病的发病机制联系起来11。鉴于此，蛋白质糖基化的失调也可能促进 IPF 的进展。然而，糖基化相关基因（GRGs）在 IPF 中的作用仍缺乏深入研究，其在 IPF 诊断中的潜在价值有待进一步探讨。

本研究整合了机器学习方法与RNA测序数据，旨在鉴定与特发性肺纤维化（IPF）相关的关键缺氧相关基因（GRGs）。既往针对IPF的研究通常依赖传统的差异表达分析或单一的机器学习算法，这可能限制候选生物标志物的稳健性与普适性12,13。为克服这些局限性，我们采用了一种多步骤计算流程，将差异表达分析与多种机器学习算法（包括LASSO、SVM-RFE和XGBoost）相结合，以提高特征筛选的可靠性。此外，诊断模型在多个独立数据集中进行了评估，关键结果还通过临床样本进一步验证。随后构建并验证了诊断模型，并分析了免疫浸润特征。同时，探讨了与所鉴定基因相关的免疫微环境及潜在的分子相互作用。尽管本研究聚焦于IPF，但所采用的分析策略可能适用于其他慢性肺部疾病及转录组数据集，为关键基因的识别与验证提供可重复的研究框架。具体流程见图1。

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方案

本研究经蚌埠医学院第一附属医院伦理审查委员会批准（批准号：2023YJS162）。在样本采集前，已从所有参与者处获得书面知情同意书。

数据收集

本研究使用的转录组数据来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/；RRID: SCR_005012）。主要训练数据集GSE150910使用Illumina NovaSeq 6000平台（GPL24676）生成，包含103例特发性肺纤维化（IPF）样本和103例正常肺组织样本。为验证研究结果，采用了独立的数据集GSE24206、GSE110147、GSE93606和GSE38958。各数据集的详细信息见表1。此外，共从先前发表的一项研究中选取了636个谷胱甘肽相关基因（GRGs）14。

糖基化相关差异表达基因的差异表达分析及功能表征

使用 R 软件包 DESeq2（RRID: SCR_015687）对来自 GSE150910 数据集的特发性肺纤维化（IPF）与正常肺组织样本进行了差异表达分析。筛选标准为：调整后 P 值（padj）< 0.05 且 |log2FoldChange| > 0.5 的基因被定义为差异表达基因（DEGs）。通过将差异表达基因与预先定义的 636 个糖基化相关基因（GRGs）集合取交集，鉴定出糖基化相关差异表达基因（GR-DEGs）。为进一步探究这些基因的生物学功能，开展了基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，以阐明其功能角色及参与的信号通路。利用 STRING 数据库（RRID: SCR_005223）15 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，设定相互作用置信度评分阈值为 > 0.7，以揭示 GR-DEGs 在 IPF 中的分子相互作用关系及潜在调控机制。

关键基因筛选及诊断模型构建 

为了从GR-DEGs中筛选特发性肺纤维化（IPF）的关键基因，我们采用了多种机器学习算法。首先，采用二元逻辑回归（family = “binomial”）拟合LASSO回归（RRID: SCR_003418），并通过10折交叉验证（nfold = 10）选择最优惩罚参数λ。最终筛选结果为对应于λ_(min)（0.01700442）且系数非零的特征。对于支持向量机递归特征消除（SVM-RFE），使用R语言caret包中的rfe函数，通过10折交叉验证（method = “cv”，number = 10）进行递归特征消除，逐步筛选从1到126个特征，并以准确率确定最优特征子集。在XGBoost模型中，目标函数设为二元逻辑回归（objective = “binary: logistic”），评估指标设为对数损失（eval_metric = “logloss”），迭代次数（nrounds）设为100，学习率（eta）设为0.1。根据特征重要性得分（Gain）选取前20个基因。通过整合上述方法的结果，确定了一组精炼的关键基因。基于该基因集合，使用训练数据集（GSE150910）构建XGBoost诊断模型，并在外部验证数据集（GSE110147、GSE24206、GSE93606和GSE38958）上通过受试者工作特征（ROC）分析评估其预测性能。此外，构建列线图以可视化各选定基因对疾病概率的贡献，并通过校准曲线和决策曲线分析（DCA）进一步评估模型的临床实用性。

关键基因生物学通路的探索

为了探究机器学习所鉴定的关键基因的生物学背景，基于分子特征数据库（Molecular Signatures Database, MSigDB）（RRID: SCR_016863）17中的基因列表进行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）16，并筛选归一化富集得分（NES）> 1 的通路。使用 enrichplot 函数对最显著富集的通路进行可视化。

基于关键基因评分探讨特发性肺纤维化亚型的生物学功能与免疫微环境差异

根据鉴定出的关键基因的表达谱，计算单样本基因集富集分析（ssGSEA）得分，并依据中位数得分将特发性肺纤维化（IPF）患者分为高分组和低分组。对两组间进行差异表达分析，随后采用GSEA（RRID: SCR_003199）18 对差异表达基因（DEGs）进行GO生物学过程（GOBP）和KEGG通路富集分析。

免疫细胞浸润与关键基因表达差异分析

基于ssGSEA评分对亚组进行分层后，评估了高分组与低分组之间的免疫浸润差异。首先，我们使用CIBERSORT算法（RRID: SCR_016955）19结合LM22特征矩阵，计算样本中22种免疫细胞类型的相对丰度。具体而言，采用R软件包IOBR中的deconv_tme函数（参数：method = “cibersort”，arrays = FALSE，perm = 200）进行计算，并利用ggpubr软件包（RRID: SCR_021139）生成箱线图，以评估高分组与低分组之间免疫细胞浸润的差异。此外，使用R软件包GSVA中的gsva函数（采用ssGSEA方法）计算28种免疫细胞类型的富集评分。随后，采用Min-Max归一化方法将这些评分标准化至[0, 1]区间，以便在不同细胞类型间进行比较。最后，对GSE150910和GSE110147数据集中正常样本与特发性肺纤维化（IPF）患者的关键基因表达水平进行Wilcoxon秩和检验，从而全面分析IPF不同亚组间免疫细胞浸润及基因表达的差异。

利用 RT-qPCR 分析验证 IPF 患者中的关键基因

为验证所鉴定基因的诊断相关性，从XGBoost算法中选取重要性评分最高的六个基因，利用逆转录定量PCR（RT-qPCR）在特发性肺纤维化（IPF）患者和健康对照者中进行表达水平验证。共收集了20份血液样本，包括来自蚌埠医学院第一附属医院的9名IPF患者和11名健康个体的样本。从血液样本中提取总RNA，并使用多功能酶标仪测定RNA浓度。在进行下游分析前评估RNA质量。在逆转录过程中去除基因组DNA，RT-qPCR所用引物序列见表2。通过熔解曲线分析验证引物特异性。以GAPDH作为内参基因。采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达水平。该验证步骤为所鉴定基因在IPF中的差异表达及其潜在诊断价值提供了初步实验支持。

统计分析

数据使用 R 软件进行分析，组间差异采用 Wilcoxon 检验检测。基因集富集分析（GSEA）以及 GO 和 KEGG 通路富集分析均使用 R 软件包 clusterProfiler（RRID: SCR_016884）完成。除非另有说明，否则以 p 值 < 0.05 为差异具有统计学意义。

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结果

GR-DEGs的功能分析与相互作用网络分析  

为研究基因在特发性肺纤维化（IPF）中的作用，对GSE150910数据集进行了差异表达分析，共鉴定出4,216个差异表达基因（DEGs）图2A）。通过将这些差异表达基因与636个糖基化相关基因取交集，筛选出126个疾病相关糖基化基因 鉴定图2B）。此外，为了评估交集基因潜在的生物学功能，我们进行了GO和KEGG富集分析。如（图2C），GO 富集分析揭示了 112 个显著性条目，包括 53 个生物过程（如糖蛋白代谢、蛋白质糖基化）、26 个细胞组分（如高尔基体腔、内质网腔）和 33 个分子功能（如糖基转移酶活性、UDP-糖基转移酶活性）。KEGG 分析筛选出 25 条富集通路，包括黏蛋白型 O-聚糖和 N-聚糖生物合成（图 2D

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讨论

特发性肺纤维化（IPF）是一种病因未明的慢性进行性疾病，显著降低患者的生活质量，并导致过早死亡4。尽管治疗策略已取得进展，但确诊后的中位生存期仍然较短，且IPF的发病机制尚未完全阐明22。因此，阐明IPF背后的分子机制具有紧迫性和重要性。既往研究已证实糖基化异常与肺部疾病之间存在关联。然而，糖基化在IPF发病机制中的潜在作用仍基本未被探索。因此，本研究首次将糖基化相关基因特征与机器学习方法相结合，用于IPF的诊断。这一创新性方法为识别关键基因提供了新视角，并可能有助于更深入理解IPF的病理生理机制。

近期研究通过整合转录组学和机器学习方法，已鉴定出与特发性肺纤维化（IPF）相关的内质网应激基因23,24,25。这些发现凸显了细胞应激反应在IPF发病机制中的重要性。鉴于蛋白质糖基化与内质网稳态之间的密切关...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢所有在研究过程中提供帮助和支持的同事。他们的合作与鼓励对我们的工作具有重要价值。本研究未获得外部资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
光标R 统计计算基金会版本 6.0.94SVM-RFE
ClusterProfilerR 统计计算基金会版本 4.12.6GSEA、GO 和 KEGG 富集分析
DESeq2R 统计计算基金会版本 1.44.0差异表达分析
快速第一链 cDNA 合成预混液Goonie Biotech Co., Ltd.500-101用于RT-qPCR的cDNA合成
FastTaq qPCR SYBR Green Master MixGooniebio500-102定量 PCR 扩增
荧光定量PCR系统伯乐生命科学公司CFX96定量PCR扩增
GEO数据库NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/转录组数据来源
ggpubr R 统计计算基金会版本 0.6.0箱线图生成
GSVAR 统计计算基金会版本 1.52.3ssGSEA
MSigDB布罗德研究所https://www.gsea-msigdb.org/GSEA 分析
PCR系统伯乐生命科学公司PTC Tempo用于RT-qPCR的cDNA合成
引物Tsingke 生物技术有限公司N/A定制合成 qPCR 引物
R 软件R 统计计算基金会版本 4.4.1统计分析与可视化
RNA Isolater 总RNA提取试剂Vazyme Biotech Co., Ltd.R401-01从全血中提取总RNA
STRING 数据库STRING 联盟https://string-db.org/PPI 网络构建
Synergy HTX 多功能微孔板检测仪BioTek Instruments, Inc.Synergy HTXRNA浓度测定

参考文献

  1. Koudstaal T, Wijsenbeek MS. Idiopathic pulmonary fibrosis. Presse Med. 2023;52(3):104166.
  2. Moss BJ, Ryter SW, Rosas IO. Pathogenic Mechanisms Underlying Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Annu Rev Pathol. 2022;17:515-46.
  3. Bonella F, Spagnolo P, Ryerson C. Current and Future Treatment Landscape for Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Drugs. 2023;83(17):1581-93.
  4. Spagnolo P, et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Disease mechanisms and drug development. Pharmacol Ther. 2021;222:107798.
  5. Schjoldager KT, Narimatsu Y, Joshi HJ, Clausen H. Global view of human protein glycosylation pathways and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(12):729-49.
  6. He M, Zhou X, Wang X. Glycosylation: mechanisms, biological functions and clinical implications. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):194.
  7. Xie X, Kong S, Cao W. Targeting protein glycosylation to regulate inflammation in the respiratory tract: novel diagnostic and therapeutic candidates for chronic respiratory diseases. Front Immunol. 2023;14:1168023.
  8. Shi X, et al. Secreted RCN3 acts as an early epithelial-fibroblast mediator via TGFβR1-Smad signaling in post-ALI pulmonary fibrosis. Cell Commun Signal. 2026;24(1).
  9. Kissel T, Toes REM, Huizinga TWJ, Wuhrer M. Glycobiology of rheumatic diseases. Nat Rev Rheumatol. 2023;19(1):28-43.
  10. Lyu Y, et al. Identification of proteins and N-glycosylation sites of knee cartilage in Kashin-Beck disease compared with osteoarthritis. Int J Biol Macromol. 2022;210:128-38.
  11. Komaromy A, Reider B, Jarvas G, Guttman A. Glycoprotein biomarkers and analysis in chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer with special focus on serum immunoglobulin G. Clin Chim Acta. 2020;506:204-13.
  12. Ruan H, Ren C. Integrating machine learning with bioinformatics for predicting idiopathic pulmonary fibrosis prognosis: developing an individualized clinical prediction tool. Exp Biol Med (Maywood). 2024;249:10215.
  13. Wang L, et al. Serum Proteomics Identifies Biomarkers Associated With the Pathogenesis of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Mol Cell Proteomics. 2023;22(4):100524.
  14. Shi Y, et al. Glycosylation-related molecular subtypes and risk score of hepatocellular carcinoma: Novel insights to clinical decision-making. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:1090324.
  15. Szklarczyk D, et al. The STRING database in 2023: protein-protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 2023;51(D1):D638-d46.
  16. Yan S, et al. Identification of ITGAX and CCR1 as potential biomarkers of atherosclerosis via Gene Set Enrichment Analysis. J Int Med Res. 2022;50(3):3000605211039480.
  17. Wang T, He Q, Chan KHK. A Multi-omics approach to identify and validate shared genetic architecture in rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, and type 1 diabetes: integrating GWAS, GEO, MSigDB, and scRNA-seq data. Funct Integr Genomics. 2025;25(1):91.
  18. Lu Y, Lu D, Li C, Chen L. Exploring Immune Cell Infiltration and Small Molecule Compounds for Ulcerative Colitis Treatment. Genes (Basel). 2024;15(12).
  19. Guan M, Jiao Y, Zhou L. Immune Infiltration Analysis with the CIBERSORT Method in Lung Cancer. Dis Markers. 2022;2022:3186427.
  20. Roy D, Ramasamy R, Schmidt AM. Journey to a Receptor for Advanced Glycation End Products Connection in Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Infection: With Stops Along the Way in the Lung, Heart, Blood Vessels, and Adipose Tissue. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2021;41(2):614-27.
  21. Li Z, Yang P, Feng B. Effect of atorvastatin on AGEs-induced injury of cerebral cortex via inhibiting NADPH oxidase -NF-κB pathway in ApoE(-/-) mice. Mol Biol Rep. 2020;47(12):9479-88.
  22. Liu GY, Budinger GRS, Dematte JE. Advances in the management of idiopathic pulmonary fibrosis and progressive pulmonary fibrosis. Bmj. 2022;377:e066354.
  23. Liao Y, et al. Integrating cellular experiments, single-cell sequencing, and machine learning to identify endoplasmic reticulum stress biomarkers in idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Med. 2024;56(1):2409352.
  24. Liu B, et al. A novel model for predicting prognosis in patients with idiopathic pulmonary fibrosis based on endoplasmic reticulum stress-related genes. Cell Biol Int. 2024;48(4):483-95.
  25. Zhu H, et al. Comprehensive analysis of an endoplasmic reticulum stress-related gene prediction model and immune infiltration in idiopathic pulmonary fibrosis. Front Immunol. 2023;14:1305025.
  26. Yeo HJ, et al. Development of a Novel Biomarker for the Progression of Idiopathic Pulmonary Fibrosis. Int J Mol Sci. 2024;25(1).
  27. Perkins TN, Oury TD. The perplexing role of RAGE in pulmonary fibrosis: causality or casualty? Ther Adv Respir Dis. 2021;15:17534666211016071.
  28. Dai J, et al. Construction of a lipid metabolism-related and immune-associated prognostic score for gastric cancer. BMC Medical Genomics. 2023;16(1):93.
  29. Li W, et al. An 11-gene glycosyltransferases-related model for the prognosis of patients with bladder urothelial carcinoma: development and validation based on TCGA and GEO datasets. Translational Andrology and Urology. 2024;13(12).
  30. Li SJ, et al. Identifying causal genes for migraine by integrating the proteome and transcriptome. J Headache Pain. 2023;24(1):111.
  31. Zhang W, et al. ANK2 as a novel predictive biomarker for immune checkpoint inhibitors and its correlation with antitumor immunity in lung adenocarcinoma. BMC Pulm Med. 2022;22(1):483.
  32. Burkhard T, et al. BS10 Characterising the degradome of the metalloprotease ADAMTS8: implications for pulmonary arterial hypertension. BMJ Publishing Group Ltd and British Cardiovascular Society; 2025.
  33. Lee HC, et al. The Therapeutic Potential of ADAMTS8 in Lung Adenocarcinoma without Targetable Therapy. J Pers Med. 2022;12(6).
  34. Bera T, Ghosh M, Ghosh SK. Elucidating the mycochemistry and anticancer efficacy of F5 fraction of ethanolic extract of Daldinia eschscholtzii. Scientific Reports. 2025;15(1):34953.
  35. Li F, et al. Construction and validation of a prognostic model for lung adenocarcinoma based on endoplasmic reticulum stress-related genes. Sci Rep. 2022;12(1):19857.
  36. Lin L, et al. Integrated profiling of endoplasmic reticulum stress-related DERL3 in the prognostic and immune features of lung adenocarcinoma. Front Immunol. 2022;13:906420.

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